多倍體水稻DHF-CBS基因的抗旱性鑒定

摘要：為探究干旱脅迫下DHF-CBS基因調(diào)控多倍體水稻（Oryza sativa L.）的抗旱機(jī)制，選取2種水稻品種，分別為多倍體植株中花-11（DHF-CBS基因）、突變體植株UC-32（不表達(dá)DHF-CBS基因），對(duì)2種水稻的GUS化學(xué)染色結(jié)果、組織含水量、脫落酸（ABA）含量、硫代巴比妥酸活性物質(zhì)（TBARS）含量、谷胱甘肽（GSH）含量等進(jìn)行分析。結(jié)果表明，干旱脅迫第7天，中花-11仍有部分葉片保持綠色且堅(jiān)挺，干旱脅迫第11天時(shí)整株葉片變黃，甚至有的葉片變枯，經(jīng)過(guò)干旱脅迫后的表型觀察發(fā)現(xiàn)，中花-11比UC-32的抗旱能力強(qiáng)；對(duì)水稻的含水量、ABA含量、TBARS含量、GSH含量進(jìn)行分析，表明中花-11的抗旱性?xún)?yōu)于UC-32，說(shuō)明DHF-CBS基因增強(qiáng)了水稻的抗旱能力。

關(guān)鍵詞：多倍體；水稻（Oryza sativa L.）；DHF-CBS基因；抗旱性

中圖分類(lèi)號(hào)：S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）09-0216-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.09.036 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Identification of drought resistance of polyploid Oryza sativa L. DHF-CBS gene

GE Jie1， HE Yu-chi2， ZHAN Fan1， LI Zhi-long1

（1. College of Life Sciences/Key Laboratory of Agricultural Biotechnology， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China；

2. School of Life Sciences， Hubei University， Wuhan 430062， China）

Abstract： In order to explore the drought resistance mechanism of DHF-CBS gene regulation in polyploid Oryza sativa L. under drought stress， two varieties of Oryza sativa L. were selected， namely polyploid plant Zhonghua-11 （DHF-CBS gene） and mutant plant UC-32 （non expressing DHF-CBS gene），the GUS chemical staining results， tissue moisture content， abscisic acid （ABA） content， thiobarbituric acid reactive substance （TBARS） content， glutathione （GSH） content， etc. of two types of Oryza sativa L. were analyzed. The results showed that on the 7th day of drought stress， some leaves of Zhonghua-11 remained green and firm. On the 11th day of drought stress， the entire plant’s leaves turned yellow， and some leaves even withered，after observing the phenotype under drought stress， it was found that Zhonghua-11 had stronger drought resistance than UC-32. Analysis of the water content， ABA content， TBARS content， and GSH content of Oryza sativa L. showed that the drought resistance of Zhonghua-11 was better than that of UC-32， indicating that the DHF-CBS gene enhanced the drought resistance of Oryza sativa L..

Key words： polyploid； Oryza sativa L.； DHF-CBS gene； drought resistance

DHF-CBS基因（Drought high fertility CBS）是CBS家族的重要成員，含有2個(gè)CBS結(jié)構(gòu)域及特有的PBI結(jié)構(gòu)，CBS結(jié)構(gòu)域常作為參與細(xì)胞能量代謝的傳感器發(fā)揮作用，能夠?qū)?xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡起到維持和調(diào)節(jié)作用，也可能在植物抗逆性和植物生殖發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。但是關(guān)于干旱脅迫下DHF-CBS基因調(diào)控多倍體水稻（Oryza sativa L.）生殖期抗旱的機(jī)制鮮有報(bào)道。DHF-CBS基因與非生物脅迫、花粉和胚特異表達(dá)相關(guān)，可能參與開(kāi)花期抗旱性調(diào)控［1］。前期比較蛋白質(zhì)組學(xué)和基因芯片數(shù)據(jù)分析均表明，CBS家族成員DHF-CBS基因在花藥中顯著高表達(dá)，GUS染色和定量PCR均證實(shí)其在花藥中的優(yōu)勢(shì)表達(dá)。干旱脅迫下DHF-CBS基因花粉育性和結(jié)實(shí)率均顯著下降，基因功能補(bǔ)償后恢復(fù)正常，表明該基因可能參與生殖階段抗旱性調(diào)控［2］。因此，開(kāi)展DHF-CBS基因?qū)Χ啾扼w水稻花期抗旱性的調(diào)控研究具有一定的理論和實(shí)踐意義。

