一株鴨疫里氏桿菌的分離、鑒定與生物學(xué)特性分析

摘要：為確定引起2022年湖北省襄陽(yáng)市某規(guī)?；唸?chǎng)的鴨急性死亡病因，對(duì)病料進(jìn)行病原菌分離、對(duì)分離株進(jìn)行生化特性鑒定、耐藥性測(cè)定、動(dòng)物回歸試驗(yàn)及全基因組測(cè)序。結(jié)果表明，急性死亡的鴨病原菌僅有鴨疫里氏桿菌（Riemerella anatipestifer）分離鑒定為陽(yáng)性。藥敏結(jié)果顯示分離菌株對(duì)藥物敏感性較高，僅對(duì)環(huán)丙沙星、氧氟沙星耐藥；動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果顯示分離菌株可引起雛鴨急性死亡，剖檢可見(jiàn)典型的漿膜炎癥狀。組織病理學(xué)切片顯示心臟、肝臟被膜有明顯纖維性滲出，心肌細(xì)胞有炎性浸潤(rùn)、脾臟實(shí)質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少、腦組織可見(jiàn)較多的血管淤血擴(kuò)張。毒力測(cè)定顯示分離菌株的半數(shù)致死量為3.06×106 CFU/mL。

關(guān)鍵詞：鴨疫里氏桿菌（Riemerella anatipestifer）；生化特性；回歸試驗(yàn)；病理變化；毒力

中圖分類號(hào)：S858.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）09-0156-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.09.026  開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Isolation， identification and biological characterization of a strain of Riemerella anatipestifer

WANG Bo-tao1，2，GUO Yun-qing2，ZHANG Teng-fei2，ZHANG Wen-ting2，

LU Qin2，HU Qiao2，LUO Qing-ping2，3，ZHAI Xin-guo1

（1. College of Life Science and Food Engineering， Hebei University of Engineering， Handan 056000， Hebei， China； 2. Key Laboratory of Creation of Preparations for the Prevention and Control of Bacterial Diseases of Livestock and Poultry， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Hubei Provincial Key Laboratory of Livestock and Poultry Pathogenic Microbiology/Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064， China； 3. Hubei Hongshan Laboratory， Wuhan 430064， China）

Abstract：In order to determine the cause of acute death of ducks in a large-scale duck farm in Xiangyang City， Hubei Province in 2022， the pathogenic bacteria were isolated， and the biochemical characteristics， drug resistance， animal regression tests and whole genome sequencing of the isolated strain were identified. The results showed that only Riemerella anatipestifer was isolated and identified as positive in acute dead duck pathogens. The drug susceptibility results showed that the isolated strains had high sensitivity to antibiotics and were resistant to ciprofloxacin and ofloxacin. The results of animal regression experiments showed that isolated strains could cause acute death of ducklings， typical symptoms of serositis were seen on autopsy. Histopathological sections showed obvious fibrous exudation of the heart and liver envelope， inflammatory infiltration of cardiomyocytes， a significant decrease in the number of lymphocytes in the spleen parenchyma， and more vascular congestion and expansion in brain tissue. Virulence assays showed that the half lethal dose of isolated strains was 3.06×106 CFU/mL.

Key words：Riemerella anatipestifer； biochemical properties； regression testing； pathological changes； virulence

鴨傳染性漿膜炎是由鴨疫里氏桿菌（Riemrella anatipestifer，RA）感染鴨、鵝和火雞等家禽后引起的傳染?。?-3］。RA是革蘭氏陰性、不產(chǎn)生芽孢、無(wú)鞭毛的細(xì)菌［4］。RA主要侵害1～8周齡雛鴨，RA的感染會(huì)導(dǎo)致高死亡率［5］，因此在養(yǎng)鴨業(yè)受到了較大的關(guān)注。目前報(bào)道的RA血清型至少有21種，中國(guó)流行的血清型主要為血清1型、2型和10型［6］，各血清型交叉保護(hù)力較低，臨床上仍主要依賴抗生素對(duì)該病進(jìn)行治療，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題也日益嚴(yán)重。顧慶林等［7］、吳征卓等［8］研究發(fā)現(xiàn)RA對(duì)環(huán)內(nèi)酯類和氨基糖苷類抗生素的耐藥性較強(qiáng)，增加了該病的防治難度，嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。

2022年湖北省襄陽(yáng)市某規(guī)模化鴨場(chǎng)3周齡左右蛋鴨發(fā)生疾病，主要有精神癥狀，剖檢可見(jiàn)纖維素性滲出，疑似為鴨疫里氏桿菌感染。本研究對(duì)病死鴨進(jìn)行病原菌分離與鑒定，并對(duì)分離株開展了生化特性、耐藥性、致病性等研究，旨在為臨床上該病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)病料

