生物膜治療與陰道微生態(tài)修復研究進展

［摘 要］女性陰道內含多種微生物，這些微生物相互制約、有秩序地定植于陰道黏膜上皮，共同維持陰道微生態(tài)的穩(wěn)定。隨著抗菌藥物的廣泛應用，真菌或細菌為了適應生存環(huán)境逐漸形成粘附態(tài)的生物膜，借以逃避宿主免疫細胞清除，產生耐藥性，引起疾病的復發(fā)。本文介紹了生物膜在女性陰道微生態(tài)中的作用，以及目前針對生物膜治療的一些藥物，以期能夠加強對生物膜在陰道微生態(tài)中的作用的認識，更好地恢復陰道微生態(tài)平衡。

［關鍵詞］陰道微生態(tài)；生物膜；外陰陰道假絲酵母菌病；細菌性陰道病；需氧菌性陰道炎

Doi：10.3969/j.issn.1673-5293.2024.09.016

［中圖分類號］R173""" ［文獻標識碼］A

［文章編號］1673-5293（2024）09-0099-06

Research progress of biofilm therapy and vaginal microecological restoration

［Abstract］ The female vagina contains a variety of microorganisms，which restrict each other and colonize in the vaginal mucosal epithelium in an orderly manner to maintain the stability of the vaginal microecology.With the wide use of antibiotics，fungi or bacteria gradually form adherent biofilms in order to adapt to the living environment，so as to evade the clearance of host immune cells，produce drug resistance，and cause disease recurrence.This paper introduced the role of biofilm in the female vaginal microecology，and some drugs for biofilm treatment，in order to strengthen the understanding of the role of biofilm in vaginal microecology，and better restore the balance of vaginal microecology.

［Key words］ vaginal microecology;biofilm;vulvovaginal candidiasis;bacterial vaginosis;aerobic vaginitis

1女性陰道微生態(tài)概述

女性陰道中存在細菌、真菌、支原體、衣原體、病毒等多種微生物，這些微生物共同生長、相互拮抗，共同組成復雜的陰道菌群，陰道的解剖結構、微生物菌群、局部免疫及內分泌調節(jié)等組成一個復雜的動態(tài)系統，共同組成女性陰道微生態(tài)環(huán)境。陰道微生態(tài)的檢測不僅需要從形態(tài)學角度去評估陰道中菌群的密集度、菌群的多樣性、優(yōu)勢菌、病原微生物、各種炎癥疾病評分，還需要從功能學角度，運用化學方法檢測微生物的代謝產物及酶的活性，從而評價陰道微生態(tài)的狀況［1］。

根據病原菌的不同，可將陰道感染分為外陰陰道假絲酵母菌?。╲ulvovaginal candidiasis，VVC）、細菌性陰道病（bacterial vaginosis，BV）、需氧菌性陰道炎（aerobic vaginitis，AV）、滴蟲陰道炎（trichomonal vaginitis，TV）和細胞溶解性陰道病（cytolytic vaginosis，CV）等。在這些確定的陰道感染中，除了要殺滅致病微生物，還要特別注意恢復正常的微生態(tài)狀態(tài)，以減少陰道感染的復發(fā)。

2生物膜與女性陰道微生態(tài)失衡

2.1生物膜的結構基礎

生物膜是真菌或細菌為了適應生存環(huán)境而形成的一種粘附態(tài)的生存形式。作為與浮游狀態(tài)相對應的生存方式，陰道內生物膜中的微生物與陰道上皮細胞緊密粘附，包裹于它們自身產生的細胞外基質中，并形成一定微環(huán)境。生物膜的形成過程主要包括菌體的黏附、聚集、成熟和播散四個階段。生物膜內播散的菌體可再次粘附于陰道上皮細胞中，引發(fā)新一輪的感染，從而影響陰道內正常的微生態(tài)。