干旱脅迫嚴(yán)重影響作物的生長(zhǎng)、細(xì)胞代謝和作物產(chǎn)量。糧食作物受到干旱的影響導(dǎo)致大幅減產(chǎn)，對(duì)全世界的糧食安全造成威脅。植物對(duì)干旱的適應(yīng)性包含誘發(fā)防御基因表達(dá)、抑制發(fā)育相關(guān)基因、促進(jìn)氣孔關(guān)閉、抑制細(xì)胞分裂和分化等［3］。多倍體水稻相對(duì)二倍體水稻基因組倍性增加，不僅使抗性基因的數(shù)量增加、遺傳變異范圍變廣，而且提高了優(yōu)良基因組合的概率，增強(qiáng)水稻對(duì)各種極端環(huán)境的適應(yīng)能力，是抗旱研究的良好材料。水稻在不同發(fā)育階段對(duì)干旱脅迫的應(yīng)激響應(yīng)方式和程度有很大不同。水稻生殖期是對(duì)干旱最敏感的時(shí)期，受干旱影響最大的是水稻花粉發(fā)育，干旱導(dǎo)致大量花粉發(fā)育不正常，最終導(dǎo)致不育，這種不可逆變化嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量。產(chǎn)量是評(píng)價(jià)水稻抗旱性的關(guān)鍵指標(biāo)，開(kāi)花階段的抗旱性和產(chǎn)量形成直接相關(guān)。多倍體化是推動(dòng)植物進(jìn)化和新品種形成的重要因素，多倍體植物較二倍體植物表現(xiàn)出更高的環(huán)境適應(yīng)能力。多倍體植物氣孔變大、密度變小、表皮加厚，這些特征減少了水分流失，提高了抗旱性。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻品種為多倍體植株中花-11（DHF-CBS基因）、突變體植株UC-32（不表達(dá)DHF-CBS基因），均由湖北大學(xué)提供，盆栽種植于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)。

1.2 方法

1.2.1 水稻生殖期干旱脅迫 挑選健康、子粒飽滿(mǎn)的水稻種子，催芽48 h，種子露白后，選取長(zhǎng)勢(shì)相近且發(fā)芽生長(zhǎng)良好的種子，放于人工氣候箱中，光照時(shí)間∶黑暗時(shí)間=16 h∶8 h。種子成苗后，移栽到溫室土壤中繼續(xù)培養(yǎng)。 待其生長(zhǎng)至生殖期，對(duì)其進(jìn)行干旱脅迫，安排3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 GUS染色檢測(cè)基因DHF-CBS啟動(dòng)子的活性 為確保其準(zhǔn)確性，對(duì)中花-11和UC-32進(jìn)行GUS染色，檢測(cè)DHF-CBS基因的表達(dá)情況，基因的啟動(dòng)子位于5′端，處于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游，參與基因的一系列表達(dá)和調(diào)控，可以被RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合，是重要的順式元件。

1.2.3 植物相對(duì)含水量 植物組織含水量反映植物組織的水分生理狀況［4］，測(cè)定水稻根、莖、葉組織的相對(duì)含水量可以明確不同品種間水稻的抗旱差異。水在作物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，水參與各種代謝過(guò)程［5］，其含量直接影響作物的新陳代謝速度。植物組織中的水分以2種狀態(tài)存在：一種是與原生質(zhì)膠體緊密結(jié)合的結(jié)合水，另一種是可以自由移動(dòng)的游離水。游離水和結(jié)合水的含量與植物的生長(zhǎng)和抗旱性密切相關(guān)。當(dāng)游離水與結(jié)合水的含量較高時(shí)，植物組織或器官的代謝活性通常更旺盛，生長(zhǎng)也更快；當(dāng)游離水與結(jié)合水的含量較低時(shí)，植物生長(zhǎng)速度較慢 ［6］。因此，游離水和結(jié)合水的含量可以作為植物組織代謝活性和抗逆性的重要生理指標(biāo)。一般情況下，作物生長(zhǎng)旺盛的部位（如根尖、綠葉、幼苗等）的含水量較高，為60%～90%；在休眠期作物的含水量相對(duì)較少，約為40%，干燥種子中含水量最少，約為10%［7］。作物直接從土壤中吸收水分，土壤含水量是直接影響作物根系吸水的重要因素。

