簡化“探究抗生素對(duì)細(xì)菌的選擇作用”的實(shí)驗(yàn)操作

摘 要：本文旨在探索并簡化“探究抗生素對(duì)細(xì)菌的選擇作用”的實(shí)驗(yàn)操作。首先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，探索菌種的選擇和轉(zhuǎn)接菌種條件對(duì)抑菌圈觀測的影響，然后通過正式實(shí)驗(yàn)對(duì)比無菌環(huán)境和普通環(huán)境下操作實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。筆者通過分析發(fā)現(xiàn)，抑菌圈的大小及變化與超凈工作臺(tái)上操作的結(jié)果差異不顯著。通過對(duì)二者結(jié)果的對(duì)比和討論，以期擴(kuò)大“微生物培養(yǎng)”實(shí)驗(yàn)的開展范圍。

關(guān)鍵詞：抗生素；大腸桿菌；抑菌圈；普通實(shí)驗(yàn)桌；超凈工作臺(tái)

文章編號(hào)：1003-7586（2024）06-0062-04 中圖分類號(hào)：G633.91 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

“探究抗生素對(duì)細(xì)菌的選擇作用”是人教版普通高中教科書《生物學(xué)·必修2·遺傳與進(jìn)化》第6章第3節(jié)中的探究性實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)可以幫助學(xué)生理解抗生素對(duì)細(xì)菌的選擇作用，樹立進(jìn)化與適應(yīng)觀，對(duì)于發(fā)展學(xué)生的科學(xué)探究素養(yǎng)及將知識(shí)應(yīng)用于解決實(shí)際問題的科學(xué)思維具有較大價(jià)值。但很多學(xué)校由于缺乏超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱等實(shí)驗(yàn)設(shè)備而無法開展該實(shí)驗(yàn)。因此本文旨在探索簡化實(shí)驗(yàn)操作，讓不具備“微生物培養(yǎng)”實(shí)驗(yàn)條件的學(xué)校也能開展該實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容為：進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，包括探索菌種的選擇、轉(zhuǎn)接菌種時(shí)能否用無菌水、污染是否會(huì)影響對(duì)抑菌圈的觀測；進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，包括超凈工作臺(tái)與普通實(shí)驗(yàn)桌上操作的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較，以期判斷缺乏超凈工作臺(tái)和恒溫培養(yǎng)箱的情況下能否及如何開展該實(shí)驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

大腸埃希氏菌（大腸桿菌）。

1.2 儀器設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、移液槍、一次性吸液槍頭、接種環(huán)、涂布器、培養(yǎng)皿、膠頭滴管、記號(hào)筆、量尺、酒精燈、鑷子、離心管。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

無菌水、LB固體培養(yǎng)基、^［1］無菌濾紙片、頭孢克肟藥敏紙片（5 μg/片）、頭孢他啶藥敏紙片（30 μg/片）、阿莫西林藥敏紙片（25 μg/片）、氧氟沙星藥敏紙片（5 μg/片）。

2 實(shí)驗(yàn)原理和設(shè)計(jì)思路

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

一般情況下，一定濃度的抗生素會(huì)殺滅細(xì)菌，但變異的細(xì)菌可能產(chǎn)生耐藥性。在實(shí)驗(yàn)室連續(xù)培養(yǎng)的過程中，相應(yīng)抗生素耐藥細(xì)菌的比例可能會(huì)隨之增加，因此通過測量并分析抑菌圈的直徑變化，可推測細(xì)菌耐藥基因頻率的變化。

2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路如圖1所示。

實(shí)驗(yàn)過程中簡化實(shí)驗(yàn)操作：用膠頭滴管代替移液槍；用普通實(shí)驗(yàn)桌代替超凈工作臺(tái)；轉(zhuǎn)接菌種使用無菌水代替液體培養(yǎng)基；室溫下培養(yǎng)代替恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

3 實(shí)驗(yàn)過程

3.1 問卷調(diào)查“藥店抗生素類藥物出售情況”

筆者走訪泉州南安梅山鎮(zhèn)區(qū)6家藥店，調(diào)查后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。調(diào)查結(jié)果為：抗生素是處方藥；常1a1bc8d63355473bb94dc7b0d5f5373d見抗生素類有沙星類、青霉素類、頭孢類等；購買量較多的是氧氟沙星、阿莫西林、頭孢他啶、頭孢克肟。因此本文以這4種抗生素來開展實(shí)驗(yàn)。

3.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)

3.2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

①篩選菌種：大腸桿菌、乳酸菌；②探明轉(zhuǎn)接菌種時(shí)能否用無菌水；③探索微生物污染是否會(huì)影響對(duì)抑菌圈的觀測。

3.2.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)方案

設(shè)計(jì)4組實(shí)驗(yàn)：①大腸桿菌＋無菌水；②大腸桿菌＋無菌肉湯；③空白平板暴露于空氣5 min；④乳酸菌＋無菌肉湯。均置于37℃下恒溫培養(yǎng)3 d，每天定時(shí)觀察菌落的生長情況。

3.3 正式實(shí)驗(yàn)

