蛋白提取工藝過程評(píng)價(jià)方法的研究

摘 要 目的：建立一種快速、便捷、低成本的生物酶制劑生產(chǎn)工藝過程評(píng)價(jià)方法。方法：聯(lián)用凝膠電泳法和BCA蛋白定量法進(jìn)行計(jì)算，得到較為準(zhǔn)確的目標(biāo)蛋白定量數(shù)量數(shù)據(jù)。結(jié)果：以胰蛋白酶生產(chǎn)工藝為例，對(duì)不同工段樣品進(jìn)行SDS-PAGE和BCA測(cè)試，并計(jì)算得到對(duì)應(yīng)的蛋白定量數(shù)據(jù)，其中組內(nèi)樣品數(shù)據(jù)RSD≤5%，說明了該方法的可重復(fù)性。結(jié)論：該方法可準(zhǔn)確分析不同工段的蛋白濃度變化，并進(jìn)行快速、靈敏地定量；同時(shí)發(fā)現(xiàn)原胰蛋白酶生產(chǎn)工藝中存在蛋白泄漏的缺陷，可為后續(xù)工藝改進(jìn)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 SDS-PAGE BCA 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 蛋白提取 中間體評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào)：TQ460.63； TQ464.8 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2024）15-0069-04

引用本文 梁吉， 汪晨曦. 蛋白提取工藝過程評(píng)價(jià)方法的研究[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（15）： 69-72.

Study on the evaluation method for protein extraction process

LIANG Ji1， WANG Chenxi2

（1. Shanghai Pharmaceutical School， Shanghai 200135， China； 2. SPH NO.1 Biochemical & Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT Objective： To establish a rapid， convenient and low-cost evaluation method for the production process of biological enzyme preparations. Methods： Combined with gel electrophoresis and BCA protein quantitative method， more accurate quantitative data of target protein were obtained. Results： Taking the trypsin production process as an example， SDSPAGE and BCA tests were performed on samples from different sections， and the corresponding protein quantitative data were obtained by calculation. The RSD≤5 % of the sample data in the group indicated the repeatability of the method. Conclusion： This method can accurately analyze the changes of protein concentration in different sections and quickly and sensitively quantify the protein. It is found that there is a defect of protein leakage in original production process of trypsin， which provides a theoretical basis for subsequent process improvement.

KEY WORDS SDS-PAGE； BCA； standard curve method； protein extraction； intermediate evaluation

生物提取是酶制品工業(yè)化生產(chǎn)中重要的技術(shù)方法，具有產(chǎn)量大、成本低等優(yōu)勢(shì)。在化學(xué)制藥中，酶制品原料藥如胰蛋白酶、糜蛋白酶、玻璃酸酶和凝血酶等的生產(chǎn)，都廣泛采用生物提取法[1-3]。該方法的起始原料往往是生物組織、酶原等，其純度、質(zhì)量會(huì)影響酶制品的產(chǎn)品收率、質(zhì)量等工藝指標(biāo)。同時(shí)各工段產(chǎn)物組份較為復(fù)雜，所以通常采用的性狀判斷等方法，不能進(jìn)行有效的定性定量分析。這使得整個(gè)提取工藝處于不穩(wěn)定、不可控的狀態(tài)，影響生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，也掣肘了工藝優(yōu)化的進(jìn)行。

針對(duì)以上問題，本研究以生產(chǎn)中的胰蛋白酶產(chǎn)品為例[4-7]，通過聯(lián)合蛋白含量測(cè)定法與凝膠電泳技術(shù)，開發(fā)了一種便于操作、成本低廉的檢測(cè)方法，用于監(jiān)控、評(píng)估工藝過程。為后續(xù)的工藝技術(shù)改進(jìn)、持續(xù)工藝驗(yàn)證和數(shù)據(jù)采集分析提供了數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)所用試劑、原料藥品均購于商業(yè)公司，未經(jīng)說明使用前均不需要二次純化；胰蛋白酶工段產(chǎn)物、原料和成品均由上藥第一生化藥業(yè)有限公司提供；凝膠電泳試劑盒、BCA試劑盒均購于上海生物工程公司；配制溶液所需的原料試劑均購于國(guó)藥試劑公司；Tanon model EPS300電泳儀購于上海天能科技有限公司；Mapada UV-3100紫外分光光度計(jì)購于上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 樣品制備

