食用菌菌種分子生物學(xué)檢測研究進(jìn)展

摘 要：近年來，我國食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，食用菌菌種混亂、來源不清等問題已成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。傳統(tǒng)的食用菌菌種鑒定方法，如形態(tài)學(xué)特征觀察、品種拮抗試驗等，雖然在一定程度上能夠滿足需求，但存在鑒定周期長、準(zhǔn)確性不高等問題。分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，為食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了強大的技術(shù)支撐，也提升了食用菌菌種檢測、品種鑒定與種質(zhì)資源保護(hù)水平。常見的食用菌菌種分子生物學(xué)檢測方法有DNA分子標(biāo)記、DNA序列分析與DNA條形碼技術(shù)等。DNA分子標(biāo)記技術(shù)包括以分子雜交為基礎(chǔ)的DNA標(biāo)記，如RFLP；以PCR為基礎(chǔ)的各種DNA指紋技術(shù)，如RAPD；以及以測序為基礎(chǔ)的新型分子標(biāo)記，如SNP與MNP等。DNA序列分析技術(shù)主要指ITS、IGS以及基于基因組測序技術(shù)的序列分析。DNA條形碼技術(shù)包括ITS條形碼和蛋白編碼基因條形碼，如EF-1α、β-tubulin等。概述了近年來食用菌菌種分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域的研究進(jìn)展，提出了食用菌菌種分子檢測技術(shù)的發(fā)展建議，為食用菌菌種的快速準(zhǔn)確鑒定及品種選育等提供參考。

關(guān)鍵詞：菌種真實性檢測；分子標(biāo)記；品種鑒定；機(jī)器學(xué)習(xí)；CRISPR/Cas系統(tǒng)

中圖分類號：S646 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）10-009-09

收稿日期：2024-07-18；修回日期：2024-08-08

作者簡介：宋浩源，男，在讀本科生，專業(yè)方向為食用菌學(xué)。E-mail：shy200404060035@163.com

通信作者：趙   鵬，男，副教授，主要從事食用菌分子分類研究。E-mail：zhaop529@hotmail.com

Research progress on molecular biological detection of edible mushroom strains

SONG Haoyuan， ZHAO Peng

（School of Horticulture， Ludong University， Yantai 264025， Shandong， China）

Abstract： In recent years， edible mushroom industry of China has developed rapidly. But the problems such as confusion and unclear source of edible mushroom strains have become important issues restricting the development of the industry. Classic identification methods of edible mushroom strains such as morphologic characteristic observation， analysis of variety antagonistic reaction are time-consuming and inaccurate sometimes. The continuous progress of molecular biology technology has provided strong technical support for the development of edible mushroom industry and facilitates the detection of edible mushroom strains， variety identification and genetic resource conservation. The molecular methods of edible mushroom strains are DNA marker method， DNA sequence analysis and DNA barcoding. DNA marker techniques include the methods based on molecular hybridization such as RFLP， DNA fingerprinting methods based on PCR technique such as RAPD and novel markers based on the genome sequencing such as SNP and MNP. DNA sequence analysis technique is the analysis of ITS， IGS and the analysis based on genome sequencing. DNA barcoding technique includes the ITS barcoding and house-keeping gene barcoding such as EF-1α， β-tubulin. In this paper， the research progress on the molecular biological detection of edible mushroom strains in recent years was reviewed， and prospects for future molecular detection of edible mushroom strains was addressed， which provided reference for rapid and accurate identification of mushroom strains and variety breeding.

Key words： Mushroom strains authenticity detection; Molecular marker; Variety identification; Machine learning; CRISPR/Cas system

中國食用菌產(chǎn)業(yè)歷經(jīng)40多年的迅速發(fā)展，已然躍升為全球最大的食用菌生產(chǎn)、消費和出口國。2022年全國食用菌總產(chǎn)量4 543.86萬t[1]。種業(yè)是農(nóng)業(yè)的“芯片”，菌種是食用菌產(chǎn)業(yè)的命脈和核心競爭力。隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，食用菌菌種混亂、來源不清等問題已成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。通過對食用菌菌種的檢測可鑒定菌種真實性，同時也可篩選具有優(yōu)良性狀的菌種為選育新品種提供支持[2]。對食用菌育種人員來說，準(zhǔn)確鑒定菌種，是培育新品種的基礎(chǔ)。此外，鑒定食用菌品種，對保障品種權(quán)利具有重要意義。通過對新品種的認(rèn)定，保證了新品種的質(zhì)量，防止了侵權(quán)、不正當(dāng)競爭，保護(hù)了新品種發(fā)明者的合法權(quán)利[3]。

