中國南瓜CmoAux/IAA基因的克隆和表達特征分析

摘 要：在前期對中國南瓜敗育雌蕊和正常雌蕊進行轉錄組分析發(fā)現(xiàn)，CmoAux/IAA基因可能參與了雌花發(fā)育，為進一步探究其生物學功能，利用同源序列克隆法從中國南瓜中克隆得到全長為600 bp的CmoAux/IAA基因，該基因編碼199個氨基酸；保守結構域分析結果表明，其屬于Aux/IAA家族，包含結構域Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ；該蛋白無信號肽和跨膜結構。多序列比對和系統(tǒng)進化樹分析結果顯示，CmoAux/IAA氨基酸序列與印度南瓜XP_022986212.1的氨基酸序列、美洲南瓜XP_023513171.1的氨基酸序列親緣關系較近，相似度高達98.01%、96.50%。擬南芥原生質體亞細胞定位結果顯示，CmoAux/IAA蛋白定位于細胞核和細胞質。實時熒光定量結果顯示，該基因具有組織表達特異性，主要在南瓜植株生長點及雌花柱頭中表達，柱頭中的相對表達量是雄蕊的137倍，在葉和根中不表達，其可能在植株生長點幼嫩組織分化或雌花發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

關鍵詞：中國南瓜；Aux/IAA；基因克??；生物信息學分析；亞細胞定位

中圖分類號：S642.1 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）10-030-08

收稿日期：2024-04-29；修回日期：2024-07-07

基金項目：國家自然科學基金（32302559）；河南省科技攻關項目（242102110312）；河南省高等學校青年骨干教師培養(yǎng)計劃（2024GGJS102）；河南省重大科技專項（241100110200）

作者簡介：任廣乾，男，助理研究員，主要從事瓜類品種選育研究工作。E-mail：1491748031@qq.com

共同第一作者：劉正響，男，在讀碩士研究生，主要從事南瓜重要農藝性狀基因挖掘研究工作。E-mail：liuzhengxiang33@163.com

通信作者：李慶飛，副教授，主要從事蔬菜種質資源創(chuàng)新與利用研究工作。E-mail：lqf_20131025@126.com

Cloning and expression analysis of CmoAux/IAA gene in Cucurbita moschata

REN Guangqian1， LIU Zhengxiang2， HAN Yuanyuan2， CHEN Bihua2， LI Xinzheng2， LI Qingfei2

（1. Xinxiang City Academy of Agricultural Sciences， Xinxiang 453003， Henan， China; 2. College of Horticulture and Landscape， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， Henan， China）

Abstract： In the previous study， transcriptomic analysis of abortive pistil and normal pistil of Cucurbita moschata found that CmoAux/IAA gene might be involved in female flower development. In order to further explore its biological function， a 600 bp gene（CmoAux/IAA） was cloned from Cucurbita moschata by homologous sequence cloning method and it encodes 199 amino acids. The results of conserved domain analysis showed that it belongs to the Aux/IAA family and includes domains Ⅰ， Ⅲ， and Ⅳ. The protein has no signal peptide and transmembrane structure. Multiple sequence alignment and phylogenetic tree results showed that the amino acid sequence of CmoAux/IAA were closely related to XP_022986212.1 of Cucurbita maxima and XP_023513171.1 of Cucurbita pepo， and the similarity was 98.01% and 96.50%， respectively. The results of subcellular localization of Arabidopsis protoplasts showed that the protein was located in nucleus and cytoplasm. Real-time fluorescence quantitative results showed that CmoAux/IAA has tissue expression specificity， mainly expressed in the growing points and stigma of female flowers in pumpkin plants， and the expression level of CmoAux/IAA in stigma was 137 fold that of in stamen， but not expressed in leaves and roots and it may play an important role in the differentiation of young tissue or the development of female flowers.