1）工段產(chǎn)物1～5取樣胰蛋白酶工藝過程中的工段產(chǎn)物（工段1～5），同時(shí)計(jì)量該工段產(chǎn)物的質(zhì)量（液體樣品計(jì)量體積）。將其溶于水后（樣品為液體則稀釋）用透析袋（截留Mr為3 500）在水中透析除鹽，溫度為0～8 ℃，透析時(shí)間為24 h。用凍干機(jī)凍干樣品，計(jì)量備用。

2）待測(cè)樣品 將上述樣品用磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）配制濃度為1 mg/mL的樣品。

1.3 凝膠電泳SDS-PAGE檢測(cè)

按試劑盒說明書制備濃度為15%的分離凝膠，組裝凝膠電泳裝置。在待測(cè)樣品中加入非還原性上樣緩沖液（保留蛋白二硫鍵），95 ℃煮沸變性后加樣進(jìn)行凝膠電泳分析，單孔泳道上樣量約為20 mg。獲取的膠條采用考馬斯亮藍(lán)染色1 h（搖床37 ℃、180 r/min），然后，用脫色液脫色2 h。膠條置于白背景、明亮白光下拍照，圖片運(yùn)用Image J軟件處理為灰度圖。最后，分別計(jì)算目標(biāo)泳道區(qū)域總灰度、目標(biāo)條帶灰度及占比。

1.4 BCA蛋白含量測(cè)定法

1.4.1 采用牛血清蛋白（BSA）做BCA測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

按試劑盒說明書配制BCA工作液，按照V工作液-VBSA=39∶1的比例加入不同濃度的BSA溶液，混合均勻后于37 ℃孵育30 min，測(cè)試在562 nm處的紫外吸收值。做吸光度-BSA濃度曲線，經(jīng)過線性擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.4.2 待測(cè)樣品測(cè)試

將待測(cè)樣品和BCA工作液混合，37 ℃孵育30 min，測(cè)試在562 nm處的紫外吸收值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定待測(cè)樣品的濃度x（mg/mL），如果樣品對(duì)應(yīng)工段產(chǎn)物為固體，則通過式1計(jì)算工段產(chǎn)物蛋白量；如果樣品對(duì)應(yīng)工段產(chǎn)物為液體，則通過式2計(jì)算工段產(chǎn)物蛋白量。

其中y固體為固體樣品蛋白量（g），y液體為液體樣品蛋白量（g）。x為待測(cè)樣品實(shí)際蛋白濃度（mg/mL），m1為樣品凍干后質(zhì)量（g）；M為工段產(chǎn)物質(zhì)量（g），m為取樣質(zhì)量（g）；V為工段產(chǎn)物體積（mL），v為取樣體積（mL）。

1.5 樣品中目標(biāo)蛋白量的計(jì)算

以胰蛋白酶為例，其Mr為25 kDa蛋白，按照1.3計(jì)算電泳圖像灰度值。按照1.4計(jì)算其樣品蛋白量，即樣品目標(biāo)蛋白量=目標(biāo)蛋白灰度占比×樣品蛋白量；并按此計(jì)算各個(gè)待測(cè)樣品中的目標(biāo)蛋白量。

1.6 方法學(xué)評(píng)價(jià)

重復(fù)取樣，按1.5計(jì)算同樣品的目標(biāo)蛋白量，考察同樣品數(shù)據(jù)平行樣品間的RSD。

2 結(jié)果與分析

由于胰蛋白酶生產(chǎn)工藝的中間工段取樣處于不可控狀態(tài)，不宜定量分析，因此我們?cè)O(shè)計(jì)了兩種技術(shù)聯(lián)用的方法對(duì)中間體進(jìn)行評(píng)估。其中SDS-PAGE分析蛋白樣品組成是一種快速且易于操作的方法，常用來分析樣品的組成、純度。通過Image J處理為灰度圖后，可以通過灰度粗略判斷目標(biāo)條帶的占比[8-12]。而BCA蛋白含量測(cè)定法是經(jīng)典的藥典方法，通過肽鍵還原Cu2+為Cu+，與BCA分子結(jié)合產(chǎn)生在562 nm處有紫外吸收的物質(zhì)，其吸光度與蛋白濃度成線性關(guān)系[13]。BCA方法測(cè)定的結(jié)果是樣品中總蛋白量，并不能區(qū)分雜蛋白與目標(biāo)蛋白。分析以上數(shù)據(jù)，我們認(rèn)為總蛋白量結(jié)合凝膠電泳的灰度占比結(jié)果，兩者乘積可用來代表目標(biāo)蛋白的實(shí)際量。

