轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用分析

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，轉(zhuǎn)基因食品已成為備受關(guān)注的熱點(diǎn)，但其安全性問題也引發(fā)了廣泛的爭(zhēng)議，如何加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的安全性評(píng)估與檢測(cè)已成為保障食品安全的重要課題。本文簡(jiǎn)要介紹了轉(zhuǎn)基因食品的概念、發(fā)展現(xiàn)狀及安全性問題，重點(diǎn)探討轉(zhuǎn)基因食品安全檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用，以期為相關(guān)研究提供參考。

一、轉(zhuǎn)基因食品的概念和分類

（一）轉(zhuǎn)基因食品的概念

轉(zhuǎn)基因食品是指利用基因工程技術(shù)將外源基因轉(zhuǎn)移到動(dòng)植物基因組中，使其獲得新的遺傳性狀，再經(jīng)過培育、生產(chǎn)加工而成的食品。常見的轉(zhuǎn)基因作物包括大豆、玉米、油菜等，其衍生食品如豆油、玉米淀粉、食用油等也屬于轉(zhuǎn)基因食品范疇。

（二）轉(zhuǎn)基因食品的分類

按照基因來源，轉(zhuǎn)基因食品可分為植物源性、動(dòng)物源性和微生物源性三大類。目前，商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物主要為植物源性食品，如抗除草劑大豆等。動(dòng)物源性轉(zhuǎn)基因食品研究相對(duì)滯后，但轉(zhuǎn)基因魚、轉(zhuǎn)基因豬等已進(jìn)入實(shí)驗(yàn)和中試階段。利用轉(zhuǎn)基因微生物發(fā)酵生產(chǎn)的食品添加劑如氨基酸、酶制劑等，在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛。

按照目的基因功能，可將轉(zhuǎn)基因食品分為抗蟲型、抗除草劑型、改良品質(zhì)型、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化型等。例如，轉(zhuǎn)EPSPS基因大豆可耐受草甘膦除草劑；轉(zhuǎn)FAD2-1A基因大豆的亞油酸含量比普通大豆提高約20%；轉(zhuǎn)胡蘿卜素合成酶基因水稻的β-胡蘿卜素含量大幅提升。

二、轉(zhuǎn)基因食品安全檢測(cè)技術(shù)

自問世以來，轉(zhuǎn)基因食品的安全性問題一直備受社會(huì)各界關(guān)注，有研究者擔(dān)心外源基因可能產(chǎn)生毒性、過敏性等，對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境造成不利影響。針對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的安全性，各國紛紛建立了相應(yīng)的安全評(píng)估制度。我國對(duì)轉(zhuǎn)基因生物的研發(fā)實(shí)行嚴(yán)格的安全管理，農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全評(píng)價(jià)需經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究、中間試NQPPjKMNRFEFovyMp5/IQQ==驗(yàn)、環(huán)境釋放、生產(chǎn)性試驗(yàn)、安全證書審批等階段，只有獲得農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書的產(chǎn)品才可以進(jìn)入商業(yè)化應(yīng)用。當(dāng)然，檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用對(duì)于保障轉(zhuǎn)基因食品的安全也具有重要意義。

（一）蛋白質(zhì)水平檢測(cè)

1.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法。蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的直接產(chǎn)物，對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行分析是判斷食品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分的重要途徑。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，其基本原理是利用抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，通過顯色底物的顏色變化判斷樣品中是否含有目標(biāo)蛋白質(zhì)。酶聯(lián)免疫吸附法的操作流程通常包括以下幾個(gè)步驟：第一，將待測(cè)樣品蛋白提取物包被于酶標(biāo)板孔中，使目標(biāo)抗原固定在包被孔壁上；第二，加入特異性識(shí)別目標(biāo)蛋白的酶標(biāo)記一抗，與固定化抗原結(jié)合；第三，洗滌去除未結(jié)合的游離抗體，加入底物顯色液，根據(jù)顯色反應(yīng)判斷樣品中是否含有目標(biāo)蛋白。ELISA可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的定性或定量檢測(cè)，靈敏度可達(dá)1ng/mL。與核酸檢測(cè)相比，ELISA具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，非常適合用于大批量樣品的初篩檢測(cè)。不過，ELISA的特異性和靈敏度往往不如核酸檢測(cè)方法，容易受到樣品基質(zhì)效應(yīng)等因素的干擾，食品中某些夾雜蛋白也可能與目標(biāo)蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。因此，ELISA常作為轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)的初篩手段，可疑樣品還需進(jìn)一步采用核酸檢測(cè)方法進(jìn)行確認(rèn)。