Key words：Cucurbita moschata; Aux/IAA; Gene cloning; Bioinformatics analysis; Subcellular localization

南瓜為葫蘆科南瓜屬一年生蔓生草本植物，是一種集食用、藥用、觀賞兼加工的蔬菜作物[1]，在世界各地廣泛栽培，主要栽培種有中國南瓜（Cucurbita moschata）、印度南瓜（Cucurbita maxima）、美洲南瓜（Cucurbita pepo）和黑籽南瓜（Cucurbita ficifolia），其中，中國南瓜栽培范圍最廣泛。我國是南瓜生產大國，據(jù)2022年FAO（https：//www.fao.org/faostat/zh/#data/QCL）統(tǒng)計，我國南瓜年栽培面積約39.8萬hm2，年總產量737.8萬t，均居世界第一位。提高南瓜產量是增加經(jīng)濟效益的有效途徑，而雌花與產量息息相關，因此，研究南瓜雌花發(fā)育相關基因具有重要意義。

生長素是植物最重要的激素之一，在生長發(fā)育過程中具有重要作用，包括細胞分裂、葉片延伸、開花模式、頂端優(yōu)勢、向性生長和抗逆性等[2]。植物生長素信號轉導途徑包括信號識別、下游生長素相關基因的表達以及植物的生理反應等，下游生長素相關基因又稱為早期/原初響應基因，主要包括生長素/吲哚-3-乙酸（auxin/indole-3-acetic acid，Aux/IAA）、生長素響應因子（ARF）、GH3（gretchen hagen 3）和SAUR（small auxin-up RNA）等基因家族[3-4]。Aux/IAA蛋白通常包含4個保守結構域[3，5]。結構域Ⅰ含有“LxLxLx”（亮氨酸重復單元）基序，該基序與乙烯響應因子相關，是Aux/IAA蛋白轉錄抑制功能不可缺少的一部分[6]。結構域II具有保守的“GWPP”基序，主要負責Aux/IAAs的生長素依賴性降解[7-8]。結構域III和結構域IV包含一個羧基端PB1（Phox和Bem1）結構域，該結構域也位于ARFs的羧基端，負責Aux/IAA和ARF蛋白之間的同源和異源二聚化[9-10]；結構域Ⅲ由三部分組成（β、α1和α2）[11]。結構域IV包含1個保守基序（GDVPW）和1個保守的SV40型核定位信號（NLS：KRxRxxK），有助于二聚化[12-13]。在結構域I和II之間發(fā)現(xiàn)的雙向保守NLS將Aux/IAA蛋白引導到細胞核中，比SV40型NLS更有效[11，14]。同時具有4個結構域的蛋白稱為典型的Aux/IAA蛋白，而至少缺1個結構域的Aux/IAA蛋白被稱為是非典型的Aux/IAA蛋白，這種非典型的Aux/IAA蛋白在植物中普遍存在，且在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[15-17]。Aux/IAA是一種轉錄抑制因子，通過與參與生長素基因表達響應的ARFs結合抑制下游基因的表達[18]。生長素調控著Aux/IAA蛋白的降解，低濃度生長素抑制ARF轉錄，調節(jié)生長素誘導的基因表達；高濃度生長素使Aux/IAA發(fā)生降解，減輕了Aux/IAA對ARF的抑制作用，使其參與到下游靶基因的調控[19-20]。在擬南芥中，Aux/IAA家族基因IAA8與ARF6和ARF8互作，影響下游生長素誘導基因的表達[21]；而ARF6和ARF8在柱頭、萼片、花絲及花瓣等花器官中均有表達[22]，通過影響茉莉酸含量可調控花藥開裂影響授粉[23]；因此，Aux/IAA間接參與調節(jié)擬南芥花器官的發(fā)育。在番茄中，SIIAA27表達下調會降低胚珠和花粉育性，而敲除SIIAA27基因則在影響根發(fā)育的同時也會降低葉片中的葉綠素含量[24]。與野生型相比，穩(wěn)定的IAA16突變體使得花絲伸長率下降[25]。

南瓜是雌雄異花同株植物，是研究雌雄花發(fā)育的有利材料，但相比黃瓜、甜瓜等同科作物，南瓜雌花發(fā)育研究相對落后。河南科技學院南瓜種質資源研究課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，1個CmoAux/IAA基因在中國南瓜敗育雌蕊中下調表達，推測其可能與雌花發(fā)育有關，且南瓜中尚未見有關CmoAux/IAA基因的報道。筆者對該基因進行克隆、亞細胞定位及生物信息學分析，并研究了該基因在不同組織和不同花結構中的表達模式，研究結果將有助于深入探究CmoAux/IAA基因的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗于2021年5月至2022年5月在河南科技學院園藝園林學院實驗室及基地進行。試驗所用植物材料為河南科技學院南瓜課題組提供的中國南瓜自交系2018-3-1。

