PPP2R1A對Hela細胞系中調節(jié)癌癥相關基因表達的影響

【關鍵詞】PPP2R1A；Hela細胞系；癌癥；選擇性剪接；細胞增殖

惡性腫瘤細胞的凋亡、增殖和分化過程受多種基因調控的影響。因此，探索影響惡性腫瘤細胞生物學行為的基因及其調控機制至關重要。Hela細胞系源于宮頸癌上皮細胞，被廣泛用于腫瘤研究。PPP2R1A是蛋白磷酸酶2（PP2A）的結構亞基，在PP2A全酶的催化過程具有支架和連接的作用[1]。既往研究顯示，PP2A參與細胞生理的各個方面，如代謝、轉錄、RNA剪接等[2-3]。本研究通過檢測過表達PPP2R1A的Hela細胞系的增殖情況，驗證PPP2R1A的基因表達和選擇性剪接（AS）特性，并在Hela細胞系中驗證PPP2R1A對選擇性剪接基因（ASGs）的調控作用。

1材料與方法

1.1實驗材料本研究以宮頸癌細胞株Hela細胞系為研究對象，其來源于武漢大學中國典型培養(yǎng)物寶藏中心。

1.2研究方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和轉染在培養(yǎng)基中培養(yǎng)Hela細胞系，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清[ThermoFisherScientific（Gibco），批號：A2910153RP，規(guī)格：500mL/瓶]、100μg/mL鏈霉素[ThermoFisherScientific（Gibco），批號：217052，規(guī)格：100mL/瓶]和100U/mL青霉素[ThermoFisherScientific（Gibco），批號：217052，規(guī)格：100mL/瓶]，溫度37℃，在含有5%CO2的環(huán)境中用質粒轉染Hela細胞。48h后收獲轉染的細胞，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測系統(tǒng)（杭州博日科技股份有限公司，國械注準20153220273，型號：FQD-96A）進行RT-qPCR分析和蛋白質印跡分析。

1.2.2克隆與質粒構建使用CEDesignV1.04軟件設計引物對。在37℃下對載體進行2～3h消化，將消化后的載體置于1.0%瓊脂糖凝膠上運行并使用色譜試劑盒。使用TRIzol試劑[ThermoFisherScientific（Gibco），批號：99940001，規(guī)格：100mL/瓶]從Hela細胞系中分離總RNA并將RNA逆轉錄為cDNA。聚合酶鏈反應（PCR）擴增合成插入片段。將EcoRI和XhoI雙酶切線性載體和PCR插入片段添加至PCR微管中，并與克隆試劑盒連接。通過化學轉化將質粒導入大腸桿菌中，于37℃環(huán)境中在含有1μL/mL氨芐西林（OXOID，批號：2187112，規(guī)格：2.5mg/支）的瓊脂平板上培養(yǎng)16h。最后，通過菌落PCR（28個循環(huán)）分析，利用位于骨架載體上的通用引物篩選菌落。對插入序列進行測序驗證，見表1。

1.2.3PPP2R1A過表達的評估以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因為對照，評估PPP2R1A的過表達情況。在RT-qPCR檢測系統(tǒng)上按照RT-qPCR的標準程序生成cDNA。

1.2.4噻唑藍法分析噻唑藍（MTT）法測定細胞增殖情況。將標記的Hela細胞（1×104）用200μL細胞生長培養(yǎng)基接種于96孔培養(yǎng)板中。在細胞達到70%的合流后，37℃培養(yǎng)48h。每孔加入MTT溶液25μL（5mg/mL），孵育4h后采用離心機離心10min（轉速為1000r/min，半徑為8cm），每孔取上清液。將MTT（0.15mL/孔）中的彩色甲醛晶體用二甲基亞砜（DMSO）溶解，在490nm處測量光密度值（OD）。