傳統(tǒng)的食用菌菌種鑒定方法，如形態(tài)學(xué)特征觀察、品種拮抗試驗及同工酶電泳等，雖然在一定程度上能夠滿足需求，但存在鑒定周期長、準(zhǔn)確度不高等問題[4]。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，與食用菌有關(guān)的遺傳學(xué)與分類學(xué)研究大量開展，使分子生物學(xué)手段在食用菌菌種鑒定方面的應(yīng)用范圍得到了進(jìn)一步的擴(kuò)展，為食用菌品種鑒定與種質(zhì)資源保護(hù)等提供有力的技術(shù)支撐。分子鑒定技術(shù)作為一種新興的技術(shù)手段，在食用菌菌種鑒定中發(fā)揮著越來越重要的作用。常用的分子生物學(xué)檢測技術(shù)有DNA分子標(biāo)記技術(shù)、DNA序列分析[5]與DNA條形碼技術(shù)等。

1 DNA分子標(biāo)記技術(shù)

廣義的分子標(biāo)記指在分子水平上可標(biāo)識的基因組中任何點位上的相互差異（遺傳多樣性）。狹義的分子標(biāo)記是指可標(biāo)識的核苷酸序列多態(tài)性[6]。分子標(biāo)記與遺傳標(biāo)記相比具有以下優(yōu)點：（1）在生物體發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標(biāo)記分析；（2）大多數(shù)分子標(biāo)記是共顯性遺傳；（3）基因組變異極其豐富，分子標(biāo)記的數(shù)量幾乎是無限的[7]?；趯NA多態(tài)性的檢測手段，可將其分為三類[8]：一是以分子雜交為基礎(chǔ)的DNA標(biāo)記技術(shù)，如RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性片段長度多態(tài)性），二是以PCR為基礎(chǔ)的各種DNA指紋技術(shù)，如RAPD（random amplified polymorphismic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性）、AFLP（amplified fragment length polymorphism，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）、SSR（simple sequence repeat，簡單重復(fù)序列）、ISSR（inter-simple sequence repeat，簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性）等，三是以測序為基礎(chǔ)的新型分子標(biāo)記，如SNP（single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）、MNP（multiple nucleotide polymorphism，多核苷酸多態(tài)性）等。根據(jù)需要選擇適合的分子標(biāo)記技術(shù)，或聯(lián)合不同的標(biāo)記技術(shù)為食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供保障。

1.1 RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）技術(shù)

RFLP是最早期的分子標(biāo)記技術(shù)之一。RFLP是指基因型之間限制性片段長度的差異，這種差異是由限制性酶切位點上堿基的插入、缺失、重排或點突變所引起的[9]。1995年，RFLP成功應(yīng)用在食用菌菌株鑒定中[10]，后來廣泛應(yīng)用到食用菌的遺傳研究和種群結(jié)構(gòu)分析中。使用3種不同的RFLP標(biāo)記和3種不同的AP-PCR（arbitrarily primed PCR，隨機(jī)引物PCR）引物，成功地區(qū)分了2種草菇Volvariella volvacea和V. bombycina[11]。使用限制性內(nèi)切酶Hae III和Bst F51消化ITS（internal transcribed spacer，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)片段）成功鑒定出大多數(shù)北半球的冬菇屬Flammulina物種，使用另外兩種酶Bgl Ⅰ和Bst UI消化金針菇F. velutipes得到了更多的限制性片段，并且這些片段與特定的地理分布相關(guān)聯(lián)[12]。目前，基于指紋圖譜技術(shù)發(fā)展起來的PCR-RFLP技術(shù)因具有操作簡單、成本低、重復(fù)性好等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于物種鑒定[13]。通過對58個白靈側(cè)耳Pleurotus nebrodensis菌株ITS特異性擴(kuò)增和克隆測序，建立ITS-RFLP技術(shù)，成功實現(xiàn)了對白靈側(cè)耳菌種的分子檢測[14]。不過，由于成本較高，檢測技術(shù)繁雜，RFLP標(biāo)記難以用于大規(guī)模生產(chǎn)實踐中[15]。