1.2 方法

1.2.1 中國南瓜CmoAux/IAA基因的克隆 采用試劑盒進行南瓜材料總RNA提取以及cDNA第一鏈合成，依據(jù)中國南瓜基因組數(shù)據(jù)庫（http：//cucurbitgenomics.org/organism/9）中同源基因的CDS序列設計引物，引物序列為：CmoAux/IAA-F（CATCTAGAATGGAGCCTAATCAGTTCT）、CmoAux/IAA-R（ACCTCGAGATTTTGATGAATGGCA）。以cDNA為模板進行PCR擴增，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收CmoAux/IAA基因片段連接至pMD19-T載體，轉入大腸桿菌DH5α，將陽性菌液進行測序，選擇測序無誤的菌液進行后續(xù)試驗。

1.2.2 CmoAux/IAA基因的生物信息學分析 利用Deep TMHMM預測跨膜結構；利用ExPASy ProParam tool預測CmoAux/IAA蛋白的分子質量、理論等電點pI、平均親水性和不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質；Net Phos3.1 Serve預測CmoAux/IAA蛋白的磷酸化位點；NPS@：SOPMA預測CmoAux/IAA蛋白的二級結構；SignalP 6.0 Server預測CmoAux/IAA基因編碼蛋白的信號肽；NCBI-CDS預測保守結構域；NCBI BLAST進行同源性比對分析；DNAMAN 6.0軟件進行多序列比對分析，MEGA 7.0構建系統(tǒng)進化樹。所用工具網(wǎng)站見表1。

1.2.3 CmoAux/IAA蛋白的亞細胞定位 利用WoLF PSORT和Plant-mPLoc server預測CmoAux/IAA亞細胞位置，并構建GFP融合表達載體轉化擬南芥原生質體，確定CmoAux/IAA蛋白表達的亞細胞位置。原生質體的制備及重組質粒轉化原生質體參照Yoo等[26]、陳培雯等[27]的方法。

1.2.4 CmoAux/IAA在不同組織和花不同結構中的表達分析 為了研究CmoAux/IAA基因在中國南瓜中的表達模式，利用基因特異性熒光定量引物（qCmoAUX-IAA-F：ATTCCAATCTCGCACTT；qCmoAUX-IAA-R：CTCAGCCTCTTTACATCC），采用實時熒光定量qRT-PCR對基因在同一植株根、莖、葉、生長點以及相鄰節(jié)位的雌花（柱頭、雌花萼片、子房）、雄花（雄蕊、雄花萼片）中的表達水平進行分析。當植株處于開花結果期時，采取完全隨機設計，隨機選取長勢一致、生長健壯無病害的植株。具體取樣部位：根為主根不含側根，莖為由下至上第5到第6片真葉之間，葉為由下至上第5片真葉，生長點為主蔓生長點；花不同結構取自2018-3-1同一植株上當天開放的雌花和雄花，用解剖刀將雌花分為雌花萼片、柱頭和子房三部分，雄花分為雄花萼片和雄蕊兩部分。取樣后立即投入液氮中冷凍，存于-80 ℃超低溫冰箱待用。樣本的RNA提取、cDNA反轉錄參考李慶飛等[28]的方法。每個樣品設3個生物學重復，相對表達量計算采用2?ΔΔCt法[29]，利用DPS 7.0.5.8軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 中國南瓜CmoAux/IAA基因的獲得

以南瓜自交系2018-3-1雌花的cDNA為模板，用CmoAux/IAA-F和CmoAux/IAA-R引物進行PCR擴增，電泳結果如圖1。CmoAux/IAA基因的CDS全長為600 bp。

