液相串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品級(jí)煙酰胺中煙酸含量

煙酰胺又名尼克酰胺、維生素PP、維生素B3，是B族維生素的一種，對(duì)人體有多種益處，其在食品中主要是作為抗氧化劑和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用，有助于延緩食品氧化過(guò)程，保持食品的新鮮度和口感，同時(shí)提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。受煙酰胺生產(chǎn)工藝的影響，一般原料中都含有少量煙酸，其含量對(duì)煙酰胺的質(zhì)量有著重要影響。由于煙酰胺與煙酸的結(jié)構(gòu)相近，因此分離較為困難?，F(xiàn)有的檢測(cè)方法中，一般采用液相色譜法同時(shí)檢測(cè)樣品中的煙酰胺和煙酸，這種方法要求煙酰胺與煙酸的含量相近，互不產(chǎn)生干擾，并不適用于測(cè)定大量煙酰胺中煙酸的含量。本文采用了MAX混合型陰離子交換固相萃取柱，最終實(shí)現(xiàn)了煙酰胺與煙酸的分離，能準(zhǔn)確測(cè)定出煙酰胺中煙酸的含量，為提高煙酰胺的質(zhì)量提供了技術(shù)支持。

1. 材料與方法

1.1 儀器與試劑

賽默飛液相串聯(lián)質(zhì)譜儀，包括四元泵、在線真空脫氣機(jī)、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、TSQ質(zhì)譜檢測(cè)器，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；電子天平：感量為0.0001mg，德國(guó)賽多利斯；Milli-Q型純水系統(tǒng)；MAX混合型陰離子交換固相萃取柱：1000mg/6mL，深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司；煙酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度大于99.0%，德國(guó)Dr.E；甲醇：色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲酸：分析純，西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 溶液配制

煙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1000mg/L）：稱取煙酸標(biāo)準(zhǔn)品10mg于10mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，使用時(shí)用水稀釋至所需質(zhì)量濃度。

1.3 儀器工作條件

色譜柱：賽默飛Thermo Hypersil ODS（C18）色譜柱（1.7μm，50mm*2.1mm），或具有同等柱效的色譜柱；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：5uL；流速：0.2mL/min。流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇，等度洗脫，A：B=50：50。

正離子模式掃描；霧化氣：氮?dú)猓混F化室溫度：350℃；毛細(xì)管電壓：3.5kV；MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)；煙酸的離子對(duì)參數(shù)為124/106、124/80，定量離子參數(shù)為124/106。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 樣品預(yù)處理。取0.1g煙酰胺原料樣品，加入10mL去離子水，制成煙酰胺水溶液。向MAX混合型陰離子交換固相萃取柱內(nèi)加入3mL甲醇和3mL去離子水進(jìn)行活化，將上述10mL煙酰胺水溶液加入至MAX混合型陰離子交換固相萃取柱中，自然流干。取3mL甲醇溶液洗脫MAX混合型陰離子交換固相萃取柱，棄去洗脫液。再向MAX混合型陰離子交換固相萃取柱中加入6mL含16%甲酸的甲醇溶液，對(duì)其進(jìn)行洗脫，并收集洗脫后的甲醇溶液。向收集的甲醇溶液中加入去離子水，并定容至10mL。采用0.45μm濾膜過(guò)濾，液相串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.4.2 定量方法。取煙酸的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照儀器工作條件測(cè)定其標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行樣品分析，利用外標(biāo)法進(jìn)行定量，樣品中煙酸的含量為X（mg/kg），按照公式（1）計(jì)算。

X=C*V/m （1）

公式中：X表示煙酸的含量，單位為mg/kg；C表示外標(biāo)法曲線所得煙酸濃度，單位為mg/L；V表示定容的體積，單位為mL；m表示樣品的稱樣量，單位為g。

2. 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取柱的選擇

雖然煙酰胺與煙酸的定性離子對(duì)不一樣，但煙酰胺會(huì)嚴(yán)重干擾煙酸的測(cè)定，可能XqnlI3yt/OZbiWEkeMCinoCqUhBT11FvTTC4ddobCj4=是因?yàn)樵谡Ｊ降臏y(cè)定條件下，大量煙酰胺分子在離子源處與煙酸產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)離子化現(xiàn)象，嚴(yán)重降低了煙酸的響應(yīng)值，使得煙酸不容易被檢測(cè)到。因此，試驗(yàn)采用固相萃取柱實(shí)現(xiàn)煙酰胺與煙酸的分離。

從煙酰胺與煙酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式可以看出，兩者的結(jié)構(gòu)差異主要體現(xiàn)在酰胺鍵與羧基的差別。利用這個(gè)結(jié)構(gòu)差異，試驗(yàn)選取MAX混合型陰離子交換固相萃取柱，利用其與煙酸羧基的強(qiáng)堿弱酸離子鍵作用來(lái)富集煙酸，從而實(shí)現(xiàn)煙酰胺與煙酸的分離。MAX混合型陰離子交換固相萃取柱的富集原理見(jiàn)圖1。

