本文采用超聲波協(xié)助酶法,對葛仙米類植物多糖進(jìn)行了研究,同時(shí)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化了葛仙米多糖的提取工藝,以期為葛仙米及其多糖成分的深入研究和開發(fā)提供一定的數(shù)據(jù)支撐。
1. 實(shí)驗(yàn)與方法
1.1 葡萄糖含量測定
在100mL容量瓶中加入10mg葡萄糖粉末,再加入蒸餾水至刻度線下1cm,靜置1min,然后用膠頭滴管緩慢補(bǔ)加蒸餾水,定容至刻度線,充分搖勻,靜置,得到0.1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL定量瓶中,并分別加入蒸餾水定容至2mL,同時(shí)直接加蒸餾水2mL于定量瓶中作為空白對照組。再加入5%苯酚溶液1mL,輕微振搖,使其與葡萄糖溶液混勻;用移液管吸取7mL濃硫酸,并將其沿試管壁緩慢加入,振搖,放置15min,冷卻至室溫。
利用紫外可見分光光度計(jì),在490nm波長下測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度,并進(jìn)行空白對照,繪制x軸為葡萄糖質(zhì)量濃度(μg/mL),y軸為吸光度(A)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
在490nm處測定的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的吸光度數(shù)值如表1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=0.0179x-0.0924,R2=0.9921,具體如圖1所示。葛仙米多糖的質(zhì)量濃度可依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。葛仙米多糖得率的計(jì)算公式如(1)所示。
(1)
該公式中,P為葛仙米多糖得率;C為溶液中葛仙米多糖的質(zhì)量濃度(mg/mL);V為溶液的體積(mL);F為多糖的稀釋倍數(shù);m為多糖樣品的質(zhì)量(mg)。
1.3 葛仙米多糖含量測定
量取200mL蒸餾水,與事先粉碎并篩好的葛仙米粉末混合置于250mL具塞錐形瓶中。將事先稱取的不同質(zhì)量的纖維素酶分別放置于20mL小燒杯中,依次加入少量蒸餾水,攪拌均勻。將溶液pH調(diào)為5,放入水浴鍋中50℃酶解30min。在改變超聲時(shí)間和超聲溫度的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),對不同超聲時(shí)間和超聲溫度條件下得到的樣品進(jìn)行編號,以作區(qū)分,并冷卻至室溫。利用離心機(jī)將液體與葛仙米固體顆粒進(jìn)行分離,轉(zhuǎn)速為8000r/15min,待機(jī)器完全停止后取出上清液。吸取1mL上清液放入小燒杯中,稀釋至6倍。將稀釋后的葛仙米多糖樣品用移液管移取至1-10mL定量瓶中,先后分別加入5%的苯酚溶液1mL。用移液管移取濃硫酸7mL,并將其沿瓶壁緩慢加入定量瓶中;用膠頭滴管移取少量蒸餾水定容至刻度線,振蕩搖勻,靜置15min,冷卻至室溫。通過紫外分光光度計(jì)測定葛仙米多糖溶液的吸光度,并將測出的數(shù)值帶入式(1)中,計(jì)算出葛仙米多糖得率。
1.4 單因素試驗(yàn)
1.4.1 纖維素酶的添加量。稱取粉碎后的葛仙米干品,放入250mL具塞錐形瓶中,量取200mL蒸餾水加入其中。固定超聲溫度為90℃、超聲時(shí)間為60min,控制纖維素酶的添加量,分別加入10、15、20、25、30mg于錐形瓶中,并根據(jù)所測吸光度得出相對情況下的葛仙米多糖得率。以纖維素酶的添加量(x)和葛仙米多糖得率(y)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,以直觀確定最佳條件。
1.4.2 超聲時(shí)間。稱取粉碎后的葛仙米干品,放入250mL具塞錐形瓶中,量取200mL蒸餾水加入其中。固定超聲溫度為90℃、纖維素酶的添加量為20mg,控制超聲時(shí)間,分別設(shè)置為30、60、90、120、150min,并根據(jù)所測吸光度得出相對情況下的葛仙米多糖得率。以超聲時(shí)間(x)和葛仙米多糖得率(y)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,以直觀確定最佳條件。
1.4.3 超聲溫度。稱取粉碎后的葛仙米干品,放入250mL具塞錐形瓶中,量取200mL蒸餾水加入其中。固定超聲時(shí)間為60min、纖維素酶的添加量為20mg,控制超聲溫度,分別設(shè)置為80、85、90、95、100℃,并根據(jù)所測吸光度得出相對情況下的葛仙米多糖得率。以超聲溫度(x)和葛仙米多糖得率(y)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,以直觀確定最佳條件。