此外，生物膜可以使病原體逃避宿主免疫細胞清除作用，可通過阻止免疫細胞模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）識別，干擾中性粒細胞、巨噬細胞功能，降低細胞因子和趨化因子含量，破壞陰道局部黏膜組織，還可將有效免疫轉化為無效免疫等方式逃避免疫系統的識別與清除，使陰道局部免疫系統無法清除生物膜結構［2］。生物膜還可充當屏障作用，阻擋抗菌藥物滲透，從而使生物膜下菌體的藥物濃度減小。同時，生物膜內會形成一定的微環(huán)境，使菌體處于休眠狀態(tài)，代謝降低，對藥物敏感性降低，并伴隨一些耐藥基因和應激信號通路的出現，從而表現出更強的耐藥性，使治療周期延長［3］。

因此，陰道內病原菌生物膜的存在，不僅可增強菌體的致病能力，還為致病菌逃避陰道黏膜免疫和持續(xù)定植提供了條件，從而導致疾病反復發(fā)作，影響陰道微生態(tài)的恢復。

2.2 VVC生物膜與陰道微生態(tài)失衡

VVC是由假絲酵母菌引起的外陰陰道炎癥，約75%婦女一生中至少患過1次VVC，而約5%～8%的患者發(fā)展為復發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌?。╮ecurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC），RVVC一旦停止鞏固治療，30%～50%會再次發(fā)作［4］。與細菌不同，假絲酵母菌能以菌絲或孢子兩種狀態(tài)存在，菌絲具有更強的粘附性、侵襲性和毒性，而孢子細胞具有更強的傳播性。Lagree等［5］觀察發(fā)現，菌絲相更有利于形成高度纏繞的生物膜和細胞外基質生成，而生物膜的覆蓋為細胞的聚集和粘附提供了一個支架，同時也是菌體吸收水分和營養(yǎng)的必經通道。在成熟階段，酵母細胞脫落并作為種子傳播，通過細胞增殖擴散形成新的生物膜。成熟的白假絲酵母菌生物膜呈一個有機的三維結構，其外層為細胞外基質，內部包裹孢子、菌絲體和假菌絲。白假絲酵母菌的菌絲/孢子二相性轉化，使其增強了生物膜的作用，更加不利于陰道正常微生態(tài)恢復。本團隊的一項研究發(fā)現，RVVC的復發(fā)源于陰道內同一定植菌株的潛伏，而真菌生物膜的存在，使同一真菌潛伏更易實現，增加了VVC的復發(fā)頻率［6］。

此外，多項研究證實，陰道微環(huán)境中假絲酵母菌耐藥與生物膜的形成密切相關。其可能的機制有：①屏障作用，生物膜本身作為屏障，使藥物滲透更加迂回，減少了細胞內的藥物濃度；②生物膜的存在增強了細胞膜上膜轉運體系統如ATP結合盒超家族轉運蛋白和主要協助轉運超家族（major facilitator superfamily，MFS）表達，從而使胞內的藥物外排增加，胞內藥物濃度進一步降低；③與唑類藥物結合相關基因，如麥角固醇基因產生突變，唑類化合物與麥角固醇蛋白的親和力較低，降低了藥物抑制作用；④多種應激誘導的途徑被激活，有助于抗真菌耐藥性的產生，這些通路包括絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、鈣調神經磷酸酶（calcineurin，CaN）和熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）等［7］。