2.2 流動(dòng)相的選擇

本試驗(yàn)對(duì)比了甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-水、乙腈-水四種不同的流動(dòng)相混合溶液，結(jié)果表明，甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，煙酸的響應(yīng)值更高。這可能是因?yàn)樵谡Ｊ奖O(jiān)測(cè)下，添加0.1%甲酸有利于煙酸吡啶環(huán)上的氮原子結(jié)合氫原子，提高其響應(yīng)值。同時(shí)，一般情況下，甲醇比乙腈更適合于正模式監(jiān)測(cè)，因此，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，采用甲醇-0.1%甲酸水溶液作為混合流動(dòng)相。

本試驗(yàn)同時(shí)嘗試了不同比例的甲醇-0.1%甲酸水溶液，最后確定流動(dòng)相比例為，A：B=50：50。見(jiàn)表1。

2.3 色譜柱的選擇

本試驗(yàn)選用反相色譜柱、正相色譜柱進(jìn)行色譜柱條件選擇，其型號(hào)分別為Thermo Hypersil ODS（C18）色譜柱、ZORBAX Rx-SIL色譜柱。結(jié)果表明，使用Thermo Hypersil ODS（C18）色譜柱時(shí)，煙酸出峰良好，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)待測(cè)物質(zhì)過(guò)早出峰的情況。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液以注射式連續(xù)直接進(jìn)樣的方式進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描分析，通過(guò)優(yōu)化霧化室溫度、毛細(xì)管電壓等參數(shù)，得到煙酸的準(zhǔn)分子離子峰。結(jié)果表明，煙酸在正模式比負(fù)模式的響應(yīng)值更高，因此選擇m/z=[M+H]+作為準(zhǔn)分子離子峰。然后選取準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行轟擊，通過(guò)優(yōu)化碰撞能量、質(zhì)譜分辨率等參數(shù)，最大化地提高檢測(cè)的靈敏度。通過(guò)分析二級(jí)質(zhì)譜信息得出，煙酸的二級(jí)質(zhì)譜碎片主要包括m/z=106、m/z=80。試驗(yàn)選取124/106、124/80作為監(jiān)測(cè)離子，其中定量離子參數(shù)為124/106。煙酸檢測(cè)色譜圖見(jiàn)圖2，煙酸的裂解規(guī)律見(jiàn)圖3。

2.5 洗脫溶液的選擇

MAX柱與煙酸的結(jié)合作用力為季銨離子與羧基的強(qiáng)堿弱酸離子鍵作用，要從MAX柱上洗脫煙酸，洗脫液的酸性一般要求比煙酸更強(qiáng)。煙酸的吡啶環(huán)是一個(gè)強(qiáng)吸電子基團(tuán)，能夠增強(qiáng)煙酸上羧基的酸性，因此，煙酸的酸性比較強(qiáng)。本試驗(yàn)分別嘗試5%乙酸的甲醇溶液、10%乙酸的甲醇溶液、16%乙酸的甲醇溶液、5%甲酸的甲醇溶液、10%甲酸的甲醇溶液、16%甲酸的甲醇溶液等6個(gè)不同組合溶液洗脫MAX柱。結(jié)果表明，乙酸的甲醇溶液并不能有效洗脫煙酸，回收效率并不高。為了能夠充分地洗脫MAX柱上富集的煙酸，本試驗(yàn)采用含有16%甲酸的甲醇溶液洗脫MAX柱。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、回收率及精密度

配制質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.50、1.0mg/L的煙酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按儀器工作條件測(cè)定其標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在0.05-1.0mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)r>0.9990。結(jié)果見(jiàn)表2。

稱取空白煙酰胺樣品1.0g，分成三組，分別添加0.1、0.25、0.50mg/L三個(gè)濃度煙酸，相當(dāng)于含有1、2.5、5mg/kg煙酸。按照本方法進(jìn)行添加回收率和精密度（n=6）實(shí)驗(yàn)，計(jì)算得到回收率為89.1%-116.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%-9.2%?？瞻谉燉０窐悠芳訕?biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，方法測(cè)定下限（10倍信噪比）可達(dá)1mg/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

本文建立了固相萃取-液相串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定煙酰胺中煙酸含量的方法，其中的關(guān)鍵技術(shù)是根據(jù)煙酰胺與煙酸的結(jié)構(gòu)，采用MAX混合型陰離子交換固相萃取柱實(shí)現(xiàn)煙酰胺與煙酸的分離，避免了兩者之間的互相干擾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法線性關(guān)系良好、檢出限低，能夠滿足對(duì)食品級(jí)煙酰胺中煙酸的測(cè)定。

作者簡(jiǎn)介：黃錦波（1988-），男，漢族，廣東茂名人，助理工程師，大學(xué)本科，研究方向?yàn)槭称?、化妝品與環(huán)境分析。