1.5 Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)化葛仙米多糖提取工藝
本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)研究,選取的3個(gè)考察因素分別為纖維素酶的添加量(A)、超聲溫度(B)、超聲時(shí)間(C),編碼水平為-1、0、1,且響應(yīng)值為葛仙米多糖得率,用以得到三oK65f7fgpog9WJbrbZ+uLw==合一水平的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)方案,如表2所示。
2. 結(jié)果與分析
2.1 單因素試驗(yàn)分析
2.1.1 纖維素酶添加量的影響。固定葛仙米多糖提取的超聲溫度為90℃、超聲時(shí)間為60min,當(dāng)添加纖維素酶10-20mg時(shí),多糖得率不斷增加,且在20mg時(shí)達(dá)到最高點(diǎn);添加至30mg時(shí),多糖含量逐漸減少。由此可知,添加20mg纖維素酶為提取多糖最佳條件。
2.1.2 超聲溫度的影響。固定葛仙米多糖提取的纖維素酶添加量為20mg、超聲時(shí)間為60min,在超聲溫度為80℃-95℃時(shí),葛仙米多糖得率逐漸增加,說明溫度的升高有利于多糖的析出;在超聲溫度為95℃-100℃時(shí),葛仙米多糖得率緩慢減少,且在95℃附近達(dá)到最高值。因此,將溫度控制在95℃左右最為適宜。
2.1.3 超聲時(shí)間的影響。固定葛仙米多糖提取的纖維素酶添加量為20mg、超聲溫度為90℃,在超聲時(shí)間為30-90min時(shí),葛仙米多糖含量總體呈遞增狀態(tài);在90-150min時(shí),多糖得率逐漸下降。由此可知,在60-90min超聲時(shí)間內(nèi),多糖得率最高,故將處理時(shí)間控制在此區(qū)間內(nèi)最為適宜。
2.2 響應(yīng)面優(yōu)化及分析
在Design-Expert軟件中,利用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),優(yōu)化響應(yīng)面法。輸入3個(gè)因素與編碼水平,通過不同實(shí)驗(yàn)得到葛仙米多糖得率。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表3所示,響應(yīng)面模型結(jié)果方差分析如表4所示。
利用Design-Expert軟件對表3中因素水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析,可以得到纖維素酶的添加量(A)、超聲溫度(B)、超聲時(shí)間(C)對響應(yīng)值葛仙米多糖得率(Y)的回歸方程為:Y=5.48+0.36A+0.68B+0.59C-0.25AB-0.22AC+0.45BC-1.25A2-0.78B2-0.55C2。從表4數(shù)據(jù)可知,葛仙米多糖模型為0.00052,P值小于0.05,說明模型顯著;A2、B2的值分別為0.0002、0.0029,小于0.01,說明其關(guān)系較顯著;模型中相關(guān)系數(shù)R2=0.7780,Radj=0.9030,小于0.2,說明模型較好,實(shí)際誤差較小,試驗(yàn)的3個(gè)因素能夠反映與葛仙米多糖得率間的關(guān)系。
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),適宜的葛仙米多糖提取工藝條件為:纖維素酶20mg、超聲溫度96℃、超聲時(shí)間84min,此條件下的葛仙米多糖得率為5.9%。
基金項(xiàng)目:2023年湖北省高等學(xué)校實(shí)驗(yàn)室研究項(xiàng)目“基于生態(tài)校園下中藥學(xué)專業(yè)實(shí)踐教學(xué)平臺的構(gòu)建——以武漢生物工程學(xué)院為例”(HBSY2023-093);2023年校級教學(xué)改革研究立項(xiàng)“基于生態(tài)校園下醫(yī)藥學(xué)院專業(yè)實(shí)踐教學(xué)新體系的構(gòu)建”(2023J49)。
作者簡介:游林紅(1973-),女,漢族,湖北武漢人,高級實(shí)驗(yàn)師,碩士研究生,研究方向?yàn)槲⑸镆志兴幉挠行С煞值奶崛?、分離、鑒定等。
*通信作者:黃帥(1985-),男,漢族,湖北武漢人,副教授,博士,研究方向?yàn)樗幱弥参镔Y源的開發(fā)與利用。