VVC生物膜的形成是一個復雜的過程，受多種基因調控，如參與孢子粘附的上皮粘附分子（EPA1/6/7），以及CSH1、CZF1、EAP1基因，與孢子粘附和克隆相關的凝集素樣序列ALS，ALS1或ALS3的菌株比不表達這兩種基因的菌株具有更強的粘附能力，且可調節(jié)其他粘附相關基因表達［8］。菌絲壁蛋白1（hyphal wall protein 1，Hwp1）、黏附素樣壁蛋白（adhesin-like wall proteins，Awp）與菌絲生成密切相關。β-1，3葡聚糖是假絲酵母菌生物膜基質的重要成分，具有保護生物膜中的菌體細胞免受宿主免疫系統和抗菌藥物的清除作用，并受ADH5、GCA1、GCA2、FKS1等多基因調控［7］。鋅響應激活蛋白1（zinc finger antiviral protein 1，ZAP1）在生物膜的形成中是必需的，ZAP1可通過調節(jié)ADH、GCA2及GCA1促進β-1，3 glucan的表達，通過調節(jié)法尼醇（調節(jié)菌絲生成）的積累，在生物膜中有效地形成菌絲［9］。研究發(fā)現熱休克蛋白90（heat shock proteins 90，HSP90）作為生物膜播散的關鍵調節(jié)劑，在生物膜播散過程起主要作用［10］。

VVC生物膜的形成可導致更加嚴重的陰道微生態(tài)失衡，假絲酵母菌生物膜的存在削弱了抗真菌藥物的殺傷作用，加速了真菌耐藥的產生，使致病真菌更好地潛伏粘附于陰道上皮中，從而導致陰道微生態(tài)的紊亂和失衡。因此，維持正常陰道微生態(tài)需要徹底清除假絲酵母菌形成的生物膜，并在日常治療過程中，提早預防生物膜的形成。

2.3 BV生物膜與陰道微生態(tài)失衡

BV是由于陰道內厭氧菌如陰道加德納菌（gardnerella vaginalis，GV）等過盛繁殖，使原來的優(yōu)勢菌群（乳桿菌）數量減少，進而產生一系列臨床癥狀，在育齡期婦女中較為常見。BV易復發(fā)，治療后2月的復發(fā)率為40%，治療后12個月的復發(fā)率高達60%［11］。BV的復發(fā)與生物膜形成密切相關，BV患者陰道內形成以陰道加德納菌為主的多種致病菌混合的生物膜，可降低藥物敏感性并增加耐藥性，進而導致BV復發(fā)。

不同于VVC生物膜，BV生物膜的主要特點是由陰道多種混合病原菌共同形成。BV的病原菌種類繁多，如陰道加德納菌、陰道阿托波菌、擬桿菌屬和普氏菌屬等［12］。Swidsinski等［13］研究發(fā)現，在90％的BV患者和10％的非BV女性中可檢出黏附在陰道上皮細胞中的生物膜，其內包含3種特異性的細菌屬，而加德納菌屬比例最高，約占60％～90％，奇異菌屬占l％～40％。進一步研究發(fā)現，在抗生素治療期間BV生物膜代謝活躍，但停藥5周后，重新檢測到包括代謝活躍的細菌生物膜。雖然BV臨床癥狀暫時消退，但由于不能徹底清除生物膜，停止治療后生物膜內病原菌再次繁殖，最終導致BV復發(fā)。

BV生物膜中通常都有GV的存在，GV能形成一個中等強力的生物膜結構，而其他BV相關的厭氧菌則不能形成穩(wěn)定的生物膜。研究證實GV黏附于陰道上皮后，易于后續(xù)參與其他細菌錨定和聚集，GV在BV生物膜形成中起關鍵支配性作用［14-15］。GV可以表達糖基轉移酶，促進細胞外基質的生成和生物膜微環(huán)境組成，GV能釋放陰道溶細胞素，可能抑制陰道黏膜屏障免疫球蛋白A抗體作用。生物膜底層由于氧及營養(yǎng)物質耗盡，出現生長緩慢甚至進入休眠狀態(tài)。由于氧濃度降低，厭氧菌不斷增多。與游離態(tài)GV相比，生物膜內GV的菌體不僅出現代謝狀態(tài)降低，而且細菌毒力因子表達增加，宿主對細菌的免疫反應降低，為細菌的慢性定植和適應不利環(huán)境提供了條件［16-17］。

