一株牙鲆源哈維氏弧菌的分離鑒定及抗性研究

摘要：自秦皇島昌黎養(yǎng)殖的患病牙鲆 （Paralichthys olivaceus）體內(nèi)分離獲得一株革蘭氏陰性菌，對其形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA序列進(jìn)行分析，鑒定其為哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）；對分離菌株進(jìn)行了30種抗菌藥的藥敏試驗和11株益生菌的拮抗試驗，得出此分離菌株對米諾環(huán)素、左氧氟沙星、頭孢他啶、氟苯尼考、頭孢曲松、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、強力霉素、復(fù)方新諾明等13種藥物高度敏感，對克林霉素、青霉素、氨芐西林、林可霉素、苯唑西林等9種藥物表現(xiàn)為不同程度的耐藥性；地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌2種益生菌在一定濃度下對其具有拮抗作用。

關(guān)鍵詞：牙鲆 （Paralichthys olivaceus）；哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）；分離鑒定；藥敏試驗；拮抗試驗

牙鲆（Paralichthys olivaceus）俗稱牙片、偏口、比目魚、平目、左口等，是渤海灣的重要土著種，也是我國北方遼寧、河北、天津和山東等地的重要魚類增養(yǎng)殖品種[1]。隨著牙鲆養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，各種病害也頻繁發(fā)生，其中細(xì)菌性疾病最為常見。哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）隸屬于弧菌屬（Vibrio）[2]，在自然界中分布廣泛，可廣泛引起海水養(yǎng)殖魚、蝦、蟹等感染發(fā)病[3-9]。本研究從患病牙鲆的病灶處分離出了一株病原菌，通過測序、生理生化等手段進(jìn)行了鑒定，對分離菌株進(jìn)行了常規(guī)抗菌藥的藥敏試驗，同時，利用河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院病害實驗室分離保存的11株益生菌對分離病原菌進(jìn)行了拮抗試驗。本研究希望能夠確定其敏感藥物及具有拮抗作用的益生菌，旨在為牙鲆細(xì)菌性疾病的研究和防控提供參考。

1材料與方法

1.1患病牙鲆

患病牙鲆來自秦皇島昌黎縣某牙鲆養(yǎng)殖場，體質(zhì)量260～470 g/尾。主要癥狀：患病牙鲆體色明顯發(fā)黑；有眼側(cè)部分鱗片脫落、出血；無眼側(cè)鰭邊發(fā)紅；尾鰭鰭條間組織潰爛；鰓絲呈粉紅色，部分鰓絲潰爛；解剖發(fā)現(xiàn)，病魚肝臟有線性淤血，膽囊腫大，腸道無食物、充滿水樣液，中腎呈粉紅色缺血狀，脾臟淤血。

1.2病原菌的分離鑒定

1.2.1病原菌的分離及純化取患病的牙鲆，解剖，分別挑取體表潰爛處、鰓絲潰爛處、腸道內(nèi)容物、中腎等部位劃線接種于2216E和TCBS固體培養(yǎng)基，28 ℃下培養(yǎng)18～24 h；挑選培養(yǎng)基中形態(tài)一致的單個優(yōu)勢菌落進(jìn)行再次劃線接種， 重復(fù)此操作，直至獲得形態(tài)特征完全一致的菌落。記錄菌落的形態(tài)特征。將分離純化的菌落置于終濃度50%的甘油保護劑中， -80 ℃保存。

1.2.2分離菌的鑒定

1.2.2.1生理生化分析鑒定分離純化的菌株暫命名為 VH0522，將隔夜培養(yǎng)的菌落接種于細(xì)菌微量生化鑒定管中， 28 ℃培養(yǎng)，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第九版）[10]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]對VH0522各項生理生化指標(biāo)的測定結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.2.2分子生物學(xué)鑒定利用細(xì)菌總基因組DNA提取試劑盒提取菌株VH0522的DNA，進(jìn)行16S rDNA擴增，采用通用引物（正向引物為27F： 5′-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3′；反向引物為1 492 R： 5′-TACG GTTACCTTGTTACGAC-3′）， 擴增目的片段的序列全長為1 477 bp。將擴增產(chǎn)物送至上海邁浦生物科技有限公司測序。用DNA Sequencing analysis軟件進(jìn)行分析比對。使用MEGA11的Neighbor Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3藥敏試驗

在TCBS培養(yǎng)基上使用30種抗菌藥對分離菌株VH0522進(jìn)行藥敏試驗， 每種藥物設(shè)3個平行。28 ℃ 培養(yǎng)24 h后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑， 測量值取 3個平行的平均值。