2.1 凝膠電泳法分析各工段蛋白量

結(jié)果顯示，隨著工段推進(jìn)，樣品中胰蛋白酶量占比逐漸增加，純度逐步提升（圖1）。在25 kDa附近的條帶歸屬于胰蛋白酶，其中工段1產(chǎn)物中大Mr雜蛋白的占比達(dá)到了77%；而隨著工序推進(jìn)到工段產(chǎn)物2時(shí)，目標(biāo)胰蛋白酶的占比提升到54%。工段3、4的結(jié)果相近，說明在這兩步生產(chǎn)中主要目的是除鹽而非目標(biāo)蛋白的提純。經(jīng)過工段5的操作，胰蛋白酶獲得進(jìn)一步提純，電泳條帶的灰度分?jǐn)?shù)占比達(dá)到了100%（圖1），表明其可在一定程度上監(jiān)測(cè)胰蛋白酶生產(chǎn)過程。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性，我們重復(fù)采樣4次分析樣品間RSD。結(jié)果顯示，不同工段樣品間重復(fù)采樣各RSD均小于5%（表1），說明采用凝膠電泳法檢測(cè)胰蛋白酶樣品的重復(fù)性良好，可滿足對(duì)胰蛋白酶生產(chǎn)過程的分析需求。

2.2 BCA法分析各工段蛋白量

根據(jù)吸光度-BSA濃度曲線，經(jīng)過線性擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.523x+0.148 1，進(jìn)一步通過1.4.2計(jì)算得到各工段中的蛋白量（表2）。結(jié)果顯示，工段1到工段2過程中蛋白量大幅度下降，工段4和5樣品中的蛋白降低比例超過50%，從中可以監(jiān)測(cè)胰蛋白酶生 產(chǎn)工藝中蛋白質(zhì)量的變化。同時(shí)各工段重復(fù)采樣樣品的RSD均小于5%（表2），說明BCA方法測(cè)定胰蛋白酶工段產(chǎn)物的重復(fù)性良好。

2.3 聯(lián)合凝膠電泳和BCA法分析各工段蛋白量

結(jié)果顯示，各工段樣品及重復(fù)樣數(shù)據(jù)RSD均小于 5%（表3），說明本研究方法的重復(fù)性良好。通過兩步工藝間胰蛋白酶量的差值與前一步量的比值計(jì)算胰蛋白酶的損耗率（圖2）。

結(jié)合胰蛋白酶純化的生產(chǎn)工藝流程，工段1處理后，雜蛋白被大量除去；工段2、3、4獲取產(chǎn)物后，目標(biāo)胰蛋白酶存在大量損失。其中，工段4采用了透析袋透析，經(jīng)過進(jìn)一步檢測(cè)其截留Mr約為40 kDa，大于胰蛋白酶的25 kDa，說明胰蛋白酶在透析過程中可能發(fā)生泄漏。工段5獲取的胰蛋白酶為480 g，與實(shí)際生產(chǎn)成品結(jié)果數(shù)據(jù)相近（470～510 g），說明本方法可以反應(yīng)生產(chǎn)實(shí)際情況。從其中數(shù)據(jù)也可看出，工段4出現(xiàn)了更多的胰蛋白酶損失量，值得進(jìn)一步分析。

工段4主要的生產(chǎn)操作是將工段產(chǎn)物3在透析袋內(nèi)重結(jié)晶析出廢物，留下液體進(jìn)入后續(xù)工段，為此產(chǎn)生了結(jié)晶廢物、透析廢液。為進(jìn)一步研究工段4的損耗情況，利用凝膠電泳法分析在工段4取樣的起始物料（工段產(chǎn)物3）、廢液和廢物（圖3）。結(jié)果顯示，廢液（泳道3）中于25 kDa處可以看到清晰的胰蛋白酶條帶，灰度分?jǐn)?shù)為30.5%，同時(shí)BCA測(cè)試顯示該廢液中總蛋白量為1 560 g，按本研究方法計(jì)算廢液中胰蛋白酶量為476 g。廢物（泳道2號(hào)）中灰度分?jǐn)?shù)為95.6%，同時(shí)BCA法測(cè)得該廢物樣品中總蛋白量為680 g，計(jì)算得出廢固物樣品中胰蛋白酶量為650 g。按本方法計(jì)算，起始物料工段產(chǎn)物3（ 泳道1）胰蛋白酶量為2 175 g，廢液與廢物中損失的胰蛋白酶總和為1 126 g（占比51.8%）。其中廢物是重結(jié)晶必然產(chǎn)生的損耗無法避免，廢液則來源于透析袋的截留滲漏。因此，工段4中胰蛋白酶產(chǎn)生損失近500 g，是采用了截留Mr過大的透析袋所致。經(jīng)過以上進(jìn)一步的分析，我們可以判斷出該胰蛋白酶生產(chǎn)工藝過程中的工段4值得進(jìn)一步優(yōu)化改進(jìn)。