將超凈工作臺(tái)上的操作與普通實(shí)驗(yàn)桌上的操作進(jìn)行比較。

3.3.1 超凈工作臺(tái)上操作

配制培養(yǎng)基，對(duì)培養(yǎng)基等實(shí)驗(yàn)用具進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理，對(duì)超凈工作臺(tái)噴灑75%的酒精，并開啟紫外燈進(jìn)行消毒后，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行接種操作。在培養(yǎng)皿底部用記號(hào)筆進(jìn)行劃線分區(qū)并標(biāo)注，取大腸桿菌菌種用無菌水稀釋，用移液槍取200 μL的菌液涂布于平板上，在平板上放置無菌濾紙片和3個(gè)同一種抗生素的藥敏濾紙片，重復(fù)3個(gè)平板，共做了4組不同抗生素的實(shí)驗(yàn)——頭孢他啶、阿莫西林、氧氟沙星、頭孢克肟，倒置在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)8～10 h。記錄抑菌圈的直徑比，后選取抑菌圈邊緣的細(xì)菌置于無菌水中，重復(fù)上述步驟，連續(xù)培養(yǎng)3代。

3.3.2 普通實(shí)驗(yàn)桌上操作

先對(duì)普通實(shí)驗(yàn)桌噴灑75%的酒精進(jìn)行消毒，在培養(yǎng)皿底部用記號(hào)筆進(jìn)行劃線分區(qū)并標(biāo)注，取大腸桿菌菌種并用無菌水稀釋，用滅菌后的膠頭滴管取2滴菌液涂布于平板上，并在平板上放置無菌濾紙片和3個(gè)同一種抗生素的藥敏濾紙片，重復(fù)3個(gè)平板，共進(jìn)行4組不同抗生素的實(shí)驗(yàn)，之后在室溫條件下倒置培養(yǎng)8～10 h。測量抑菌圈的直徑并記錄，之后取抑菌圈邊緣的細(xì)菌置于無菌水中，重復(fù)上述步驟連續(xù)培養(yǎng)3代。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將接種環(huán)、涂布器、膠頭滴管、鑷子、離心管及培養(yǎng)皿等用具進(jìn)行滅菌，防止大腸桿菌擴(kuò)散到環(huán)境中。

3.3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的記錄

測量每一代大腸桿菌的抑菌圈直徑并記錄，同時(shí)與上一代進(jìn)行比較，獲取差值以及抑菌圈縮小百分比。抑菌圈縮小百分比=（上一代抑菌圈直徑－當(dāng)代抑菌圈直徑）/上一代抑菌圈直徑×100%。^［2］

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論

4.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表1所示：

4.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)論

大腸桿菌繁殖周期短，約為8 h左右，而空氣中的雜菌、乳酸菌的繁殖周期均長于大腸桿菌。因此在72 h內(nèi)，如果培養(yǎng)基受空氣中雜菌污染，大腸桿菌仍是優(yōu)勢菌種，不影響抑菌圈的觀察。

4.3 正式實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

在普通實(shí)驗(yàn)桌和超凈工作臺(tái)上操作的4種抗生素對(duì)大腸桿菌所形成的抑菌圈比較如圖2所示，其抑菌圈直徑大小的比較及前后代抑菌圈的直徑縮小值、抑菌圈縮小百分比如表2、表3所示。

4.4 正式實(shí)驗(yàn)的結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，不同抗生素對(duì)大腸桿菌的抑菌效果不同，普通實(shí)驗(yàn)桌的結(jié)果顯示：氧氟沙星＞頭孢他啶＞頭孢克肟＞阿莫西林；超凈工作臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：頭孢他啶＞氧氟沙星＞頭孢克肟＞阿莫西林。筆者推測在普通實(shí)驗(yàn)桌和超凈工作臺(tái)上操作得到的抑菌圈大小差異可能與接種的菌液量大小有關(guān)，由于膠頭滴管無法精確量取菌液，導(dǎo)致在兩個(gè)平臺(tái)上操作時(shí)量取的菌液量不同。大腸桿菌對(duì)不同抗生素的耐藥性存在差異，且隨抗生素使用頻率的增加，其耐藥性逐代增強(qiáng)。

對(duì)比結(jié)果顯示：在普通實(shí)驗(yàn)桌上操作也可以得到明顯的抑菌圈，且與超凈工作臺(tái)上無菌操作得到的結(jié)果差異不大。所以具有高壓蒸汽滅菌鍋的學(xué)校就能夠開展該實(shí)驗(yàn)。

5 小結(jié)與討論

大腸桿菌繁殖周期短，通常在8 h左右，該時(shí)間顯著短于空氣中雜菌的繁殖周期。因此在實(shí)施“探究抗生素對(duì)細(xì)菌的選擇作用”實(shí)驗(yàn)的過程中，如果培養(yǎng)基受空氣中雜菌污染，大腸桿菌仍是優(yōu)勢菌種，不影響對(duì)其抑菌圈的觀測。因此具有高壓蒸汽滅菌鍋的學(xué)?？梢詭ьI(lǐng)學(xué)生在普通實(shí)驗(yàn)桌上實(shí)施該實(shí)驗(yàn)，用膠頭滴管取液，轉(zhuǎn)接菌種時(shí)用無菌水稀釋，室溫下培養(yǎng)即可。該實(shí)驗(yàn)有助于學(xué)生理解抗生素對(duì)細(xì)菌的選擇作用，并幫助其樹立進(jìn)化與適應(yīng)觀。

參考文獻(xiàn)

［1］施大華，申定健.“探究抗生素對(duì)細(xì)菌的選擇作用”實(shí)驗(yàn)拓展設(shè)計(jì)［J］.生物學(xué)教學(xué)，2020，45（11）：47-49．

［2］李毅，王秀紅.“探究多種抗生素對(duì)連續(xù)傳代細(xì)菌的選擇作用”實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性設(shè)計(jì)［J］.生物學(xué)教學(xué)，2021，46（8）：63-64．