1.4益生菌拮抗試驗

在LB固體培養(yǎng)基上采用雙層平板打孔法進(jìn)行益生菌抗性試驗。當(dāng)上層平板經(jīng)滅菌后降溫至45 ℃左右時，加VH0522菌液0.1 mL （濃度為108 CFU/mL）。在加菌液后的上層平板上使用經(jīng)滅菌的打孔器打孔，每個平板上打6個間隔相近的孔，打孔時不能穿過下層培養(yǎng)基，用經(jīng)滅菌的牙簽挑出孔中的上層培養(yǎng)基。每個孔內(nèi)加菌液濃度為104～108 CFU/mL的20 μL益生菌液。每組設(shè)3個平行，1個空白對照。28 ℃培養(yǎng) 24 h后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，判斷不同益生菌在不同菌液濃度下對VH0522的拮抗效果。試驗地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、熱帶芽孢桿菌、阿氏芽孢桿菌、產(chǎn)堿假單胞菌、極小短小桿菌、貝萊斯芽孢桿菌等11種益生菌，益生菌來自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院病害實驗室。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

對VH0522革蘭氏染色后光學(xué)顯微鏡觀察為革蘭氏陰性桿菌。28 ℃培養(yǎng) 24 h后，2216E固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)呈乳白色、圓形，表面光滑； TCBS固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)呈黃色、圓形，表面較光滑。

2.2生理生化特性分析

生理生化結(jié)果顯示，分離菌株VH0522在麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、賴氨酸脫羧酶、明膠、西蒙氏枸櫞酸鹽、甘露醇、氧化酶、鼠李糖、蕈糖、3％氯化鈉堿性蛋白胨水等方面反應(yīng)為陽性；在鳥氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、乳糖、肌醇、山梨醇、阿拉伯糖、七葉苷、木糖、苦杏仁苷、丙二酸鹽、蛋白胨水、水楊素、苯丙氨酸等方面反應(yīng)為陰性，且不能產(chǎn)生硫化氫 （見表1）。參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第九版），發(fā)現(xiàn)分離菌株 VH0522 與哈維氏弧菌的生理生化特性基本一致。

2.3分子生物學(xué)鑒定

將分離菌株VH0522的16S rDNA序列與GenBank 中已公布的序列進(jìn)行BLAST 比對分析，發(fā)現(xiàn)與哈維氏弧菌的同源相似性達(dá)到 9986%。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖 1，結(jié)果顯示與哈維氏弧菌的親緣關(guān)系最近。

綜合菌株VH0522 的表型、生理生化特征及 16S rDNA 測序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果， 可以判定菌株 VH0522 為哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）。

2.4藥敏試驗

藥敏試驗的具體結(jié)果見表2。結(jié)果顯示：菌株VH0522對30種抗菌藥物中的米諾環(huán)素、四環(huán)素、氯霉素、阿奇霉素、左氧氟沙星、亞胺培南、頭孢他啶、氟苯尼考、頭孢曲松、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、強力霉素、復(fù)方新諾明等13種藥物高度敏感，對紅霉素、頭孢呋辛鈉、頭孢哌酮、卡那霉素、鏈霉素、哌拉西林、慶大霉素、阿卡米星等8種藥物敏感，對克林霉素、青霉素、氨芐西林、林可霉素、苯唑西林等其它9種藥物表現(xiàn)為不敏感。

2.5益生菌拮抗試驗

益生菌拮抗試驗的具體結(jié)果見表3。結(jié)果顯示：地衣芽孢桿菌在108 CFU/mL 濃度時表現(xiàn)出較好的拮抗效果，而107 CFU/mL濃度時拮抗效果則明顯降低，而106 CFU/mL以下濃度時則完全沒有拮抗作用；枯草芽孢桿菌的表現(xiàn)與地衣芽孢桿菌相似，在108 CFU/mL濃度時展現(xiàn)出一定拮抗作用， 107 CFU/mL濃度時拮抗效果降低，106 CFU/mL以下濃度時也完全失去拮抗作用。其他9種益生菌在所有濃度時對菌株VH0522都沒有拮抗作用。

