家畜血液儲存條件及預處理方式對種屬鑒定的影響

摘 要 目的：考察血液儲存時間、儲存溫度和預處理方式對種屬鑒定的影響。方法：以豬、牛、羊血液為樣本，考察儲存時間、儲存溫度和預處理方式對種屬鑒定的影響。儲存時間考察1周和3周，儲存溫度考察4 ℃和？20 ℃，預處理方式考察是否去除紅細胞。樣本經DNA提取，PCR-RFLP檢測后進行結果判定。結果與結論：儲存1周時，兩種儲存溫度及預處理方式均能正常進行種屬鑒定。儲存3周時，兩種儲存溫度，預處理時不去除紅細胞會產生假陰性判定，假陰性是由于提取的DNA中存在PCR抑制物；預處理時去除紅細胞可正常檢測。該結論對于豬、牛、羊血液具有普適性。

關鍵詞 血液 種屬鑒定 PCR抑制物

中圖分類號：TQ464.8； TQ460.4 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）15-0087-04

引用本文 王欣， 董蕾， 汪雅雯. 家畜血液儲存條件及預處理方式對種屬鑒定的影響[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（15）： 87-90.

The influence of blood storage conditions and pretreatment methods on species identification in livestock

WANG Xin， DONG Lei， WANG Yawen

（SPH NO.1 Biochemical & Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the effects of different storage time， temperature and pretreatment methods on the results of blood species identification. Methods： The effects of storage time（one or three weeks） and temperature （4 or ？20 ℃） and pretreatment methods （removing red blood cells or not） on species identification were investigated taking the blood of pig， bovine and sheep for samples. The samples were subjected to DNA extraction and PCR-RFLP detection for result determination. Results & Conclusion： The samples could be used for normal species identification when stored for one week and at 4 or ？20 ℃ and pretreated by removing red blood cells or not. The false-negative verdicts were generated when samples were stored for 3 weeks at either 4 or ？20 ℃ and the red blood cells were not removed during pretreatment， which may be due to the presence of PCR inhibitors in the extracted DNA. The species identification could be normally performed by removing red blood cells during pretreatment. This conclusion has general applicability to pig， bovine and sheep blood.

KEY WORDS blood； species identification； PCR inhibitors

凝血酶散來源于豬或牛血液，是一種國際公認的速效局部止血藥，已列入國家基本藥物，屬于國家醫(yī)保甲類藥品。近年來，隨著GMP生化藥品附錄、中國藥典、CDE對生化藥品在種屬控制方面要求的提高，需建立一種適合血液樣本的種屬鑒定方法。2020年版中國藥典四部通則“1001聚合酶鏈式反應法”[1]中明確了一種基于限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）對豬、牛、羊源性成分進行種屬鑒定的方法，將該方法用于血液樣本時，檢測結果不穩(wěn)定，存在較大波動，甚至出現假陰性結果。本研究考察了3種影響血液種屬鑒定的因素，包括樣本儲存溫度（4 ℃和-20 ℃）、儲存時間（1周和3周）及預處理方式（是否去除紅細胞）。通過三因素兩水平的系統(tǒng)考察，明確樣本儲存和預處理方式，保證后續(xù)檢測高效、結果穩(wěn)定。

1 材料和方法

1.1 材料

豬、牛、羊血液（含4%檸檬酸鈉）源自我公司；豬、牛、羊源性胰臟基因組DNA（10 ng/mL）購自Zyagen公司；Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒、瓊脂糖、6×甘油凝膠上樣緩沖液Ⅶ、DNA分子量標準A（均購自上海生工生物；2×Premix Taq（EX Taq version 2.0）、限制性內切酶Sau3AⅠ購自Takara公司；無DNA酶/RNA酶去離子水購自天根生化公司；GelRed核酸染料購自Biotium公司；限制性內切酶MnlⅠ、DpnⅡ購自New England Biolabs；無水乙醇購自上海振興化工一廠；引物由上海生工生物合成。

1.2 儀器

ETC821D PCR儀（蘇州東勝龍公司）；5418R離心機（Eppendorf公司）；LP渦旋震蕩器、Multiskan sky微量核酸定量儀（Thermo Scientific公司）；HHD-2恒溫水浴鍋（上海比朗儀器）；XSR204/AC電子天平（梅特勒公司）；Powerpac Basic電泳儀、GelDoc凝膠成像儀（Bio-Rad公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 血液處理

豬、牛、羊血液中均含有4%檸檬酸鈉，將新鮮血液分裝200 mL/管，置于4 ℃和-20 ℃，放置1周和3周后進行檢測。

1.3.2 血液中DNA的提取

取1管分裝樣本，利用Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒提取DNA。樣本預處理方式分兩組，一組使用紅細胞裂解液去除紅細胞，另一組不去除紅細胞，獲得的DNA溶液使用微量核酸定量儀檢測濃度和純度，進行后續(xù)PCR-RFLP檢測。