3 討論

本研究將經(jīng)典的凝膠電泳法和BCA蛋白定量法進(jìn)行聯(lián)合，建立了一套適用于中間過程產(chǎn)物評(píng)價(jià)的方法，驗(yàn)證了該方法的可重復(fù)性。以胰蛋白酶生產(chǎn)工藝為例研究，發(fā)現(xiàn)其可用于簡(jiǎn)便、快速地監(jiān)控生產(chǎn)過程，且技術(shù)門檻低，設(shè)備費(fèi)用低廉，具有良好的應(yīng)用前景。同時(shí)，在研究工作中發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶生產(chǎn)工段4存在嚴(yán)重的胰蛋白酶損耗，這為下一步該工藝改進(jìn)提供一個(gè)方向。本方法也可以進(jìn)一步用于其它蛋白質(zhì)提取生產(chǎn)工藝的過程研究，對(duì)于優(yōu)化生產(chǎn)工藝有較大的幫助。

參考文獻(xiàn)

[1] 宋彥卓， 于明曉， 康春梅， 等. 水產(chǎn)膠原蛋白及其生物活性肽的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代食品， 2022， 28（11）： 1-3.

[2] 王邵熠， 趙俸藝， 吳文龍， 等. 植物種子蛋白提取、純化及肽的生物活性研究進(jìn)展[J/OL]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2023-12-04 [2024-03-23]. https：//doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ ts.037478.

[3] 李越佳. 豆制品中胰蛋白酶抑制劑活性測(cè)定方法的改進(jìn)[J]. 中國(guó)食品添加劑， 2022， 33（7）： 212-218.

[4] 李晨， 高柳芳， 崔曉東， 等. 草魚胰蛋白酶的親和純化及酶學(xué)性質(zhì)[J]. 食品科學(xué)， 2021， 42（10）： 178-183.

[5] 肖甜香. 理性設(shè)計(jì)提高胰蛋白酶的催化性能[D]. 武漢： 湖北工業(yè)大學(xué)， 2023.

[6] 趙新， 張穎欣， 李玉亮， 等. 重組胰蛋白酶在雞胚細(xì)胞消化中的初步研究[J]. 國(guó)際生物制品學(xué)雜志， 2023， 46（6）： 343-347.

[7] 馮婷婷， 閆姝竹， 馬洪志， 等. 基于羧基化單壁碳納米角的熒光傳感體系檢測(cè)胰蛋白酶[J]. 分析試驗(yàn)室， 2024， 43（1）： 24-29.

[8] Wang C， Liu Y， Bao C， et al. Phototriggered labeling and crosslinking by 2-nitrobenzyl alcohol derivatives with amine selectivity[J]. Chem Commun （Camb）， 2020， 56（15）： 2264-2267.

[9] 時(shí)維娜. 凝膠電泳圖像形變分析及校正算法研究[D]. 濟(jì)南： 山東師范大學(xué)， 2015.

[10] 李漢芳， 黃珍， 路夢(mèng)凡， 等. 乳及乳制品中乳鐵蛋白含量的快速SDS-PAGE熒光檢測(cè)方法[J]. 現(xiàn)代食品科技， 2024， 40（4）： 296-302.

[11] 胡勇， 紀(jì)德銘， 詹騫， 等. 人血漿中纖維蛋白溶酶原純化工藝樣品蛋白含量改良BCA檢測(cè)方法的建立及驗(yàn)證[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志， 2021， 34（5）： 595-601.

[12] 張明. 凝膠圖像蛋白點(diǎn)分割算法研究[D]. 濟(jì)南： 山東師范大學(xué)， 2017.

[13] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典2020年版四部[M].北京： 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2020： 108.