1.2.4 脫落酸含量 脫落酸（ABA）是植物體內(nèi)產(chǎn)生的一種抑制植物生長(zhǎng)的應(yīng)激激素，它能夠促使植物氣孔關(guān)閉，降低蒸騰作用，促進(jìn)植物組織葉片脫落［8］。在缺水條件下，植物葉片中ABA含量增加，導(dǎo)致氣孔關(guān)閉。這是因?yàn)锳BA促進(jìn)鉀離子、氯離子和蘋(píng)果酸離子的流出，從而促進(jìn)氣孔關(guān)閉。在植物葉片上噴灑ABA水溶液可以關(guān)閉氣孔，降低蒸騰速率。因此，ABA可以作為一種抗蒸騰劑。一般來(lái)說(shuō)，干旱、寒冷、高溫、鹽度和內(nèi)澇等不利條件可以迅速使植物體內(nèi)的ABA含量增加，增強(qiáng)其抗逆性。ABA能顯著減少高溫對(duì)葉綠體超微結(jié)構(gòu)的損傷，提高葉綠體的熱穩(wěn)定性；ABA可以誘導(dǎo)某些酶的生物合成，提高植物的抗寒性、耐澇性和耐鹽性。ABA也可以作為植物抵御鹽、熱和冷損傷的物質(zhì)，這可能與其促進(jìn)植物產(chǎn)生新的應(yīng)激蛋白有關(guān)。

1.2.5 硫代巴比妥酸活性物質(zhì) 脂質(zhì)過(guò)氧化是植物和動(dòng)物細(xì)胞損傷的一種公認(rèn)機(jī)制，被用作細(xì)胞和組織氧化應(yīng)激的指標(biāo)?；钚匝跖c生物膜的磷脂、酶和膜受體相關(guān)的多不飽和脂肪酸側(cè)鏈及核酸等大分子物質(zhì)反應(yīng)形成脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，如丙二醛（MDA）［9］。MDA可通過(guò)與硫代巴比妥酸的受控反應(yīng)進(jìn)行定量，生成硫代巴比妥酸活性物質(zhì)（TBARS）［10］。

1.2.6 谷胱甘肽含量 DHF-CBS基因是調(diào)控谷胱甘肽（GSH）酶的重要影響因子，DHF-CBS是編碼同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為胱硫醚的關(guān)鍵基因。谷胱甘肽酶功能缺失會(huì)導(dǎo)致同型半胱氨酸含量升高，造成不可逆的DNA損傷，同時(shí)阻礙下游谷胱甘肽的合成，抗氧化能力下降［11］。胱硫醚β-合成酶是同型半胱氨酸與絲氨酸縮合形成胱硫醚的關(guān)鍵酶，胱硫醚β-合成酶在裂解酶的作用下形成半胱氨酸和α-酮丁酸，最后半胱氨酸經(jīng)過(guò)后續(xù)轉(zhuǎn)化形成抗氧化的小分子谷胱甘肽［12］。胱硫醚β-合成酶的功能缺失導(dǎo)致同型半胱氨酸代謝受阻，一方面高同型半胱氨酸易使DNA產(chǎn)生不易修復(fù)的損傷，另一方面，下游抗氧化物谷胱甘肽的合成受阻，造成過(guò)氧化物及自由基的過(guò)量產(chǎn)生［13］。谷胱甘肽是一種抗氧化劑，具有增強(qiáng)生物抗氧化功能、促進(jìn)生長(zhǎng)等功能。作為一種抗氧化劑，它可以幫助生物體消除自由基和過(guò)氧化物，從而保持生物體的相對(duì)穩(wěn)定。