1.3.3 PCR-RFLP檢測

采用2020年版中國藥典四部通則“1001聚合酶鏈式反應法”中所列豬牛羊源鑒定引物進行PCR擴增和限制性內切酶酶切[1]。PCR反應體系：2×Premix Taq 12.5 mL，DNA模板1 mL，上游引物（10 mmol/L）1 mL，下游引物（10 mmol/L）1 mL，加去離子水至25 mL。PCR反應條件：94 ℃變性3 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72℃ 50 s，30個循環(huán)后，72 ℃ 10 min；反應結束后于8 ℃保溫。限制性內切酶酶切體系：PCR反應產物8.5 mL，限制性內切酶0.5 mL，酶切緩沖液1 mL。酶切反應條件：37 ℃ 60 min，65 ℃ 20 min。反應結束后于8 ℃保溫。豬源性成分擴增條帶為212 bp，酶切后兩條帶為196和16 bp；牛源性成分擴增條帶為271 bp，酶切后兩條帶為214和57 bp；羊源性成分擴增條帶為293 bp，酶切后兩條帶為202和91 bp。

1.3.4 電泳檢測及凝膠成像

配制3%（w/v）瓊脂糖凝膠，取10 mL PCR擴增產物加入2 mL 6×甘油凝膠上樣緩沖液Ⅶ混合后上樣，140 V恒壓電泳40 min，凝膠成像儀成像。通過與DNA分子量標準對比，比較樣品PCR產物及酶切產物與陽性對照條帶的一致性，從而對樣品是否含有豬牛羊源性成分進行判定。

2 結果

2.1 PCR-RFLP法適用于血液的種屬鑒定

以新鮮豬、牛、羊血液（含4%檸檬酸鈉）為樣本，按照1.3.2所述的兩種預處理方式提取DNA，A260/A280均大于1.8，濃度均大于20 ng/mL，表明獲得的DNA純度好、濃度高，適用于后續(xù)PCR擴增。隨后按照1.3.3進行PCR-RFLP檢測，均檢測出與相應陽性對照相一致的條帶（圖1），表明藥典通則所述PCR-RFLP法適用于血液的種屬鑒定。

2.2 血液放置時間影響種屬鑒定的結果判定

放置于4 ℃和-20 ℃的豬、牛、羊分裝血液，于第1周和第3周時取出，均按照表1進行8組實驗。提取所得DNA的A260/A280均大于1.8，濃度均大于20 ng/mL。第3周取出、于4 ℃及-20 ℃儲存時，不去除紅細胞的樣品無法檢出擴增條帶，而去除紅細胞的樣品可擴增出清晰條帶。

2.3 無擴增條帶是由于DNA中存在PCR抑制物

結果顯示，理應擴增出條帶的樣品未見條帶，且在該樣品中加入陽性對照仍無擴增條帶，從而顯示“陰性”，而陽性對照可擴增條帶（圖2）。我們推測，“陰性”條帶是由于抽提DNA樣品中存在某些PCR抑制物而導致的假陰性結果。

3 討論

常見PCR抑制物包括體液中各種成分和實驗所用試劑（如血紅蛋白、尿素、肝素）、食物成分（如有機和酚類化合物、糖原、脂肪和Ca2+）、環(huán)境化合物（如酚類化合物、腐植酸和重金屬）[2]。有研究報道血液是一種常見的PCR抑制劑，當PCR反應體系中血液的體積比超過4%時會產生抑制作用，研究人員推薦每100 mL反應體系中血液比例低于1%～2%，方可保證血液中的序列正常擴增[3]。血紅蛋白和乳鐵蛋白分別是紅細胞和白細胞中的主要PCR抑制物[4-5]，血紅蛋白和乳鐵蛋白中都含有鐵離子，由于鐵離子會干擾DNA合成，抑制機制可能與這些蛋白在PCR混合物中釋放出鐵離子有關。此外，血紅蛋白的衍生物，包括膽紅素、膽鹽和血紅素，均具有PCR抑制作用。血紅素通過反饋抑制作用調節(jié)DNA聚合酶活性，協(xié)調紅細胞中血紅蛋白成分的合成，與目標DNA競爭結合DNA聚合酶[6]。

因此，血液作為一種含有PCR抑制物的特殊樣本，在進行種屬鑒定時，結果判定受樣本儲存條件及預處理方式的影響較大。本研究考察了血液儲存溫度（4 ℃和-20 ℃）、儲存時間（1周和3周）及預處理方式（是否去除紅細胞）對檢測結果的影響，結果顯示儲存1周時，兩種儲存溫度及預處理方式，均能正常檢測到各自的擴增條帶；儲存3周時，兩種儲存溫度，預處理時不去除紅細胞會產生假陰性判定，假陰性是由于提取的DNA中存在PCR抑制物；預處理時去除紅細胞可正常檢測到擴增條帶。該結論對于豬、牛、羊血液具有普遍適應性。因此，本研究完善了血液樣本的儲存和預處理方法，對提高血液樣本中動物源性成分種屬檢測效率具有一定的指導意義。

參考文獻

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