2.2 CmoAux/IAA蛋白的生物信息學分析

2.2.1 CmoAux/IAA蛋白的理化性質 ProParam對CmoAux/IAA蛋白的理化性質預測結果表明，CmoAux/IAA蛋白分子質量為22.70 kDa，分子式為C992H1509N273O320S10，由199個氨基酸組成，理論等電點pI為4.57，消光系數(shù)34 170，正電荷殘基（精氨酸+賴氨酸）18個，負電荷殘基（天冬氨酸+谷氨酸）36個，脂肪氨基酸系數(shù)73.37，不穩(wěn)定系數(shù)為45.93，平均親水性為-0.595。NetPhos 3.1 server預測CmoAux/IAA蛋白包含2個蘇氨酸位點、8個酪氨酸位點、12個絲氨酸位點共22個磷酸化位點，詳見圖2。

2.2.2 CmoAux/IAA的蛋白結構分析 利用NPS@：SOPMA對CmoAux/IAA蛋白預測，發(fā)現(xiàn)CmoAux/IAA蛋白199個氨基酸中，無規(guī)則卷曲占比最高，為37.19%，其次是α-螺旋占比27.64%，延伸鏈占比26.13%，β-轉角占比最低，為9.05%（圖3）。

SignalP 6.0 server預測結果顯示CmoAux/IAA蛋白無信號肽（圖4-a）；Deep TMHMM預測結果顯示CmoAux/IAA蛋白無跨膜結構（圖4-b）。

2.2.3 CmoAux/IAA蛋白保守結構域分析 利用NCBI在線預測CmoAux/IAA的保守結構域，結果顯示，CmoAux/IAA基因所編碼的氨基酸序列含有1個Aux/IAA（104～188位氨基酸）結構域，如圖5所示。

2.3 CmoAux/IAA蛋白的同源序列比對及進化關系分析

同源序列比對發(fā)現(xiàn)，CmoAux/IAA氨基酸序列與中國南瓜數(shù)據(jù)庫中基因（XP_022957191.1）的氨基酸序列完全相同，與印度南瓜（Cucurbita maxima，XP_022986212.1）相似度最高，為98.01%，與美洲南瓜（Cucurbita pepo，XP_023513171.1）相似度為96.50%，與冬瓜（Benincasa hispida，XP_038893192.1）相似度為62.25%，與黃瓜（Cucumis sativus，XP_004135388）相似度為52.22%，與甜瓜（Cucumis melo，XP_008446639.1）的相似度最低，為50.96%。同時發(fā)現(xiàn)氨基酸序列中包含結構域Ⅰ的“LxLxL”基序、結構域Ⅲ的β、α1、α2及結構域Ⅳ的保守基序“GDVPW”和核定位信號“KRLR”基序（圖6）。

由圖7系統(tǒng)進化樹可知，中國南瓜CmoAux/IAA與印度南瓜親緣關系最近，其次為美洲南瓜，與甜瓜、黃瓜和冬瓜等的親緣關系較遠。

2.4 CmoAux/IAA蛋白的亞細胞定位

WoLF PSORT Prediction和Plant-mPLoc server預測結果顯示，CmoAux/IAA蛋白可能位于細胞核和細胞質。如圖8所示，CmoAux/IAA-GFP融合蛋白在細胞核和細胞質中有明顯的綠色熒光，說明CmoAux/IAA蛋白位于細胞核和細胞質中。

2.5 CmoAux/IAA在植株不同組織和花不同結構中的表達

對該基因的表達模式進行分析，結果顯示CmoAux/IAA在生長點中表達量最高，是莖中的58倍，在葉和根中不表達。進一步分析其在花不同結構中的表達模式，發(fā)現(xiàn)該基因在雌花柱頭及雌花萼片結構中的表達水平較高，在柱頭中的相對表達量顯著高于雄花各個結構。其中，在雌花柱頭中的表達量最高，其次為雌花萼片，柱頭中的相對表達量是雄蕊的137倍（圖9），表明該基因具有明顯的組織表達特異性。

3 討論與結論

Aux/IAA是生長素信號轉導通路的轉錄抑制因子，抑制生長素響應因子的表達，在植物根、芽、花和果實的生長發(fā)育中發(fā)揮多效性作用[2，6，30-32]。南瓜雌花發(fā)育是否正常直接關系到能否正常授粉，子房是否膨大結實，因此，研究南瓜雌花發(fā)育的關鍵基因具有重要意義。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)了1個CmoAux/IAA基因可能與中國南瓜雌花發(fā)育有關。