谷胱甘肽具有抗氧化、抗應(yīng)激及促進(jìn)碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代謝的作用。谷胱甘肽調(diào)節(jié)植物中各種酶的活性，增強(qiáng)作物對(duì)寒冷、干旱、干熱和其他脅迫的抵抗力［14，15］。氧化型谷胱甘肽也可以在植物中轉(zhuǎn)化為還原型谷胱甘肽，具有提高作物抗逆性的作用。谷胱甘肽具有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，可以增強(qiáng)生物體對(duì)不良環(huán)境的抵抗力。植物在脅迫條件下可能會(huì)增加體內(nèi)活性氧的含量，從而發(fā)生植物的氧化應(yīng)激反應(yīng)。為了避免對(duì)自身組織和細(xì)胞的氧化損傷，植物會(huì)在活性氧含量超過(guò)一定閾值后激活其抗氧化系統(tǒng)，從而清除體內(nèi)大部分多余的活性氧，并確保其在氧化和還原過(guò)程中的穩(wěn)態(tài)［16］。谷胱甘肽幫助植物保持正常的免疫系統(tǒng)功能，具有抗氧化和整合解毒功能。谷胱甘肽能參與到生物體的轉(zhuǎn)化作用中，把有害物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無(wú)害物質(zhì)，故測(cè)定其生理指標(biāo)對(duì)DHF-CBS功能鑒定有重要意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 DHF-CBS基因影響水稻抗旱特性

由圖1可知，在干旱脅迫第3天時(shí)UC-32葉片出現(xiàn)卷曲、葉片末端發(fā)黃，干旱脅迫第7天，整株葉片變黃，甚至有的葉片變枯。

由圖2可知，干旱脅迫第7天，中花-11仍有部分葉片保持綠色且堅(jiān)挺，干旱脅迫第11天時(shí)整株葉片變黃，甚至有的葉片變枯。經(jīng)過(guò)干旱脅迫后的表型觀察發(fā)現(xiàn)，中花-11比UC-32的抗旱能力強(qiáng)，說(shuō)明DHF-CBS基因增強(qiáng)了水稻的抗旱能力。

2.2 DHF-CBS基因的瞬時(shí)定位表達(dá)

研究DHF-CBS基因的亞細(xì)胞定位，構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，暗培養(yǎng)48 h，在Olympus BX51熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果（圖3）表明，約80%的煙草葉片發(fā)出GFP的綠色熒光，植株細(xì)胞質(zhì)膜和葉脈都發(fā)出綠色熒光，煙草氣孔內(nèi)壁發(fā)出較強(qiáng)的綠色熒光，表明DHF-CBS蛋白是參與組成細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的蛋白。DHF-CBS基因在氣孔內(nèi)壁有較強(qiáng)表達(dá)，與水分調(diào)控關(guān)系比較密切。

2.3 GUS染色結(jié)果分析

由于絕大多數(shù)植物細(xì)胞不具有內(nèi)源β-葡萄糖苷酶（GUS）活性，因此GUS基因被廣泛用作轉(zhuǎn)基因植物的報(bào)告基因。GUS可以水解X-Gluc形成藍(lán)色物質(zhì)。初始產(chǎn)物是無(wú)色吲哚衍生物，沒(méi)有顏色，通過(guò)氧化二聚化形成5，5’-二溴-4，4’-二氯靛藍(lán)染料。對(duì)試驗(yàn)材料的整花、種子及葉片前、中、末段進(jìn)行GUS染色，染色結(jié)果（圖4）可知，UC-32各部位均未顯藍(lán)色。而中花-11各部位都有藍(lán)色顯現(xiàn)，在花萼、柱頭、花絲、花藥中藍(lán)色明顯，表達(dá)量較高；在種子和葉片上也觀察到明顯的藍(lán)色物質(zhì)；在葉片前端幼嫩葉片部位有藍(lán)色點(diǎn)狀分布，表明GUS基因表達(dá)量較高，葉片中部GUS基因表達(dá)量較少。DHF-CBS基因在水稻中花-11中的不同組織部位存在特異性表達(dá)，水稻花中表達(dá)量較高。