1.2 RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性）技術(shù)

RAPD標(biāo)記由Williams等[16]和Welsh等[17]于1990年創(chuàng)立。該技術(shù)使用1～2個隨機(jī)引物（一般8～10個堿基）非定點地擴(kuò)增基因組DNA，然后經(jīng)凝膠電泳分離后，檢測其擴(kuò)增片段多態(tài)性[18]。待測菌株基因組DNA如果在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生片段插入、缺失或堿基突變，有可能導(dǎo)致引物結(jié)合位點的分布發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子質(zhì)量變化。若PCR產(chǎn)物增加或缺少，則產(chǎn)生RAPD標(biāo)記。RAPD技術(shù)是一種簡單、快速、準(zhǔn)確的食用菌菌種鑒定方法[19]。目前，已被廣泛應(yīng)用于食用菌菌種鑒定與遺傳多樣性研究中。利用RAPD技術(shù)和聚類分析對木耳屬Auricularia不同種和種內(nèi)不同菌株進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果表明，RAPD技術(shù)能夠有效地用于木耳屬物種或菌株的快速準(zhǔn)確鑒定[20]。使用RAPD技術(shù)分析了野生紅菇Russula sp.子實體和從中分離的3種菌株的DNA多樣性，對分離得到的3個菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明這3個菌株為同一個種[21]。對46個側(cè)耳屬Pleurotus菌株進(jìn)行RAPD分析和酶譜分析，結(jié)合生態(tài)和形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)，探討了這些菌株的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系[22]。利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對8個黑木耳Auricularia auricula生產(chǎn)菌株進(jìn)行分子鑒定，通過NTSYS軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示這些菌株之間的遺傳相似性在0.53～0.97之間，遺傳差異較大，為黑木耳種質(zhì)資源的研究提供了科學(xué)依據(jù)[23]。RAPD標(biāo)記的試驗條件摸索和引物選擇是十分關(guān)鍵而艱巨的任務(wù)，通過對試驗條件的標(biāo)準(zhǔn)化，可以提高RAPD標(biāo)記的再現(xiàn)性[24]。

1.3 AFLP（擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）技術(shù)

AFLP標(biāo)記技術(shù)是對限制性酶切片段的選擇性擴(kuò)增。其原理是通過限制性內(nèi)切酶水解基因組DNA 產(chǎn)生不同大小的DNA片段，再利用PCR技術(shù)將這些片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，最后在高分辨率凝膠上通過電泳檢測擴(kuò)增片段的長度多態(tài)性[25]。鑒于AFLP標(biāo)記的多態(tài)性強，一次可檢測到100～150個擴(kuò)增產(chǎn)物，因而非常適合繪制品種指紋圖譜及進(jìn)行分類研究[26]。應(yīng)用AFLP分析建立了糙皮側(cè)耳Pleurotus ostreatus的DNA指紋圖譜，計算了菌株間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，并通過UPGMA法進(jìn)行了聚類分析。研究結(jié)果顯示，14個菌株被分為6個組，其中P17和雜3、閩31和義平分別表現(xiàn)出密切的遺傳關(guān)系，這與它們的地理分布和最佳生長溫度相一致，為糙皮側(cè)耳的分子鑒定和遺傳研究提供了重要數(shù)據(jù)[27]。對31個香菇Lentinula edodes主要栽培菌株的DNA多態(tài)性進(jìn)行分析研究，得到443條擴(kuò)增條帶，其中189條為共有帶，多態(tài)性比率為57.34%，表明香菇菌種間存在一定程度的遺傳多樣性，為香菇種質(zhì)資源的鑒定提供了可靠的分子生物學(xué)依據(jù)[28]。應(yīng)用4個香菇品種（LB-21、L808、215和B15-1）的AFLP分子標(biāo)記，分析其遺傳多樣性，為香菇品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究提供了重要數(shù)據(jù)[29]。AFLP結(jié)合了RFLP和RAPD兩種技術(shù)的優(yōu)點，但分析成本較高，對DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求也較高[30]。