病鴨來(lái)源于湖北省襄陽(yáng)市某規(guī)模化鴨場(chǎng)。

1.2 主要試劑

TSA培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)BD公司；革蘭氏染液，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；病毒核酸提取試劑盒，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 病毒的分離及鑒定

取病鴨的肝臟、氣管、肺臟、脾臟、大腦，破碎后凍融3次，10 000 r/min離心2 min，使用病毒核酸提取試劑盒抽提總核酸。根據(jù)文獻(xiàn)［9］合成引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1.0 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃變性5 min；95 ℃變性15 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延伸 15 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無(wú)菌采集肝臟、脾臟、大腦，分別接種于TSA和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，于37 ℃下5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h。挑取單菌落接種于TSB培養(yǎng)基中，37 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，并進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌落形態(tài)。

1.5 16S rRNA基因序列的擴(kuò)增與鑒定

取制備好的菌液，利用試劑盒提取基因組，

-20 ℃?zhèn)溆?。根?jù)文獻(xiàn)［10］合成引物（表2）。PCR體系和程序同“1.3”。

1.6 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

取制備好的菌液轉(zhuǎn)接TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)，用培養(yǎng)基調(diào)整菌液OD600 nm為1.0，按1∶1 000轉(zhuǎn)接在含有50 mL TSB的細(xì)菌瓶，3個(gè)重復(fù)。每2 h測(cè)量OD600 nm，每次重復(fù)測(cè)量3次。

1.7 生化試驗(yàn)

挑取單菌落接種于微量生化鑒定管內(nèi)，按照試劑盒說(shuō)明書觀察并記錄結(jié)果。

1.8 藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定。取制備的菌液均勻涂布于TSA培養(yǎng)基，并以ATCC 25922作為質(zhì)控菌株，將藥敏片貼于平板上，參考抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（CLSI）判定結(jié)果。

1.9 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

取制備的菌株以1%的比例轉(zhuǎn)接至TSB培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)OD600 nm為1.0，活菌計(jì)數(shù)。將48只2周齡雛鴨隨機(jī)分為6組（表3）。采取腿部肌肉注射，以感染后7 d為一個(gè)觀察周期，記錄鴨群發(fā)病情況及發(fā)病癥狀，使用寇氏改良法計(jì)算菌株對(duì)雛鴨的半數(shù)致死量（LD50）。另外取15只2周齡的雛鴨，腿部肌肉注射分離菌株1.29×108 CFU/mL，在感染后48 h，隨機(jī)抽取4只雛鴨，利用抗凝管采集血清后剖殺，取心臟、肝臟、脾臟、大腦，測(cè)定組織載菌量。并取1 cm×1 cm的組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.10 全基因組測(cè)序

將提取的分離菌株的基因組，利用TBS-380熒光儀（Turner BioSystems Inc，Sunnyvale，CA）進(jìn)行定量。采用優(yōu)質(zhì)DNA（OD260 nm/280 nm=1.8～2.0，濃度>1 ng/μL）送至上海美吉生物科技有限公司進(jìn)行二代全基因組測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與鑒定

病毒的鑒定結(jié)果均為陰性。細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果顯示伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上無(wú)菌落生長(zhǎng)，在TSA培養(yǎng)基生長(zhǎng)出大小1～3 mm的半透明、圓形光滑菌落。分離菌株革蘭氏染色鏡檢形態(tài)為革蘭氏陰性短小桿菌，符合鴨疫里氏桿菌的菌落特征（圖1）。

PCR擴(kuò)增目的片段為1 480 bp（圖2）。同源性比對(duì)顯示與已報(bào)道的鴨疫里氏桿菌同源性大于99%，提示引起規(guī)?；B(yǎng)鴨場(chǎng)急性死亡的病原菌為鴨疫里氏桿菌，并將菌株命名為XY820。

2.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

分離菌株的生長(zhǎng)曲線如圖3所示，分離菌株在4～8 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，10 h后達(dá)到平臺(tái)期。

2.3 生化試驗(yàn)

參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》判定反應(yīng)，表明該分離菌株不能發(fā)酵乳糖、甘露醇、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、β-半乳糖苷，不產(chǎn)生苯丙氨酸，可以分解明膠。

2.4 藥敏試驗(yàn)

利用（K-B）法對(duì)分離菌株進(jìn)行藥物敏感性測(cè)試，結(jié)果如表4所示。分離菌株對(duì)環(huán)丙沙星、氧氟沙星耐藥，對(duì)四環(huán)素、紅霉素、阿米卡星中度敏感，對(duì)其他抗生素高度敏感。

