響應(yīng)面優(yōu)化低共熔溶劑提取香榧外殼總黃酮研究

香榧屬紅豆杉科榧屬，為常綠喬木，其果實(shí)可以食用，而香榧?xì)ひ话阕鳛閺U棄物處理，造成資源浪費(fèi)。其實(shí)，香榧?xì)ぶ泻锌傸S酮等活性物質(zhì)，提取其中的活性物質(zhì)，可以解決香榧?xì)さ睦速M(fèi)問(wèn)題。近年來(lái)，低共熔溶劑提取成為了研究熱門(mén)，本研究分析了低共熔溶劑對(duì)香榧外殼總黃酮的提取效果，并優(yōu)化了提取工藝，最后得到最佳的提取工藝，為香榧?xì)ぶ锌傸S酮物質(zhì)的提取提供了借鑒。

1. 材料與設(shè)備

1.1 材料

香榧?xì)?，浙江省杭州市臨安市場(chǎng)提供；氯化膽堿，分析純，上海麥克林生化科技股份有限公司；1，2-丙二醇，分析純，薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑。

1.2 設(shè)備

水浴恒溫?cái)嚢杵?，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；電子天平，上海菁海儀器有限公司；高速中藥粉碎機(jī)，濟(jì)南億健醫(yī)療設(shè)備有限公司；超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海無(wú)析儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；THZ-92A汽浴恒溫振蕩器，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；HWS型恒溫恒濕箱，寧波東南儀器有限公司；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

2. 實(shí)驗(yàn)與方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱(chēng)取蘆丁10mg放入容量瓶中，加入75%乙醇溶液，置于超聲波清洗機(jī)中將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品超聲充分溶解，溶解后定容成濃度為0.4mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液_{Zh71Ag8YdZQgWAXXymXiuaq8msYXCJZaVS3YX8CwgYg=}并保存?zhèn)溆谩?/p>

分別量取上述0.4mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，放入5支試管中，同時(shí)取1支空白試管作為空白對(duì)照組。在6支試管中先加入5%NaNO2溶液0.15mL，靜置6min，再加入10%Al（NO3）3溶液0.15mL，靜置6min，最后加入4%NaOH溶液2mL以及適量去離子水，使最后總體積為5mL，緊接著振蕩搖勻，靜置3min。以空白試管作為對(duì)照，在波長(zhǎng)512nm下測(cè)定各個(gè)試管的吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，其中縱坐標(biāo)為吸光度，橫坐標(biāo)為蘆丁黃酮含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y=2.0379x-0.0175，相關(guān)系數(shù)R2為0.9965，線性擬合程度較好。

2.2 香榧?xì)た傸S酮提取

低共熔溶劑具有低成本、低揮發(fā)性、可生物降解性、易于制備及良好的生物相容性等優(yōu)勢(shì)，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)有機(jī)溶劑提取的缺點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)選取低共熔溶劑作為黃酮提取的提取溶劑，利用超聲輔助提取香榧?xì)た傸S酮。

香榧外殼提取流程是：將干燥過(guò)的香榧外殼粉碎至一定目數(shù)，按照液料比，將配制好的低共熔溶劑與香榧?xì)し勰┏浞只靹?，放置在超聲波清洗機(jī)上超聲提取一定時(shí)間。提取完畢后再將提取液利用離心機(jī)離心，去除大部分香榧?xì)し勰?，其中待測(cè)液為上清液。

量取上述待測(cè)液1mL進(jìn)行測(cè)定，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方式得到相應(yīng)的黃酮含量。提取率計(jì)算方法如下：

上式中：Y為總黃酮提取率，mgRt/g；C為溶液質(zhì)量濃度，mgRt/mL；V為提取液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為粉末質(zhì)量，g。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。自變量A、B、C依次為液料比、超聲時(shí)間、低共熔溶劑含水量，香榧?xì)た傸S酮提取率為響應(yīng)值，具體實(shí)驗(yàn)條件如表1所示。

3. 結(jié)果與討論

3.1 響應(yīng)面統(tǒng)計(jì)分析與模型擬合

選取粉碎度100目，低共熔溶劑為DES-1作為固定實(shí)驗(yàn)條件，然后對(duì)其他因素應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果如表2所示，回歸模型方差分析見(jiàn)表3，篩選出提取工藝最佳的方案。

根據(jù)上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以構(gòu)建出一個(gè)關(guān)于三個(gè)影響因素A、B、C與總黃酮提取率（Y）之間的多元回歸模型，所得到的方程如下：

Y=0.56-0.022A+0.00425B-0.012C-0.00275AB-0.00325AC+0.00025BC-0.13A2-0.20B2-0.13C2。

根據(jù)回歸模型方差分析結(jié)果，模型決定系數(shù)R2=0.9730，R2adj=0.9384，表明該模型的相關(guān)性較好，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間高度擬合，可信度較高。模型P值=0.0001（＜0.01），說(shuō)明該模型具有顯著性；失擬項(xiàng)P值=0.9435（＞0.05），不顯著，表明該模型擬合度較好。根據(jù)F值可知，三個(gè)影響因素對(duì)總黃酮提取率的影響從大到小依次為液料比＞含水量＞超聲時(shí)間。

3.2 響應(yīng)面分析

3D響應(yīng)曲面圖和等高線圖可以較好地描述自變量之間的交互作用，并反映出變量間的交互作用。通過(guò)觀察曲面的傾斜程度，可以確定兩個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度。3D響應(yīng)面圖傾斜程度增加，意味著該因素對(duì)香榧?xì)た傸S酮提取率的影響增強(qiáng)；橢圓形的等高線密集，表示兩個(gè)因素之間的相互作用更強(qiáng)。具體3D響應(yīng)面圖與等高線圖如圖2所示。

通過(guò)觀察三張3D響應(yīng)面圖可以得出，最大的響應(yīng)曲面傾斜度為液料比，因此，對(duì)香榧?xì)た傸S酮提取率影響較大的是液料比，與方差分析結(jié)果吻合。AC的響應(yīng)曲面較為平緩，等高線較為稀疏，說(shuō)明液料比與含水量的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著；AB、BC的響應(yīng)曲面較為陡峭，且等高線比較密集，圖形接近于橢圓形，說(shuō)明液料比與超聲時(shí)間（AB）、超聲時(shí)間與含水量（BC）的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著。

4. 結(jié)論

本文通過(guò)單因素試驗(yàn)得到不同因素對(duì)總黃酮提取率的影響，再進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，以獲得最優(yōu)提取工藝。試驗(yàn)結(jié)果顯示，最佳的提取工藝為：物料粉碎度為100目，氯化膽堿-甘油摩爾比為1：2，超聲提取時(shí)間為40min，氯化膽堿-甘油含水量為20%，液料比為19mL/g。

基金項(xiàng)目：2023年浙江省“尖兵”“領(lǐng)雁”研發(fā)攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（2023C02042）；2023年國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2023 MK165）。

作者簡(jiǎn)介：杜黎丹（1983-），女，漢族，浙江富陽(yáng)人，工程師，大學(xué)本科，研究方向?yàn)槭称贩治觥?/p>