1.4 SSR（簡單重復(fù)序列）技術(shù)

SSR標(biāo)記是由一類1～6個堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，長度一般較短，并廣泛分布于基因組的不同位置，具有較高的多態(tài)性。其原理是根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端的單拷貝序列設(shè)計1對特殊引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增每個位點的微衛(wèi)星DNA序列，通過電泳分析核心序列的長度多態(tài)性[31]。利用200對SSR標(biāo)記分析了25份常用香菇栽培菌種的遺傳多樣性，結(jié)果顯示供試材料的遺傳相似性較高，平均遺傳相似系數(shù)為0.776，成功構(gòu)建了11份香菇商業(yè)菌種的多位點SSR指紋圖譜，為香菇菌種的真實性鑒定提供了新的方法，具有重要的應(yīng)用價值[32]。從雙孢蘑菇Agaricus bisporus的基因組中鑒定了3134個SSR位點，并開發(fā)了17個多態(tài)性引物對。研究結(jié)果顯示，這些SSR標(biāo)記能夠準(zhǔn)確地識別所測試的11個商業(yè)栽培品種，其中AB_SSR_2341和AB_SSR_2590兩個標(biāo)記組合可以區(qū)分所有品種。該研究為雙孢蘑菇品種保護(hù)和分子輔助育種提供了有效的技術(shù)手段[33]。利用MISA軟件在靈芝Ganoderma lucidum全基因組中掃描到4038個SSR位點，設(shè)計出1442對引物，并通過試驗驗證篩選出44對有效SSR引物。利用這些引物對11份靈芝種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性評估，結(jié)果表明，供試材料的遺傳距離在0.120～0.962，可以分為3大類。表明靈芝全基因組SSR分子標(biāo)記技術(shù)可用于種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性分析，這對推動靈芝產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展具有重要意義[34]。使用SSR-PCR對白肉靈芝Ganoderma leucocontextum進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明SSR標(biāo)記技術(shù)在遺傳多樣性分析中表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，可用于白肉靈芝菌種鑒定[35]。利用13個大球蓋菇Stropharia rugosoannulata菌株和已公布的基因組數(shù)據(jù)，設(shè)計了100對SSR引物進(jìn)行試驗驗證。發(fā)現(xiàn)了6種SSR類型，其中三核苷酸類型最為常見。通過驗證試驗獲得了16對引物，其中3對引物（DQGSSR020、DQGSSR031、DQGSSR077）表現(xiàn)出高多態(tài)性、特異性和無雜峰。這些引物被用于構(gòu)建大球蓋菇DNA指紋編碼，建立了13個大球蓋菇菌株的32位數(shù)分子指紋數(shù)據(jù)庫編碼[36]。但應(yīng)用SSR標(biāo)記建立新的標(biāo)記時，需要了解重復(fù)序列兩端的序列信息，所以開發(fā)起來具有一定難度，成本也比較高[37]。

1.5 ISSR（簡單重復(fù)序列區(qū)間）技術(shù)

ISSR是基于微衛(wèi)星DNA的分子標(biāo)記方法。通過設(shè)計特定的引物，這些引物能夠與基因組中的SSR序列結(jié)合，并在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增這些位點。擴(kuò)增產(chǎn)物通過電泳或毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行分析，不同的SSR重復(fù)模式會導(dǎo)致產(chǎn)物大小不同，從而可以識別個體之間的遺傳差異[38]。ISSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、簡便快速、分辨率高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于植物和微生物的種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性分析等領(lǐng)域。食用菌ISSR相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)適用于若干側(cè)耳屬食用菌、香菇、黑木耳、灰樹花、金針菇、滑菇、茶樹菇、雞腿菇等菌種的真實性鑒定[39]。利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對6種不同來源的金針菇菌株進(jìn)行了分子鑒定。從20條ISSR引物中篩選出8條可用引物，共獲得136條DNA片段，其中多態(tài)性條帶占比81.6%。通過UPGMA軟件進(jìn)行聚類分析，將供試金針菇菌株分為3個組群。結(jié)果顯示，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可有效用于金針菇生產(chǎn)菌株的快速準(zhǔn)確鑒定，是金針菇指紋圖譜分析的有效工具[40]。通過對24個黑木耳菌株的分析，發(fā)現(xiàn)酯酶同工酶酶譜可擴(kuò)增出11條不同遷移率的酶帶，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)則擴(kuò)增出67條清晰的DNA多態(tài)性片段；聚類分析顯示，當(dāng)遺傳系數(shù)為0.74時，菌株分為兩大類。研究結(jié)果與拮抗試驗結(jié)果基本一致，為黑木耳菌株的選擇及遺傳育種提供了參考依據(jù)[41]。采用ITS序列分析和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合拮抗試驗，對18個靈芝菌株進(jìn)行鑒定和遺傳多樣性分析。研究結(jié)果表明，所有菌株均屬于赤芝Ganoderma sichuanense，并可細(xì)分為4個類群，拮抗試驗結(jié)果顯示，79.7%的菌株之間存在拮抗現(xiàn)象，可分成7個類群；ISSR分析顯示，菌株的遺傳相似系數(shù)平均為0.652 9，當(dāng)相似系數(shù)約為0.679時，也可以分為7個類群。綜合分析表明，靈芝菌株表現(xiàn)出明顯的遺傳多樣性，且基于ISSR的分類結(jié)果與基于ITS序列分析和拮抗試驗結(jié)果的分類一致[42]。ISSR技術(shù)的缺點是在PCR擴(kuò)增過程中需要一定時間摸索最適反應(yīng)條件[43]。