1.2.5RNA提取與測序使用TRIzol作為RNA提取試劑。用兩種酚-氯仿處理純化RNA，用R66b0f42e84fa6731d43f550702b671711e73d3b2e89eab689e3ab78dff8e07f9Q1DNA酶（Promega，規(guī)格：1000U/瓶）去除DNA。采用紫外可見光分光光度計（伯樂實驗有限公司，型號：SmartSpecPlus）檢測其在260/280nm處的吸光度值，重新檢測其質量和數(shù)量，并使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進一步驗證RNA的完整性。每個樣本使用1μg總RNA，制備RNA-測序文庫。經(jīng)過末端修復和a-尾處理步驟后，DNA連接到適配器。純化200～500units的不耐熱尿嘧啶DNA糖基酶（UDG）連接產(chǎn)物，單鏈cDNA于-80℃保存后測序。使用高通量測序進行文庫制備，并在系統(tǒng)上進行測序，生成150nt的配對端產(chǎn)物。利用TopHat2軟件[4]對GRCH38基因組進行定位后，73.19%～72.62%的基因組進行比對，其中92.86%～91.92%為唯一比對。比較過表達組和對照樣本的基因表達模式，表達值以每千堿基外顯子模型每百萬片段映射（FPKM）為單位。

1.2.6差異表達基因分析采用edgeR軟件[5]篩選差異表達基因（DEGs），以錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.05和折疊變化（FC）>2.0或FC<0.5作為鑒定DEGs的截止標準。根據(jù)DEGs功能的不同進行分類，利用KOBAS2.0服務器建立基因本體術語、京都基因與基因組百科全書（KEGG）的路徑[6]。使用超幾何檢驗和Benjamini-HochbergFDR控制程序來確認每個術語的富集程度。

1.2.7備選剪接事件分析識別和量化樣品之間的酶和控制酶：在每個樣本中，鑒定出10個典型的AS。采用Student'st檢驗RNA結合蛋白（RBP）調節(jié)AS的發(fā)生率變化意義。以FDR<0.05為RBP調控的AS事件。

1.2.8RT-qPCR驗證DEGs和備選剪接事件對所選的DEGs進行RT-qPCR實驗，使用SYBRGreenPCR試劑盒，在系統(tǒng)上對cDNA進行實時PCR。PCR條件為：95℃變性10min，95℃變性15s，60℃退火，延長1min，共40個循環(huán)。

1.3觀察指標⑴分析PPP2R1A在Hela細胞系中的表達及抑制細胞增殖情況。⑵分析PPP2R1A調控Hela細胞基因表達情況。⑶分析PPP2R1A調控的DEGs在腫瘤轉移相關功能中的富集情況。⑷分析PPP2R1A參與調節(jié)癌癥通路相關基因的AS情況。

1.4統(tǒng)計學分析采用GraphpadPrism軟件進行配對t檢驗評估PPP2R1A過表達情況。采用edgeR軟件篩選DEGs。以FDR<0.05和FC>2或FC<0.5為截止標準。采用t檢驗評估過表達組與對照組細胞之間AS事件比值變化的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。發(fā)現(xiàn)受調控的AS事件后，使用KOBAS2.0服務器對DEGs進行基因本體論（GO）和KEGG富集分析。

2結果

2.1PPP2R1A在Hela細胞系中的表達及抑制細胞增殖情況分析過表達組Hela細胞增殖低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖1。

2.2PPP2R1A調控Hela細胞系中的793個基因在過表達組和對照組細胞上構建cDNA文庫，通過RNA-seq獲得過表達組的全球轉錄組譜。去除適配子序列和低質量測序reads后，獲得了（87.0±11.1）×106個有效序列（cleanreads）。PPP2R1A的有效過度表達在RNA-seq評估中得到了進一步證實，見圖2A。樣本相關熱圖的對角線顯示，過表達組與對照組細胞之間存在相關性，生物重復顯著相關，見圖2B。最終鑒定出與PPP2R1A相關的510個上調基因和283個下調基因。構建與PPP2R1A過表達相關的DEGs火山圖，見圖2C。對RNA-seq樣本中DEGs的表達模式進行的熱圖分析，結果顯示，PPP2R1A調節(jié)的轉錄在兩個數(shù)據(jù)集中具有高度一致性，見圖2D。

2.3PPP2R1A調控的DEGs在腫瘤轉移相關功能中的富集情況分析受PPP2R1A上調和下調影響的基因涉及多種細胞生物過程，選擇與腫瘤轉移的相關DEGs進行RT-qPCR驗證分析，結果顯示，參與腫瘤轉移的相關基因[高遷移率族蛋白A2抗體（HMGA2）、人整合素α2（ITGA2）、基質金屬蛋白酶3（MMP3）、胃蛋白酶原C（PGC）、E盒結合鋅指蛋白2（ZEB2）、內(nèi)皮素2（EDN2）]測序數(shù)據(jù)與RT-qPCR均在過表達組中高表達，兩者結果高度一致，見圖3、圖4。