2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

利用2周齡雛鴨進(jìn)行分離菌株的回歸試驗(yàn)，在7 d的觀察期內(nèi)，感染組低劑量組雛鴨出現(xiàn)扎堆趴臥，食欲不振、排白色或綠色水樣稀糞、精神沉郁。高劑量組雛鴨出現(xiàn)死亡、頭腦震顫、共濟(jì)失調(diào)、仰臥雙腿劃水等典型的精神癥狀。菌株的生存曲線如圖4所示，表明分離菌株可造成2周齡雛鴨的急性死亡。使用寇氏改良法計(jì)算分離菌株的LD50為3.06×106 CFU/mL。

感染48 h后，觀察1×108 CFU/mL感染組的病理變化并測(cè)定組織載菌量，結(jié)果如圖5所示。感染組雛鴨剖檢可見(jiàn)心臟、肝臟出現(xiàn)明顯的纖維素性滲出形成的假膜，脾臟呈現(xiàn)大理石狀花紋，腦部充血（圖5A）。由圖6可以看出，HE染色后感染組的心臟組織可見(jiàn)心外膜輕度水腫，結(jié)構(gòu)疏松，血管擴(kuò)張（黃箭頭），可見(jiàn)少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（紅箭頭）。肝臟組織可見(jiàn)被膜明顯增厚（黑箭頭），肝實(shí)質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)廣泛性的肝細(xì)胞脂肪變性，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)圓形空泡（黃箭頭），大量肝竇輕度淤血擴(kuò)張（藍(lán)箭頭）。脾實(shí)質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少，脾臟實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松（黑箭頭），未見(jiàn)明顯的淋巴小結(jié)。腦組織局部可見(jiàn)較多的血管淤血擴(kuò)張（黃箭頭），伴有膠質(zhì)細(xì)胞增生（紅箭頭）。對(duì)照組無(wú)明顯的病理變化。組織載菌量測(cè)定結(jié)果如圖7所示，血液、心臟、肝臟、脾臟和大腦均有鴨疫里氏桿菌的定植。

2.6 全基因組測(cè)序結(jié)果分析

全基因組測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖8。共檢測(cè)到68個(gè)耐藥基因，其中酰氨醇類1個(gè)（floR）、四環(huán)素類13個(gè)［oqxA、tet36、tetB（P）等］、磺胺類2個(gè)（sul4、cfrC）、大環(huán)內(nèi)酯類7個(gè)（ErmD、macB、oleC等）、喹諾酮類3個(gè)（oprA、TLA-1、MexF）、氨基糖苷類7個(gè)（smeS、vmlR、vgaB等）、β-內(nèi)酰胺類5個(gè)（optrA、mecC、OXA-209等）、其他類30個(gè)。

XY820編碼157個(gè)毒力相關(guān)基因，根據(jù)文獻(xiàn)［11］將毒力因子分為三大類，其中分泌型毒力因子12個(gè)（eccA1、ricA、escN等）；細(xì)菌表面毒力因子20個(gè)（algC、ompA、cpsB等）；代謝調(diào)控型毒力元件108個(gè)（mgtB、phzH、bplF等）；其他類17個(gè)。

3 小結(jié)與討論

雛鴨出現(xiàn)大量死亡，且伴有精神沉郁、頭腦震顫、共濟(jì)失調(diào)、仰臥雙腿劃水等精神癥狀。病理剖檢可見(jiàn)包心、包肝現(xiàn)象，其大腦嚴(yán)重充血。對(duì)可疑病原禽流感病毒、腺病毒和鴨疫里氏桿菌進(jìn)行分離鑒定。結(jié)果表明，禽流感病毒、腺病毒分離結(jié)果為陰性，細(xì)菌分離結(jié)果為陽(yáng)性，16S rRNA基因序列測(cè)定結(jié)果顯示分離菌為鴨疫里氏桿菌。并利用2周齡雛鴨對(duì)鴨疫里氏桿菌分離株進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)，鴨疫里氏桿菌感染組出現(xiàn)了急性死亡、共濟(jì)失調(diào)、仰臥雙腿劃水等精神癥狀。剖檢可見(jiàn)明顯的漿膜炎癥狀，且在病死鴨的心臟、肝臟、脾臟等組織內(nèi)分離到鴨疫里氏桿菌，表明鴨疫里氏桿菌是該病例的主要病因。