ISSR標(biāo)記具有重復(fù)性高、穩(wěn)定性好的特點，用其轉(zhuǎn)化的SCAR（sequence characterized amplified regions，特定序列擴(kuò)增）標(biāo)記則更加可靠。采用ISSR標(biāo)記技術(shù)對34個黑木耳栽培菌株進(jìn)行DNA指紋分析，構(gòu)建DNA指紋圖譜，成功將2個黑木耳栽培菌株中的ISSR特異性DNA帶轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，用于快速準(zhǔn)確鑒定黑木耳栽培菌株[44]。通過拮抗試驗、現(xiàn)蕾出菇試驗和ISSR圖譜分析，獲得秀珍菇Pleurotus geesteranus菌株的ISSR特異性標(biāo)記，并將其克隆和測序。利用Primer 6.0軟件設(shè)計了SCAR引物，并通過PCR擴(kuò)增驗證了該標(biāo)記的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，該ISSR-SCAR標(biāo)記能夠以100%的準(zhǔn)確率鑒定低溫刺激型秀珍菇菌株，為秀珍菇種質(zhì)資源的鑒定和分類提供了技術(shù)支持[45]。

1.6 SNP（單核苷酸多態(tài)性）技術(shù)

SNP是指基因組水平上單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性。通過設(shè)計特異性引物或探針，結(jié)合PCR擴(kuò)增和先進(jìn)的檢測技術(shù)，可以實現(xiàn)對SNP位點的精確檢測，具有自動化程度高、通量大、速度快等優(yōu)點[46]。隨著第三代基于測序技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)展，使得密集標(biāo)記圖譜和基因分型成為可能[47]。

利用重測序數(shù)據(jù)分析了8個金針菇菌株的基因組，發(fā)掘金針菇特異性標(biāo)記，共鑒定出1 840 620個SNP、95 035個InDel （insertion deletion，插入或缺失）和63個豐度SNP標(biāo)記區(qū)域。這些標(biāo)記將有助于金針菇的遺傳分析，為分子輔助育種、功能基因發(fā)掘和機(jī)制探索提供支持[48]。對河南香菇主產(chǎn)區(qū)23份香菇種質(zhì)資源進(jìn)行了全基因組重測序，分析了SNP和InDel數(shù)據(jù)，并進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析、進(jìn)化樹構(gòu)建和主成分分析。結(jié)果顯示，這些香菇樣本的遺傳多樣性較低，可分為3個譜系，推測至少有3個祖先遺傳成分。主成分分析進(jìn)一步驗證了菌株間的親緣關(guān)系，并證明了菌種分支的地域性[49]。傳統(tǒng)方法檢測SNP位點耗時且成本高昂，且只能發(fā)現(xiàn)有限的SNP位點。為了提高效率，可利用限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA，并結(jié)合高通量測序技術(shù)來篩選食用菌SNP位點[50]。

1.7 MNP（多核苷酸多態(tài)性）技術(shù)

MNP分子標(biāo)記是建立在SNP分子標(biāo)記基礎(chǔ)上，通過識別、篩選和設(shè)計目標(biāo)基因組中的多個分散SNP位點，構(gòu)建出具有高精度和高通量的品種鑒定體系[51]。MNP已成功應(yīng)用于水稻、大豆、油菜、茄子、玉米、番茄等作物的品種鑒定[52]。研究人員已在一些常見食用菌如香菇、金針菇、刺芹側(cè)耳等應(yīng)用MNP技術(shù)進(jìn)行菌種分子生物學(xué)鑒定[53-55]。MNP分子標(biāo)記技術(shù)以高度多態(tài)性、高通量特性、準(zhǔn)確性和可靠性以及廣泛適用性等優(yōu)點在食用菌菌種分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力[56]。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，相信MNP分子標(biāo)記技術(shù)將在食用菌菌種的精準(zhǔn)鑒定中發(fā)揮重要作用[57]。

2 DNA序列分析技術(shù)

核酸是生命活動中最基本的遺傳信息單位，同時也是重要的遺傳信息載體，為研究物種的遺傳多樣性提供了大量可靠的資料。通過核酸序列分析，可以直觀地觀察到堿基的轉(zhuǎn)變、顛換、變異趨勢等。對食用菌菌種進(jìn)行序列分析，主要是通過對核糖體DNA及其他基因進(jìn)行序列分析[58]。