BV生物膜的存在，導致持續(xù)的乳桿菌減少和厭氧菌增多，引起一系列陰道微生態(tài)改變，而陰道微環(huán)境改變可使BV相關微生物之間出現群體感應效應，導致細菌表型改變，進而反向調整宿主陰道微生態(tài)環(huán)境，使陰道微生態(tài)失衡循環(huán)往復，治療難度增加。

2.4其他陰道炎相關生物膜與陰道微生態(tài)失衡

AV是以陰道內乳桿菌減少或缺失，多種需氧和兼性厭氧菌增多所致。10%～20%的AV患者無癥狀，對于部分有癥狀者其癥狀持續(xù)時間長，間歇性加重且易復發(fā)。AV患者的陰道微生態(tài)具有陰道分泌物pH升高、乳桿菌減少、革蘭陽性球菌或革蘭陰性桿菌量增多、白細胞增多且伴明顯陰道炎癥反應等特點，其陰道微生態(tài)失衡與早產、絨毛膜羊膜炎和流產等不良妊娠結局風險增加相關［18］。AV病原菌復雜多樣，其包含大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、B族鏈球菌、咽峽鏈球菌、肺炎克雷伯菌等，但由于AV診斷相對復雜，以及目前對AV認識不足，關于生物膜的臨床研究較BV和VVC相對較少，現有研究常以大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌為病原菌代表，進行AV相關生物膜探究［19］。AV生物膜的存在增加了AV復發(fā)的可能，導致更加嚴重的陰道微生態(tài)失衡。

TV又稱陰道毛滴蟲病，由陰道毛滴蟲感染所致，是最常見的非病毒性性傳播疾病，其陰道微生態(tài)呈現pH值升高（pH＞6）、陰道分泌物增多伴異味、分泌物黃綠色等特點［20］。目前并未見關于陰道毛滴蟲形成生物膜的報道，但是毛滴蟲可以增強陰道內加德納菌、阿托波菌和普雷沃菌的生物膜形成能力，而被陰道毛滴蟲感染的上述菌株會產生毒力更強的功能［21］。

CV主要表現為陰道內乳桿菌過度繁殖，造成陰道上皮細胞溶解，伴隨外陰瘙癢、灼痛等臨床癥狀。其陰道微生態(tài)呈現陰道分泌物pH值偏低、過度增殖的乳桿菌覆蓋上皮細胞形成“假線索細胞”等特點［22］。研究表明CV患者陰道攜帶的乳酸菌種類并未增多，但是CV患者陰道中卷曲乳桿菌在CV組中表現出更強的產酸能力，CV的發(fā)病機制可能部分基于具有增強產酸能力的葡萄球菌的過度生長，但是目前尚未見關于CV相關病原菌生物膜的報道。

3生物膜治療與陰道微生態(tài)恢復

由于生物膜的屏障作用，以及生物膜內菌株對藥物的抵抗性和耐藥性增強，使得生物膜的清除變得十分困難。與浮游細胞相比，生物膜對免疫防御和抗菌藥物的抵抗力增強，因此，阻止生物膜的形成是防治生物膜相關性感染、徹底恢復陰道微生態(tài)的關鍵步驟。盡管目前無有效藥物可以直接清除生物膜，但已有許多新型藥物證明了對生物膜干擾和抑制性。

3.1新型治療VVC生物膜藥物

法尼醇是一種從真菌中檢測出來的群體感應分子，已有眾多研究證實，當法尼醇濃度大于300μM時可以抑制白假絲酵母菌由酵母相向菌絲相的轉換，從而抑制生物膜的形成及成熟，這種抑制作用可能是通過調節(jié)甲基甾醇單加氧酶25和delta 24-甾醇還原酶來實現的，法尼醇還可以誘導浮游狀態(tài)和生物膜狀態(tài)假絲酵母菌死亡，這對于控制假絲酵母菌特別是耐藥假絲酵母菌的機會性感染至關重要［23］。也有研究報道法尼醇對白念珠菌耐藥株和標準株生物膜的死亡作用以促進壞死為主，且對耐藥株的作用較標準株顯著，這種對生物膜的破壞作用可能和CDR1基因和MCA1基因相關［24］。