2. Western雜交檢測(cè)技術(shù)。借助Western雜交檢測(cè)技術(shù)實(shí)施檢驗(yàn)時(shí)，先從檢測(cè)樣本中提取蛋白，按照分子量進(jìn)行分選，再投入專一識(shí)別目標(biāo)蛋白的抗體。目標(biāo)蛋白與對(duì)應(yīng)抗體相結(jié)合，利用與一抗特異綁定的酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)，通過評(píng)估二抗的活性確認(rèn)蛋白質(zhì)是否存在表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因食物的識(shí)別。Western雜交檢測(cè)技術(shù)通過分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，能夠斷定待測(cè)物中植物細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況，包括表達(dá)濃度與規(guī)模，被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)中。

3.蛋白質(zhì)芯片技術(shù)。蛋白質(zhì)芯片在分析流程上與核酸芯片相似，但工作原理有所不同。蛋白質(zhì)芯片依靠特定的抗體與抗原之間的結(jié)合特性進(jìn)行分析，被測(cè)樣品會(huì)與固定相表面的抗原或抗體相互作用，通過洗滌等手段，可以將固定相表面的抗體或抗原與檢測(cè)液中其他成分分離，利用酶聯(lián)抗體發(fā)生特定反應(yīng)，再通過顏色變化或熒光反應(yīng)識(shí)別轉(zhuǎn)基因元素，并據(jù)此實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的鑒別。

（二）核酸水平檢測(cè)

1.PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)。蛋白質(zhì)容易受到食品加工條件的影響而發(fā)生變性失活，導(dǎo)致檢測(cè)的靈敏度和可重復(fù)性下降。相比之下，核酸分子結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，能夠耐受較為苛刻的食品加工條件。因此，以DNA為檢測(cè)對(duì)象的核酸水平檢測(cè)方法，在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)領(lǐng)域占據(jù)主導(dǎo)地位。

PCR技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛的核酸檢測(cè)方法，利用一對(duì)特異性引物，在Taq DNA聚合酶的作用下，通過變性、退火、延伸三步循環(huán)，實(shí)現(xiàn)目的基因的快速擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)條帶的有無和大小判斷樣品中是否含有目標(biāo)基因。

PCR反應(yīng)體系中引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，直接決定了PCR的特異性和靈敏度。引物通常選擇在轉(zhuǎn)基因的調(diào)控序列或特異性外源基因序列上，以避免與植物內(nèi)源基因發(fā)生交叉擴(kuò)增。此外，引物還需避開基因組DNA中的重復(fù)序列，以提高檢測(cè)的重現(xiàn)性。在優(yōu)化條件下，常規(guī)PCR可檢測(cè)到20-50拷貝的模板分子，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.01%。

為進(jìn)一步提高PCR檢測(cè)的靈敏度，可采用巢式PCR（nested PCR）策略。巢式PCR需設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，第一輪先用PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因的較大片段，在第二輪中，PCR用第一輪產(chǎn)物作為模板，用內(nèi)部引物再次擴(kuò)增目的片段。由于兩輪擴(kuò)增均較特異，因此巢式PCR的檢出限可低至0.001%，但操作步驟相對(duì)繁瑣。

PCR技術(shù)的一個(gè)局限性在于難以對(duì)轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行精確定量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)則彌補(bǔ)了這一不足，可在擴(kuò)增的同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR產(chǎn)物的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和定量分析。qPCR主要有兩種檢測(cè)策略，即SYBR Green I染料法和TaqMan探針法。SYBR Green I染料可嵌入到PCR產(chǎn)物雙鏈DNA中，產(chǎn)生熒光信號(hào)，無需額外設(shè)計(jì)探針，但特異性較低；TaqMan探針上標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，雜交到模板后隨著PCR進(jìn)行，報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)會(huì)被切割開進(jìn)而產(chǎn)生熒光信號(hào)，特異性更高。qPCR可將檢測(cè)靈敏度進(jìn)一步提升到0.001%-0.0001%，但對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作條件的要求也更加嚴(yán)格。

如今，multiplex PCR、digital PCR（dPCR）、loop-mediated isothermal amplification（LAMP）等新興核酸擴(kuò)增技術(shù)為轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)提供了更多選擇。其中，multiplex PCR可在單管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)轉(zhuǎn)基因目標(biāo)，提高了檢測(cè)通量；dPCR利用微流控芯片將待測(cè)DNA分割成萬級(jí)別的反應(yīng)體系，可實(shí)現(xiàn)對(duì)低拷貝模板的絕對(duì)定量；LAMP利用兩對(duì)特異性引物在恒溫條件下快速擴(kuò)增目標(biāo)序列，無需PCR儀即可完成檢測(cè)。