2.1 ITS（內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）

ITS片段是核糖體RNA基因簇的一個高變區(qū)，位于18S和28S rRNA基因之間，包括ITS1、5.8S rRNA基因和ITS2區(qū)域。真菌的ITS在物種間頻繁地發(fā)生變化，具有豐富的序列多態(tài)性。所以，在所有的核糖體DNA片段序列中，ITS片段具有更高的效率，可以應(yīng)用于物種的分類鑒定[59]。

對15種常見栽培食用菌的30個菌株進(jìn)行了18S rDNA（核糖體DNA）和ITS序列的測序分析，并使用neighbor-joining（NJ）法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，18S rDNA序列在較高分類水平上表現(xiàn)出極高的相似性，而ITS序列則在較低分類水平上提供了更高的可信度和區(qū)分能力。研究認(rèn)為，結(jié)合18S rDNA和ITS序列分析是一種快速有效的食用菌菌種鑒定方法[60]。采用ITS分子標(biāo)記技術(shù)，對內(nèi)蒙古市場上的11種常見野生食用菌進(jìn)行了分子鑒定。結(jié)果顯示，ITS分析方法能夠辨別外形相似的野生食用菌，為蘑菇市場混偽品種鑒定提供了快速有效的手段[61]。對采集的6種野生蘑菇樣本，利用引物ITS1和ITS4進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行序列分析。結(jié)果顯示，Volvariella volvacea、Trametes elegans、Schizophyllum commune、Pleurotus ostreatus、Ganoderma lucidum和Trametes gibbosa的序列分別與數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)物種序列匹配，相似性為97%～100%[62]。

ITS序列在進(jìn)化過程中存在著高度保守、進(jìn)化緩慢、分化程度低等缺陷[63]。對側(cè)耳屬Pleurotus 16個種38個菌株的ITS序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，側(cè)耳屬各物種的ITS序列種內(nèi)趨異度極小，但種間趨異度較大，其中P. rattenburyi和P. djamor之間的趨異度最大，為0.282。研究認(rèn)為，ITS序列差異2%～3%作為傘菌中種的鑒定臨界值在側(cè)耳屬中并不合適，且對P. ostreatus和P. cornucopiae的準(zhǔn)確鑒定需要開發(fā)新的分類鑒定標(biāo)記[64]。

2.2 IGS（intergenic spacer，基因間隔區(qū)）

IGS作為核糖體DNA序列中進(jìn)化最迅速的區(qū)段已經(jīng)被廣泛用于真菌的遺傳學(xué)研究[65]。IGS區(qū)域為高變區(qū)，經(jīng)常被用來進(jìn)行種內(nèi)的比較[66]。使用RAPD和IGS標(biāo)記對白靈側(cè)耳菌株進(jìn)行分析，結(jié)果顯示供試菌株間存在多態(tài)性，IGS1區(qū)域較為保守，而IGS2區(qū)域進(jìn)化較快，具有豐富的多態(tài)性。IGS2-RFLP被認(rèn)為比RAPD更穩(wěn)定且具有更好的操作性，適用于白靈側(cè)耳菌株的鑒定[67]。對8個刺芹側(cè)耳Pleurotus eryngii菌株進(jìn)行了IGS2序列的分析，結(jié)果顯示不同菌株在IGS2區(qū)域存在長度異質(zhì)性和數(shù)量多態(tài)性，結(jié)合RFLP可實現(xiàn)對刺芹側(cè)耳菌種的有效鑒定[68]。利用IGS2和RAPD技術(shù)，分析20個不同斑玉蕈Hypsizygus marmoreus菌株的遺傳差異，結(jié)果顯示IGS2分析與RPAD技術(shù)相結(jié)合的方法準(zhǔn)確可靠，為斑玉蕈菌株的快速準(zhǔn)確鑒定提供了技術(shù)支撐，為斑玉蕈種質(zhì)資源的知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)奠定了基礎(chǔ)[66]。

2.3 基于基因組測序技術(shù)的DNA序列分析

目前，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，完成了越來越多的食用菌全基因組測序。采用二代和三代測序技術(shù)，獲得了金針菇單核菌株6-3的基因組序列，并對其rDNA序列進(jìn)行了深入分析。結(jié)果表明IGS區(qū)域存在豐富的多態(tài)性，包括SNP、InDel和TRS（tandem repetitive sequence，串聯(lián)重復(fù)序列），其中IGS2的多態(tài)性高于IGS1。金針菇rDNA序列的5S、5.8S、18S和28S rDNA序列高度保守，不同拷貝的序列完全一致，而IGS1和IGS2在不同拷貝間存在廣泛的多態(tài)性。說明金針菇rDNA序列中的IGS區(qū)域在種內(nèi)不同菌株間的鑒定中具有應(yīng)用潛力[69]。利用三代測序技術(shù)對毛木耳Auricularia cornea單核菌株B02的基因組進(jìn)行了測序和組裝，并通過二代測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了校正，得到了一個高質(zhì)量的基因組序列。分析發(fā)現(xiàn)，毛木耳的IGS1和IGS2序列高度保守，特別是在IGS1的1400～2200 bp區(qū)域，不同拷貝之間沒有多態(tài)性，但在不同品種之間存在較高的SNP頻率，這一片段有望用于毛木耳品種的鑒定研究[70]。

