AEX-HPLC法測(cè)定單純皰疹病毒注射液中病毒顆粒數(shù)

摘 要 目的：建立檢測(cè)單純皰疹病毒注射液病毒顆粒數(shù)（VP）的陰離子交換色譜法（AEX-HPLC）。方法：采用Resource Q分析柱和Agilent 1260Ⅱ高效液相色譜系統(tǒng)，以Tris緩沖溶液（20 mmol/L，pH 7.0）為流動(dòng)相A和以含2.5 mol/L氯化鈉的Tris緩沖溶液為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，并對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：空白溶劑無干擾峰出現(xiàn)；未經(jīng)純化的單純皰疹病毒溶液中的皰疹病毒峰與其他雜質(zhì)峰分離度大于1.5；該方法的定量限和檢測(cè)限為5.0×107 VP/mL和2.0×107 VP/mL；皰疹病毒的進(jìn)樣量在5×107～1×109病毒顆粒范圍內(nèi)，濃度與吸收峰的線性關(guān)系良好（R2=0.998 2）；整個(gè)精密度實(shí)驗(yàn)的RSD%為0.9%；回收率70%～130%之間。結(jié)論：AEX-HPLC法可用于檢測(cè)單純皰疹病毒注射液的病毒顆粒數(shù)。

關(guān)鍵詞 單純皰疹病毒 病毒顆粒 分析方法驗(yàn)證

中圖分類號(hào)：O657.75； R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2024）15-0083-04

引用本文 孫名皓，雷雨， 胡國棟. AEX-HPLC法測(cè)定單純皰疹病毒注射液的病毒顆粒數(shù)[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（15）： 83-86.

Determination of viral particle in herpes simplex virus injection by AEX-HPLC

SUN Minghao， LEI Yu， HU Guodong

（Shanghai Pharma Sunway Biotech Co.， Ltd.， Shanghai 201206， China）

ABSTRACT Objective： To establish an assay method for the determination of viral particle （VP） in herpes simplex virus injection by AEX-HPLC. Methods： The HPLC was run on Resource Q column with gradient elution using Tris buffer （20 mmol/L， pH 7.0） as mobile phase A and Tris buffer containing 2.5 mol/L NaCl as mobile phase B. The assay method was subsequently validated. Results： There was no interference peak in the blank solvent and the resolution between peaks for herpes simplex virus and other impurities in the unpurified herpes simplex virus solution was greater than 1.5. The LOQ and the LOD of this assay were 5.0×107 and 2.0×107 VP/mL. The linearity relationship between the concentration and the absorption peak was good in the range of 5×107-1×109 VP/ mL with R2 0.998 2. RSD% in precision assay was 0.9% and recovery in accuracy assay was between 70%-130%. Conclusion： The AEX-HPLC assay can be applied to determine the viral particle in herpes simplex virus injection.

KEY WORDS herpes simplex virus； viral particle； analysis method validation

單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）[1-2]是皰疹病毒的典型代表，由于感染急性期發(fā)生水皰性皮炎即單純皰疹而得名。能引起人類多種疾病，如齦口炎、角膜結(jié)膜炎、腦炎以及生殖系統(tǒng)感染和新生兒的感染。HSV呈球形，有包膜，包膜表面有11種包膜糖蛋白；有明顯的四層結(jié)構(gòu)組成：一個(gè)雙鏈DNA核心、核衣殼、間層和囊膜。單純皰疹病毒治療是當(dāng)前腫瘤治療技術(shù)的研究熱點(diǎn)[2-3]，在作為藥品進(jìn)行研發(fā)和生產(chǎn)的過程中，需要采用滴度測(cè)定的方法進(jìn)行分析和控制。目前針對(duì)單純皰疹病毒的滴度測(cè)定主流的方法是使用空斑法檢測(cè)生物學(xué)滴度[4-6]，不僅檢測(cè)周期長（需要1周），對(duì)人員及環(huán)境的要求較高（須保持無菌），而且成本較高。此外還有熒光定量PCR法[7-8]、化學(xué)發(fā)光免疫法[9]、酶聯(lián)免疫法[9]等檢測(cè)病毒顆粒數(shù)，雖然這些方法靈敏度高，檢測(cè)周期短，但是成本很高，須購買相對(duì)應(yīng)的價(jià)格昂貴的檢測(cè)試劑盒，且無法做到高通量的檢測(cè)，滿足不了在工藝純化過程中實(shí)時(shí)監(jiān)控。本研究建立了一種AEX-HPLC方法來檢測(cè)單純皰疹病毒注射液中的病毒顆粒數(shù)，具有高效、快速、低成本優(yōu)勢(shì)。