2.4PPP2R1A參與調節(jié)癌癥通路相關基因的AS分析從PPP2R1A過表達和對照Hela細胞中檢索了（56.0±2.6）×106個唯一映射的讀取。將這些唯一映射的讀取與參考的基因組注釋進行比較，并使用ABLas軟件分析來自RNA-seq數(shù)據(jù)集的AS事件。結果顯示，PPP2R1A全局調節(jié)Hela細胞系中的AS事件，見圖5A、圖5B。將表達水平和AS受PPP2R1A調控的基因重疊，確定了6個基因。在GO評估的生物學過程中，顯示受PPP2R1A介導AS調控的基因在有絲分裂、纖毛組裝、血液凝固和血小板活化方面高度富集，見圖5C。富集的KEGG通路包括參與細胞周期、糖胺聚糖降解、RNA轉運、慢性髓性白血病和EB病毒感染的通路，見圖5D。腺苷酸活化蛋白激酶3（SMAD3）、細胞周期蛋白依賴性激酶7（CDK7）和絡氨酸激酶受體2（ERBB2）中的AS事件，見圖5E、圖5F、圖5G。

3討論

RBP是一類伴隨RNA調節(jié)代謝過程和RNA結合的蛋白質的總稱，這些蛋白可能通過調節(jié)各種RNA代謝步驟影響轉錄后調控，包括前RNA剪接和多聚腺苷酸化、mRNA穩(wěn)定性、mRNA定位和mRNA翻譯[7]。既往研究認為，PPP2R1A具備RNA結合功能[8]。本研究結果顯示，在Hela細胞系中過表達PPP2R1A后，其細胞增殖受到抑制。本研究使用RNA-seq全面闡明在Hela細胞中PPP2R1A調控的轉錄組譜，發(fā)現(xiàn)510個基因表達上調，283個基因表達下調，提示PPP2R1A顯著影響Hela細胞系的基因表達。本研究DEGs分析發(fā)現(xiàn)，PPP2R1A在Hela細胞系中過表達調控腫瘤轉移相關基因的表達，這可能與其RNA結合功能有關。

PP2A是可逆性磷酸化建立信號轉導的關鍵。在這一過程中參與翻譯后修飾的酶是催化蛋白質磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酶，而蛋白磷酸酶又可從已經(jīng)磷酸化的蛋白質底物中去除磷酸基。磷酸鹽的存在或缺失會因底物的不同，從而對修飾蛋白的生物活性產(chǎn)生正向或負向的影響。PPP2R1A蛋白是蛋白磷酸酶PP2A的結構亞基，PP2A直接和間接地影響許多與癌癥進展或抑制相關的信號通路，這些下游信號通路可能包括調控細胞凋亡、細胞增殖、細胞周期進程和腫瘤發(fā)生等方面[9]。

本研究結果顯示，PPP2R1A廣泛調控數(shù)百個基因的前體mRNA的AS。PPP2R1A過表達后剪接水平改變的基因在GO分析中被富集。AS事件的發(fā)生對轉錄調節(jié)有廣泛影響。通過對SMAD3、CDK7和ERBB2中的AS事件分析，表明PPP2R1A通過調節(jié)必需細胞周期相關基因的AS在腫瘤發(fā)生中起關鍵作用。SMAD3基因是轉化生長因子-β（TGF-β）信號通路的關鍵成員，有研究認為，白細胞介素（IL）-33可能通過IL-33/ST2軸上調TGF-β1/Smad3信號通路，誘導細胞上皮間質轉化的形成[10]。CDK7在轉錄后水平受到調控，產(chǎn)生多種轉錄本，在細胞周期中調節(jié)其表達。ERBB2是一種受體酪氨酸激酶，屬于人表皮生長因子受體激酶家族。在某些實體瘤中，ERBB2突變也可以作為評估化療療效的獨立生物標志物[11]。

綜上所述，PPP2R1A可能通過影響AS來調控相關基因的潛在轉錄，從而對腫瘤的發(fā)展進程產(chǎn)生影響。上述結果可能為理解PPP2R1A在癌癥發(fā)展中的角色提供了新的視角，并為未來的癌癥治療策略開發(fā)提供了潛在的靶點。