3 DNA條形碼技術(shù)

DNA條形碼是一種被廣泛認(rèn)可和接受的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段，這種片段擁有豐富的多樣性，能夠在不同物種之間展現(xiàn)出明顯的特異性差異。更為關(guān)鍵的是，這些DNA片段相對較短，便于進(jìn)行擴(kuò)增并能迅速識別。通過對這些特定片段的研究，科學(xué)家們建立了一個先進(jìn)的生物身份識別系統(tǒng)，這個系統(tǒng)能夠?qū)ξ锓N進(jìn)行自動化、快速且準(zhǔn)確地鑒定[71]。其原理是DNA序列由4種不同的堿基構(gòu)成，即A、T、G、C，若一段序列有n個堿基，則LfAXJXcSrdXBCUaXuLu+qQ==有4n種編碼模式。如果計算15個堿基，就可以得到將近10億個片段，比現(xiàn)有的物種多100倍。從這個角度來看，DNA條形碼的編碼工作是基于數(shù)百個堿基的基因序列，基本上包含了全部的物種[72]。通過分析大量動物物種的COI（cytochrome C oxidase subunit I）序列，發(fā)現(xiàn)不同物種之間的COI序列差異足以用來區(qū)分大多數(shù)動物物種，尤其是在昆蟲和其他一些動物群體中，并明確提出使用短的DNA片段來快速準(zhǔn)確地識別物種的概念[71]。2003年首次提出了國際生命條形碼計劃（iBOL，International Barcode of Life Project）[73]。成為DNA條形碼需滿足以下條件：（1）DNA片段必須是一個標(biāo)準(zhǔn)片段，以確定可能的不同類群；（2）目的DNA區(qū)域應(yīng)含有足以確定該物種在該分類系統(tǒng)（科、屬等）中的系統(tǒng)發(fā)育信息；（3）應(yīng)有保守的引物設(shè)計區(qū)域，方便設(shè)計一般引物；（4）有足以區(qū)別不同種類的變異；（5）目的 DNA片段應(yīng)足夠短，以促進(jìn)DNA片段的擴(kuò)增。目前，用于菌物研究的備選片段有COI、nrDNA-LSU、 nrDNA-SSU、ITS和trnL[74-78]。

3.1 COI

COI基因是第一個生物 DNA條碼，它已應(yīng)用于動物的物種鑒定，其在真菌中也得到了應(yīng)用[79]。但COI是線粒體內(nèi)含子數(shù)量最多的一種，其內(nèi)含子長度可在20 kb以上，限制了其擴(kuò)增效率。因此，COI基因不宜用作食用菌的條形碼[80-81]

3.2 ITS

ITS序列在食用菌的快速鑒定中有著廣泛應(yīng)用，并且已成為食用菌物種鑒定的通用條形碼[82]。ITS序列在食用菌物種間的差異明顯，而在同一物種不同個體之間的差異很小，是真菌分類的可靠分子標(biāo)記，能夠有效區(qū)分不同物種[83]。有研究顯示，ITS序列可作為木耳屬22個菌株的DNA條形碼[84]。ITS序列作為DNA條形碼，能夠快速準(zhǔn)確地鑒定傘菌類真菌[85]。利用DNA條碼技術(shù)對來自不同產(chǎn)地的24份黑木耳樣品進(jìn)行了產(chǎn)地溯源研究。結(jié)果顯示，ITS條碼能夠清晰溯源東北和未知地的樣品[86]。使用紫芝Ganoderma sinense S2基因組rDNA的ITS2生成的 DNA條形碼與二維碼，可以作為該栽培品種鑒定與同源物種其他菌株鑒定的分子標(biāo)記[87]。