1 材料和方法

1.1 儀器

Agilent 1260Ⅱ型高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器，OpenLab工作站軟件；安捷倫公司）；Resource Q色譜柱（6.4 × 30 mm，15 mm，Cytiva公司）；ME3002TE電子天平、S400-K 型pH計(jì)（Mettler Toledo公司）。

1.2 試劑和樣品

Tris-Base購自Promega公司；鹽酸和氫氧化鈉購自Merck公司；水為超純水；單純皰疹病毒注射液（通過qPCR對(duì)其進(jìn)行標(biāo)定，標(biāo)定值2.1×10⁹ VP/mL，作為工作標(biāo)準(zhǔn)品）、中間樣品等均為上海三維生物技術(shù)有限公司研發(fā)平臺(tái)生產(chǎn)，保存條件為-80 ℃。

1.3 色譜條件

1）空白溶液 以流動(dòng)相A作為空白溶劑進(jìn)樣。

2）標(biāo)準(zhǔn)品溶液 從？80 ℃冰箱中取出單純皰疹病毒注射液，解凍、平衡至室溫后輕微渦旋后進(jìn)樣。

3）供試品溶液 取單純皰疹病毒溶液中間樣品進(jìn)樣。

4） 流動(dòng)相 A：Tris溶液（20 mmol/L，pH 7.0，用0.45 mm的微孔濾膜抽濾）；B：Tris溶液+2.5 mol/L氯化鈉溶液。

流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，樣品池溫度10 ℃，檢測(cè)波長280 nm，進(jìn)樣量100 mL；進(jìn)行梯度洗脫（表1）。

2 結(jié)果

2.1 專屬性和系統(tǒng)適用性

空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液各100 mL進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。標(biāo)準(zhǔn)品溶液中單純皰疹病毒峰的保留時(shí)間在4.09 min；在空白溶液的出峰位置無干擾；供試品溶液中，單純皰疹病毒峰與其他雜質(zhì)峰的分離度大于1.5。結(jié)果表明，本方法的專屬性和系統(tǒng)適用性良好。

2.2 定量限

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，用流動(dòng)相A逐步稀釋成不同濃度，在上述色譜條件下，基線噪音選擇6.00～7.00 min，直至信噪比接近10。結(jié)果單純皰疹病毒的定量限為5×10⁷ VP/mL，可以滿足測(cè)定要求。

2.3 檢測(cè)限

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，用流動(dòng)相A逐步稀釋成不同濃度，在上述色譜條件下，基線噪音選擇6.00～7.00 min，直至信噪比接近3。結(jié)果單純皰疹病毒的檢測(cè)限為2×10⁷ VP/mL，可以滿足測(cè)定要求。2.4 線性和范圍

將定量限的濃度作為線性的最低濃度點(diǎn)，將高濃度的單純皰疹病毒液用流動(dòng)相A稀釋至1×10⁹、5×10⁸、2×10⁸、1×10⁸及5×10⁷ VP/mL，分別進(jìn)樣，測(cè)得各濃度相應(yīng)的峰面積（表2），并對(duì)目標(biāo)峰面積進(jìn)行線性評(píng)估。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作回歸分析，得回歸方程Y=947.38X-36.964，R2=0.998 2。結(jié)果表明，單純皰疹病毒的進(jìn)樣濃度在（5×10⁷）～（1×10⁹）VP/mL之間，線性關(guān)系良好。