筆者通過克隆CmoAux/IAA基因進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，CmoAux/IAA蛋白等電點值為4.54，與大多數(shù)Aux/IAA蛋白一致，表現(xiàn)為酸性[33-34]。CmoAux/IAA基因編碼的蛋白包含1個Aux/IAA超家族結構域，與三月李中PsIAA1、PsIAA2、PsIAA4等9個蛋白質一致[35]。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)Aux/IAA家族基因預測在細胞核中[3，33-36]。三月李中PsIAA8和PsIAA10預測在細胞核和細胞質中[35]，與本試驗基因定位結果一致。同源多序列比對和進化樹分析發(fā)現(xiàn)，美洲南瓜和印度南瓜的氨基酸序列與CmoAux/IAA氨基酸序列高度相似，說明該蛋白在進化過程中比較保守。多序列比對分析發(fā)現(xiàn)，CmoAux/IAA蛋白不含結構域Ⅱ的“GWPP”基序且只含有1個NLS；在番茄中發(fā)現(xiàn)Sl-IAA4、Sl-IAA22、Sl-IAA29基因嚴格靶向細胞核，表明退化的NLS足以將蛋白質特異性驅動到細胞核，而Sl-IAA32定位延伸到核外區(qū)室可能是由于缺乏部分NLS或缺乏負責蛋白質降解的結構域Ⅱ，從而提出了Aux/IAA可能參與獨立于傳統(tǒng)生長素信號通路機制的假設[36]，這與本試驗結果相一致。測序結果顯示第348位堿基T突變?yōu)镃，但是由于密碼子具有簡并性，并未引起氨基酸序列的變化。許多研究表明，同源基因在不同物種間可能具有功能上的相似性[3]。筆者通過實時熒光定量發(fā)現(xiàn)CmoAux/IAA基因在雌花柱頭中的表達量顯著高于其他花結構，表明CmoAux/IAA基因可能在雌花生長發(fā)育過程中扮演重要角色，推測可能與雌花發(fā)育相關。在玉米中，ZmIAA29的過表達顯著提前了玉米的雄穗授粉和吐絲時間，這意味著ZmIAA29在生殖轉化和花形態(tài)建成中起著關鍵作用[37]。在擬南芥中，IAA8可能與ARF6/8蛋白存在相互作用，影響花器官的發(fā)育[38]。在鐵皮石斛中，DoIAA4、DoIAA5、DoIAA6、DoIAA8分別在花瓣、花柱、萼片和花蕾中高表達，表明它們在花發(fā)育中的作用，與本試驗結果相呼應[39]。在典型的被子植物中，花發(fā)育過程有許多快速、有序和短暫的事件，這些事件包括萼片打開露出內部器官，花瓣、雄蕊和花柱伸長，花藥開裂釋放花粉，柱頭成熟使花粉萌發(fā)[38]。Aux/IAA是一種短壽命的核蛋白[40]，生長素響應基因Aux/IAA1和Aux/IAA2在草莓果實發(fā)育早期階段強烈上調，但在整個成熟過程中顯著降低[6]。不同組織中表達模式分析發(fā)現(xiàn)，CmoAux/IAA基因在生長較為旺盛的生長點中高表達，在莖中的表達顯著低于生長點，而在葉中未檢測到CmoAux/IAA基因表達，說明CmoAux/IAA是一種短壽命蛋白，與前人研究結果相符。本研究結果為后續(xù)深入探索CmoAux/IAA的生物學功能提供了參考。

本研究中的CmoAux/IAA基因CDS全長600 bp，編碼蛋白理論等電點pI為4.57，是不穩(wěn)性定親水蛋白，位于細胞核和細胞質中，共22個磷酸化位點，無信號肽和跨膜結構，缺少結構域Ⅱ且只有1個核定位信號，是非典型的Aux/IAA蛋白。該蛋白與印度南瓜（XP_022986212.1）親緣關系最近。CmoAux/IAA基因在南瓜植株生長點及雌花柱頭中的表達量較高，具有明顯的組織表達特異性。

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