2.4 組織含水量分析

對(duì)中花-11和UC-32進(jìn)行干旱脅迫處理，5 d后分別測(cè)定水稻葉、莖、根組織的含水量，重復(fù)5次并取平均值。由圖5可知，中花-11葉、莖、根組織的含水量均高于UC-32，表明中花-11的抗旱性?xún)?yōu)于UC-32。

2.5 ABA含量分析

分別在1、3、6、24 h時(shí)測(cè)定受到干旱脅迫和沒(méi)有受到干旱脅迫的水稻ABA含量，由圖6可知，24 h時(shí)，沒(méi)有受到干旱脅迫的水稻，ABA含量均明顯低于干旱脅迫。UC-32的ABA含量上升幅度明顯大于中花-11，可能是一種抗逆保護(hù)機(jī)制，在缺水條件下，植物葉片中ABA含量增加，導(dǎo)致氣孔關(guān)閉。這是因?yàn)锳BA促進(jìn)鉀離子、氯離子和蘋(píng)果酸離子的流出，從而促進(jìn)氣孔關(guān)閉，降低蒸騰速率。水稻通過(guò)增加ABA含量抑制葉片氣孔的開(kāi)放，促進(jìn)外部營(yíng)養(yǎng)器官的脫落，減少水稻在干旱脅迫下對(duì)營(yíng)養(yǎng)分配的壓力，把大部分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和促生長(zhǎng)因子集中分配給根和莖。

2.6 TBARS含量分析

由圖7可知，在沒(méi)有干旱脅迫下，UC-32的TBARS含量略高于中花-11。在干旱脅迫5 d后，中花-11和UC-32的TBARS含量均升高，其中，UC-32的增加幅度明顯高于中花-11，說(shuō)明在干旱脅迫下，UC-32的脂質(zhì)過(guò)氧化程度高于中花-11，其氧化損傷程度也較高，對(duì)膜的損傷較大。

1.中花-11；2.中花-11（干旱）；3.UC-32；4.UC-32（干旱）

2.7 GSH含量分析

由圖8可知，在沒(méi)有干旱脅迫下，中花-11的GSH含量明顯高于UC-32。在干旱脅迫5 d后，中花-11和UC-32的GSH含量均升高，其中，UC-32升高的幅度明顯高于中花-11，結(jié)果表明，中花-11對(duì)GSH的需求量更小，也從側(cè)面反映出UC-32的抗旱能力低于中花-11。

3 小結(jié)

抗旱是一個(gè)綜合的生理過(guò)程，與品種抗旱強(qiáng)度有關(guān)的因素很多，本研究只探討了DHF-CBS基因與水稻抗旱性的關(guān)系，UC-32的GSH含量整體低于中花-11的原因需要進(jìn)一步研究。干旱脅迫第7天，中花-11仍有部分葉片保持綠色且堅(jiān)挺，干旱脅迫第11天時(shí)整株葉片變黃，甚至有的葉片變枯，經(jīng)過(guò)干旱脅迫后的表型觀察發(fā)現(xiàn)，中花-11比UC-32的抗旱能力強(qiáng)；對(duì)水稻的含水量、ABA含量、TBARS含量、GSH含量進(jìn)行分析，表明中花-11的抗旱性?xún)?yōu)于UC-32，說(shuō)明DHF-CBS基因增強(qiáng)了水稻的抗旱能力，本研究為進(jìn)一步解析DHF-CBS基因在水稻抗旱中的作用機(jī)制提供參考。

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收稿日期：2023-04-17

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32160494）；新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（dxscx2022068）

作者簡(jiǎn)介：葛 杰（1978-），女，新疆烏魯木齊人，副教授，博士，主要從事植物抗逆分子生物學(xué)研究，（電話(huà)）17799659806（電子信箱）29257741@qq.com。

葛 杰，何玉池，展 帆，等. 多倍體水稻DHF-CBS基因的抗旱性鑒定［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，63（9）：216-220．