2.基因芯片檢測(cè)技術(shù)?；蛐酒夹g(shù)通過將DNA分子和短鏈核苷酸探針緊湊地排布并固化在載體上，能夠?qū)⑷缒退幮曰颉?dòng)子序列、終止碼等特定的基因段錨定于玻璃片表面用作檢測(cè)平臺(tái)，通過放大待測(cè)樣品中的DNA進(jìn)行標(biāo)記并與微陣列進(jìn)行雜交反應(yīng)?；蛐酒瑱z測(cè)技術(shù)利用計(jì)算機(jī)分析技術(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)解讀，從而準(zhǔn)確鑒定待測(cè)物中含有的基因信息，評(píng)價(jià)食品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。

三、各種轉(zhuǎn)基因食品安全檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中，PCR技術(shù)常用于定性篩查轉(zhuǎn)基因成分。以轉(zhuǎn)基因大豆為例，可以設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增內(nèi)源lectin基因，作為PCR反應(yīng)陽性對(duì)照；再設(shè)計(jì)一對(duì)引物特異性擴(kuò)增外源CP4-EPSPS基因。兩對(duì)引物擴(kuò)增片段的分子量分別為318bp和172bp，可通過凝膠電泳清晰區(qū)分。若樣品中兩個(gè)片段都被擴(kuò)增出來，說明樣品中含有內(nèi)源和外源基因，為轉(zhuǎn)基因大豆陽性；若樣品中只擴(kuò)增出內(nèi)源lectin基因片段，則可判定為非轉(zhuǎn)基因大豆。

在敏感性方面，普通PCR可檢測(cè)到20-50拷貝的模板分子，靈敏度可達(dá)0.01%。若采用巢式PCR，即用第一輪PCR的產(chǎn)物作為第二輪PCR的模板，特異性和靈敏度可進(jìn)一步提高，但操作也相對(duì)繁瑣。

PCR技術(shù)可對(duì)樣品中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定性分析，但難以給出準(zhǔn)確的定量結(jié)果，為實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因食品中外源基因含量的精確定量，qPCR技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，可在PCR進(jìn)行的同時(shí)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和定量分析。qPCR可將檢測(cè)靈敏度提高到0.001%-0.0001%，但對(duì)操作條件和環(huán)境的要求也更高。

基因芯片技術(shù)是一種高通量、并行化的分子檢測(cè)技術(shù)，將大量探針分子固定在固相載體上，形成高密度的探針陣列，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)目標(biāo)分子的同時(shí)檢測(cè)。將熒光標(biāo)記的待測(cè)樣品DNA與芯片雜交，互補(bǔ)配對(duì)的探針與靶分子會(huì)特異性結(jié)合。雜交芯片經(jīng)熒光掃描儀激發(fā)和成像，結(jié)合位置和熒光強(qiáng)度的變化即可判斷樣品中是否含有特定序列，并估算其相對(duì)含量。

在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)領(lǐng)域，可在一張基因芯片上設(shè)計(jì)多種轉(zhuǎn)基因成分的特異性探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中多種外源基因的同時(shí)檢測(cè)。例如，可在芯片上固定Cry1Ab、CP4-EPSPS、PAT等幾種常見轉(zhuǎn)基因的探針，分別與轉(zhuǎn)基因棉花、大豆、玉米中的外源基因序列互補(bǔ)。提取待測(cè)食品總DNA并進(jìn)行熒光標(biāo)記后與芯片雜交，根據(jù)雜交信號(hào)的位置，即可判斷樣品中含有哪些轉(zhuǎn)基因成分。

綜上所述，相比傳統(tǒng)育種，轉(zhuǎn)基因技術(shù)極大拓展了遺傳改良的空間，但也帶來了更多不確定因素，因此，嚴(yán)格的安全評(píng)估與檢測(cè)體系是保障轉(zhuǎn)基因食品安全的重要前提。蛋白質(zhì)檢測(cè)和核酸檢測(cè)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品監(jiān)管中發(fā)揮著重要作用，PCR、基因芯片等技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用。隨著檢測(cè)新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，多指標(biāo)、高通量、快速便捷的檢測(cè)方案有望進(jìn)一步提升轉(zhuǎn)基因食品安全監(jiān)管的科學(xué)性和有效性。同時(shí)，加強(qiáng)全球協(xié)同管理，構(gòu)建國際認(rèn)可、多方參與的轉(zhuǎn)基因食品安全治理體系，對(duì)于推動(dòng)生物技術(shù)健康發(fā)展、保障食品安全和生態(tài)安全將發(fā)揮關(guān)鍵作用。

作者簡(jiǎn)介：吳曉月（1991-），女，助理工程師，大學(xué)本科，研究方向?yàn)槭称钒踩O(jiān)管。