3.3 其他蛋白編碼DNA條形碼片段

ITS條形碼有時會出現(xiàn)種間變異較小的問題，其他一些蛋白編碼基因也常用來作為食用菌菌種的DNA條形碼。ITS、28S rDNA和EF-1α（elongation factor-1α，翻譯延伸因子）基因作為候選DNA條形碼標(biāo)記，測試側(cè)耳屬13個物種的菌種鑒定效果。研究結(jié)果顯示，EF-1α基因在食用菌物種鑒定中表現(xiàn)最佳，它能夠區(qū)分84.6%的測試物種，并且在PCR擴(kuò)增和序列獲取方面具有較高的成功率[88]。使用ITS、β-tubulin（β-微管蛋白）片段、LSU（large subunit，核糖體RNA大亞基基因）片段和RPB2（RNA polymerase second largest subunit， RNA聚合酶Ⅱ第二大亞基基因）4個DNA條形碼，對44份靈芝屬Ganoderma菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序。結(jié)果表明β-tubulin和RPB2片段的種內(nèi)最大遺傳距離分別小于各自的種間最小遺傳距離，存在明顯的DNA條形碼間隔（DNA barcoding gap，DBG），有利于準(zhǔn)確進(jìn)行種間鑒定。綜合評估認(rèn)為，β-tubulin片段更適用于靈芝屬種間鑒定，為靈芝快速分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析提供了有效工具[89]。利用DNA條形碼技術(shù)對常見食用真菌及易混淆的野生有毒真菌進(jìn)行分子鑒定，發(fā)現(xiàn)ITS2、nr LSU和EF1-α可以作為DNA條形碼，有效區(qū)分食用真菌與有毒真菌[90]。

4 展 望

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展和成本的持續(xù)下降，在全基因組分析的基礎(chǔ)上結(jié)合測序或非測序技術(shù)如基因編輯技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)食用菌菌種的快速、準(zhǔn)確鑒定。CRISPR-Cas12a系統(tǒng)可提供一種高特異性和高靈敏度的食用菌菌種鑒定方法，在推動下一代基于全基因組的物種鑒定技術(shù)發(fā)展中具有巨大潛力，該方法結(jié)合可視化熒光技術(shù)，甚至可以實現(xiàn)30 min內(nèi)現(xiàn)場快速精準(zhǔn)鑒定食用菌[91]。今后，應(yīng)不斷優(yōu)化、開發(fā)應(yīng)用更多的基因編輯技術(shù)用于食用菌菌種的快速精確檢測。全基因組選擇（genomic selection，GS）即利用覆蓋全基因組的高密度分子遺傳標(biāo)記進(jìn)行的標(biāo)記輔助選擇?；谌蚪M測序數(shù)據(jù)篩選多態(tài)性分子標(biāo)記，構(gòu)建序列庫，進(jìn)一步篩選出核心標(biāo)記，結(jié)合生物信息學(xué)工具分析，能夠?qū)κ秤镁N進(jìn)行高效檢測[33-34，36，92]。面對海量的測序數(shù)據(jù)，人工智能 （artificial intelligence，AI），特別是機(jī)器學(xué)習(xí)（machine learning，ML）逐漸被引入到生命科學(xué)領(lǐng)域[93]。機(jī)器學(xué)習(xí)作為人工智能的一個重要分支，具有強大的數(shù)據(jù)處理和分析能力，在全基因選擇中表現(xiàn)出色，能夠處理大量的遺傳標(biāo)記并有效減少擬合。機(jī)器學(xué)習(xí)已被成功應(yīng)用在植物SNP標(biāo)記篩選中[94]，為食用菌菌種分子生物學(xué)檢測提供了寶貴經(jīng)驗。同時，食用菌菌種的分子生物學(xué)檢測方法可與基于機(jī)器學(xué)習(xí)的食用菌表型組學(xué)分類與識別技術(shù)相結(jié)合，更全面、更快速有效地識別食用菌品種，相較于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定，在準(zhǔn)確度、無損檢測、自動化、適應(yīng)性和可擴(kuò)展性方面都具有顯著優(yōu)勢。機(jī)器學(xué)習(xí)方法也被引入植物DNA條形碼分析中[95-97]，這為基于機(jī)器學(xué)習(xí)的食用菌菌種DNA條形碼檢測提供了方法學(xué)參考和有益借鑒。

此外，DNA條形碼信息可以跨平臺轉(zhuǎn)換，即利用開源代碼將這些DNA條形碼序列轉(zhuǎn)換成二維碼圖片[98]。這些二維碼可以被掃描并提交到食用菌菌種DNA條形碼數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定，從而確保食用菌菌種的真實性和質(zhì)量。該體系有助于提高食用菌菌種流通監(jiān)管的效率和準(zhǔn)確性，推動菌種流通監(jiān)管的現(xiàn)代化和國際化。

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