3討論

哈維氏弧菌是海水養(yǎng)殖的常見致病菌，已有的報道顯示曾導(dǎo)致多種海水養(yǎng)殖動物患病，從不同養(yǎng)殖動物、不同發(fā)病地區(qū)分離出的哈維氏弧菌表現(xiàn)出不同的藥物敏感性。許悅等[6]對從海南養(yǎng)殖石斑魚潰瘍病上分離鑒定的哈維氏弧菌進(jìn)行了藥敏試驗，結(jié)果顯示對四環(huán)素類藥物高度敏感；滕爽爽等[7]從浙江發(fā)病泥蚶（Tegillarca granosa）上分離鑒定的哈維氏弧菌也對四環(huán)素類藥物高度敏感；郭美玲等[8]從天津養(yǎng)殖的青石斑（Epirzephelas awoara）分離鑒定的哈維氏弧菌同樣對四環(huán)素類藥物高度敏感；以上試驗結(jié)果與本試驗結(jié)果一致。但裴立碩等[5]從天津養(yǎng)殖的點帶石斑魚（Epinephelus coioides）上分離鑒定的哈維氏弧菌卻對部分四環(huán)素類藥物耐藥（四環(huán)素、強力霉素），部分中度敏感（米諾環(huán)素）；孔明慧等[4]從豹紋鰓棘鱸（Plectropomus leopardus）上分離鑒定的哈維氏弧菌對部分四環(huán)素類藥物耐藥（米諾環(huán)素），部分中度敏感（四環(huán)素）?？酌骰鄣萚4]從豹紋鰓棘鱸上分離鑒定的哈維氏弧菌對氨基糖苷類藥物中度敏感，裴立碩等[5]從天津養(yǎng)殖的點帶石斑魚上分離鑒定的哈維氏弧菌對氨基糖苷類藥物也表現(xiàn)為中度敏感，這兩個試驗結(jié)果與本試驗結(jié)果相同；而滕爽爽等[7]從浙江發(fā)病泥蚶上分離鑒定的哈維氏弧菌則對氨基糖苷類藥物高度敏感；許悅等[6]從海南養(yǎng)殖石斑魚潰瘍病上分離鑒定的哈維氏弧菌對氨基糖苷類藥物則表現(xiàn)為耐藥。另外，上述所有藥敏試驗中，哈維氏弧菌對喹諾酮類藥物均表現(xiàn)為高度敏感。以上結(jié)果顯示同一種病原菌的不同菌株間可能在藥物敏感性上存在一定差異，這可能與菌株的來源有關(guān)，不同地區(qū)、分離的不同年份、不同養(yǎng)殖品種或不同養(yǎng)殖模式的養(yǎng)殖業(yè)者的用藥習(xí)慣或用藥方式有很大區(qū)別，其結(jié)果是導(dǎo)致養(yǎng)殖動物體內(nèi)或養(yǎng)殖環(huán)境中的不同菌株的耐藥性出現(xiàn)明顯區(qū)別。蔣魁等[9]、王春艷等[12]、吳越等[13]、胡大勝[14]、鄧玉婷等[15]的研究也得出了相似的結(jié)論。

益生菌現(xiàn)如今已經(jīng)愈來愈被水產(chǎn)養(yǎng)殖從業(yè)者所接受，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用也愈來愈廣泛。益生菌目前主要被養(yǎng)殖業(yè)者應(yīng)用到養(yǎng)殖水體中用來控制或改良水環(huán)境，如改良池塘底質(zhì)，去除水中的氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫等有害物質(zhì)；另外，添加到飼料中用以改善養(yǎng)殖動物的腸道菌群結(jié)構(gòu)、提高飼料利用率。除此外，理論上益生菌還可以在水環(huán)境和養(yǎng)殖動物腸道中拮抗致病菌，尤其是在水環(huán)境中使用消毒劑后，此時病原菌密度相對較低，益生菌可以快速占領(lǐng)生態(tài)位。本研究的結(jié)果顯示，地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌對哈維氏弧菌有一定拮抗作用，但只在107 CFU/mL以上的高濃度時才有一定效果，而其他益生菌均沒有拮抗作用。利用益生菌拮抗條件致病菌來防控病害是減少抗生素使用的有效路徑，目前能夠商品化使用的益生菌種類還相對較少，應(yīng)加大篩選力度；此外，如何能夠在微生態(tài)環(huán)境更為復(fù)雜的養(yǎng)殖生產(chǎn)中更有效地實現(xiàn)這一路徑還需要進(jìn)一步研究。

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Isolation， identification and resistance of Vibrio harveyi isolated

from Japanese flounder （Paralichthys olivaceus）

GAO Peiyu GUO Kaiying YIN Rui GONG Chunguang

（1. Zhangjiakou Aquatic Technology Extension Station，Zhangjiakou 075000， China;

2.Ocean College of Hebei Agricultural University， Qinhuangdao 066003，China;

3.Hebei Academy of Marine and Aquatic Sciences，Qinhuangdao 066201，China）

Abstract：A Gram-negative bacterium was isolated from diseased cultured Japanese flounder （Paralichthys olivaceus） in Changli， Qinhuangdao. Its morphological characteristics， physiological and biochemical properties， as well as its 16S rDNA sequence were analyzed， identifying it as Vibrio harveyi. The isolated strain underwent antibiotic susceptibility testing with 30 antibiotics and an antagonistic experiment with 11 probiotics. The results revealed that the isolated strain exhibited high sensitivity to 13 antibiotics， including minocycline， levofloxacin， cefotaxime， florfenicol， norfloxacin， ciprofloxacin， doxycycline and compound sulfadiazine among others; while showing varying degrees of resistance to 9 antibiotics such as clindamycin， penicillin and ampicillin. Two probiotics， Bacillus licheniformis and B. subtilis， demonstrated antagonistic effects on the strain at certain concentrations.

Key words：Paralichthys olivaceus; Vibrio harveyi; isolation and identification; antibiotic susceptibility testing；antagonistic assay

（收稿日期：2024-07-22；修回日期：2024-08-12）