2.5 精密度

2.5.1 重復(fù)性

由分析員1取樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定單純皰疹病毒的峰面積，結(jié)果峰面積的RSD%為1.0%，表明本方法的重da0b196f05a0d0536ca0f9dd59419bf12ef2bb1f76cffe7264e19d3cee273579復(fù)性良好。

2.5.2 中間精密度

由分析員2在不同日期取樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定單純皰疹病毒峰面積，結(jié)果峰面積的RSD%為0.7%，表明本方法的中間精密度良好，綜合重復(fù)性和中間精密度的數(shù)據(jù)，12針進(jìn)樣結(jié)果峰面積的RSD%為0.9%，表明本方法的精密度良好。

2.6 準(zhǔn)確度

選取2×10⁸、5×10⁸、8×10⁸ VP/mL為低、中、高3個(gè)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，分別與未知濃度的中間樣品等體積混勻后進(jìn)行檢測(cè)，回收率在70%～130%之間（表3）。

3 討論

病毒顆粒數(shù)一定程度上能夠反映病毒滴度，在工藝開發(fā)過程中，需要對(duì)病毒顆粒數(shù)進(jìn)行控制以確保工藝的穩(wěn)定，和傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比較，通過高效液相色譜的方式，可以極大的縮短開發(fā)的進(jìn)程，降低成本；同時(shí)在產(chǎn)品放行階段，也可以和空斑法滴度相輔相成，共同反映該產(chǎn)品的病毒顆粒數(shù)。本研究采用的AEX-HPLC法，在分析未純化的單純皰疹病毒液時(shí)，可將單純皰疹病毒峰和雜質(zhì)峰實(shí)現(xiàn)很好的分離；此外單個(gè)樣的檢測(cè)時(shí)間為8 min，可以大通量地進(jìn)行病毒檢測(cè)，非常利于前期的細(xì)胞培養(yǎng)、篩選和純化階段的工作。

但是由于使用的流動(dòng)相B中含有2.5 mol/L的氯化鈉，鹽濃度很高，在檢測(cè)過程中須用10%的異丙醇進(jìn)行泵頭密封墊的清洗，每5 min “seal wash” 0.2 min；同時(shí)針對(duì)未純化的樣品，為了充分洗脫柱子上的殘留樣品，特地在5～8 min的時(shí)間段將梯度放緩（表1）；為了能延長色譜柱的使用壽命，在每次檢測(cè)樣品后須對(duì)色譜柱進(jìn)行較長時(shí)間的清洗、維護(hù)；如檢測(cè)完成后，切換成1 mol/L氫氧化鈉，以0.5 mL/min進(jìn)行等度洗脫，之后再切換成超純水進(jìn)行沖洗2 h以上，同時(shí)在下一次檢測(cè)前，需要對(duì)進(jìn)樣針進(jìn)行10次“needle wash”，來清洗進(jìn)樣針中殘留的樣品，減小對(duì)下一次檢測(cè)的干擾。考慮到維護(hù)的操作時(shí)間較長，步驟較多，后續(xù)會(huì)進(jìn)一步研究，嘗試在流動(dòng)相中加入較少比例的有機(jī)相，在不改變?cè)袡z測(cè)靈敏度的情況下盡可地將色譜柱上的樣品洗脫干凈來減少維護(hù)色譜柱所需的時(shí)間。就本分析方法而言，不應(yīng)僅僅局限于單純皰疹病毒，在同一個(gè)液相條件下，對(duì)不同病毒的分離才是未來病毒顆粒數(shù)檢測(cè)的趨勢(shì)，這樣不僅可以在前期開發(fā)中進(jìn)行高通量檢測(cè)，還可以在產(chǎn)品放行階段對(duì)關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)尤其是雜質(zhì)部分進(jìn)行一定程度上的控制。

在方法學(xué)驗(yàn)證方面，5×10⁷～1×10⁹ VP/mL的線性范圍可以很好地滿足工藝開發(fā)的需求，良好的精密度以及較高的回收率也是本方法的亮點(diǎn)之一。總之，本方法可以用于單純皰疹病毒注射液中病毒顆粒數(shù)檢測(cè)。

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