抗生素的過(guò)度使用，導(dǎo)致RA產(chǎn)生多種抗生素的耐藥性，多重耐藥菌株對(duì)人類健康也造成了威脅［12］。祝希輝等［13］的研究發(fā)現(xiàn)RA對(duì)喹諾酮類和氨基糖苷類等12種抗生素出現(xiàn)了不同耐藥情況。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分離菌株對(duì)喹諾酮類（環(huán)丙沙星和氧氟沙星）出現(xiàn)耐藥性，而對(duì)大多數(shù)抗生素敏感，較減抗限抗前有較明顯的耐藥性下降，其原因可能是因?yàn)榭股氐南拗剖褂脤?dǎo)致菌株的耐藥性降低，降低多重耐藥菌株的出現(xiàn)，在養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格注意抗生素的使用及停藥周期，既能降低養(yǎng)殖成本也能降低耐藥菌株的出現(xiàn)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株部分耐藥基因與耐藥表型存在不相符的情況如酰氨醇類（氟苯尼考）和磺胺類（甲氧芐胺嘧啶），在分離株基因組中檢測(cè)到這兩種耐藥基因，但不具備這兩種抗生素的耐藥表型。張旭財(cái)?shù)龋?4］對(duì)14株RA進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)和藥敏試驗(yàn)，酰氨醇類耐藥基因檢測(cè)率為100%，但對(duì)酰氨醇類藥物表現(xiàn)耐藥表型的菌株僅有3株，也存在耐藥基因與耐藥表型不對(duì)應(yīng)的情況。其原因可能是發(fā)現(xiàn)的耐藥基因不是控制RA耐藥的關(guān)鍵基因。

本試驗(yàn)檢測(cè)到分泌型毒力因子12個(gè)（eccA1、ricA、escN等），沈如玉［15］的研究發(fā)現(xiàn)Ⅸ型分泌系統(tǒng)（T9SS）組分基因突變株毒力與野生株相比顯著降低，且其分泌蛋白中有9個(gè)T9SS效應(yīng)分子與野生株差異表達(dá)。細(xì)胞表面毒力因子20個(gè)（algC、ompA、cpsB等），Hu等［16］的研究發(fā)現(xiàn)，RA的OmpA基因缺失株對(duì)雛鴨的致死力較野生株下降了90%。莢膜多糖（Capsular polysaccharide，CPS）可保護(hù)細(xì)菌細(xì)胞免受宿主免疫機(jī)制的影響，包括抗吞噬和抗溶菌活性、免疫逃避和免疫調(diào)節(jié)［17］。代謝調(diào)控型毒力元件108個(gè)（mgtB、phzH、bplF等），Guo等［18］的研究發(fā)現(xiàn)fur缺失后導(dǎo)致菌株的半數(shù)致死量由2.0×106 CFU/mL降低為1.6×108 CFU/mL。

本研究從爆發(fā)傳染性漿膜炎的鴨場(chǎng)中成功分離到1株鴨疫里氏桿菌，具有較強(qiáng)的致病力。分離菌株對(duì)多種抗生素敏感，僅對(duì)喹諾酮類抗生素（環(huán)丙沙星和氧氟沙星）耐藥，臨床利用敏感藥物進(jìn)行治療以后效果顯著，還對(duì)分離菌株進(jìn)行了全基因組測(cè)序，共檢測(cè)到68個(gè)耐藥基因和157個(gè)毒力相關(guān)基因，為鴨疫里氏桿菌的流行病學(xué)調(diào)查及臨床治療提供了理論支撐。

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收稿日期：2023-09-05

基金項(xiàng)目：重要家禽疫苗效力評(píng)價(jià)用菌毒種篩選與研究（2022YFD1800602）；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新2020年重大科技研發(fā)專項(xiàng)（2020-620-000-002-04；2020-620-000-002-01）；國(guó)家肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-41）；湖北省科技重大專項(xiàng)-主要?jiǎng)又参锲贩N選育及生物制品研發(fā)項(xiàng)目（2020ABA016）

作者簡(jiǎn)介：王博燾（1999-），男，河北邯鄲人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)榧仪菁?xì)菌病流行病學(xué)調(diào)查，（電話）17349805675（電子信箱）

954724079@qq.com；通信作者，翟新國(guó)（1966-），男，副教授，主要從事重要?jiǎng)游飩魅静》揽匮芯?，（電子信箱）zhaixg1966@163.com；

羅青平（1971-），女，研究員，主要從事禽病防控研究，（電子信箱）qingping0523@163.com。

王博燾，郭云清，張騰飛，等. 一株鴨疫里氏桿菌的分離、鑒定與生物學(xué)特性分析［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，63（9）：156-160，166.