棘白菌素類抗真菌藥物可阻斷β-1，3葡聚糖合成，因此可有效阻止真菌生物膜的形成，泊沙康唑與卡泊芬凈協同使用，在體內和體外實驗中表現出對耐唑類的白假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌的生物膜的抑制作用［25］。兩性霉素B脂質體由于含有磷脂分散相，使其更容易通過細胞外基質，直達生物膜內部，更好地殺滅生物膜內菌體。也有研究顯示，兩性霉素B復合銀離子納米微粒表現出更強大的抗菌活性［26］。

目前，一些新興的化合物如陽離子聚甲基丙烯酸酯、己基氨基乙酰丙酸酯醇溶體（hexyl-aminolevulinate ethosome，HAL-ES）、生姜甲醇提取物均被證實對假絲酵母菌生物膜具有一定的抑制作用。對香豆酸酚黏膠液晶系統，以及白假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌和克柔假絲酵母菌生物膜具有殺菌活性，可增強氟康唑對陰道假絲酵母菌生物膜抗真菌活性的抗真菌光動力活性［27］。

3.2新型治療BV生物膜藥物

目前關于BV生物膜治療藥物并不多，常見的候選藥物有酶類、植物提取物、天然抗菌劑等，大多研究集中于通過破壞生物膜主要成分或者干擾生物膜微環(huán)境來實現生物膜的破壞。

細胞外DNA是陰道加德納菌生物膜的重要組成部分，脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）的酶活性可以抑制生物膜形成，并破壞已經成熟的生物膜，具有將陰道加德納菌從生物膜釋放到上清組分的能力，并增強甲硝唑的活性。小鼠實驗證實DNase可將陰道加德納菌的定植率降低10倍，從而證實了DNase作為生物模相關細菌性陰道病治療和減少復發(fā)的潛力［28］。眾多體外實驗證實，溶菌酶既能降解生物膜，又能阻止生物膜的形成。陰道加德納菌生物膜對克林霉素和甲硝唑具有抵抗作用，而溶菌酶的聯合使用可以分別提高兩種抗生素的使用效率，促進生物膜的降解［29］。溶菌酶在較低的濃度（2.5μg/mL）下即可抑制加德納菌的生物膜，升高濃度可以更好地破壞已形成的生物膜。溶菌酶對加德納菌的生長、初始粘附和生物膜形成均有強烈影響，這為進一步研究溶菌酶作為生物膜形成能力調節(jié)劑的作用奠定了堅實的基礎，有助開發(fā)治療細菌性陰道感染的新型藥物［27］。近期有研究報道一種抗菌肽（tilapia piscidin 4，TP4）對BV相關細菌具有廣譜抗菌和抗生物膜活性，但對有益的乳酸菌沒有活性。TP4殺菌劑顯著降低BV相關細菌在感染單一或混合細菌的小鼠中的定植密度。TP4殺菌劑制劑與C57BL/6小鼠陰道有益乳桿菌和陰道組織具有良好的生物相容性。這些結果表明，TP4殺菌劑可能是一種有前景的恢復陰道微生態(tài)平衡的陰道局部用制劑［30］。

百里香精油中的百里香酚被認為具有一系列的藥理特性，包括抗菌和抗真菌作用。研究發(fā)現，天然抗菌劑月桂酰胺精氨酸乙酯（lauramide arginine ethyl ester，LAE）對BV相關的加德納菌、克氏動彎桿和厭氧消化鏈球菌均有抑制作用，克林霉素、甲硝唑與月桂酰胺精氨酸乙酯聯合對陰道加德納菌生物膜有協同作用，但對健康陰道乳酸菌生物膜無協同作用。該研究提示BV相關病原體的生物膜可以通過傳統抗生素和新型抗菌素的協同作用組合來控制，這為有效控制陰道感染，恢復陰道微生態(tài)平衡提供了新的治療策略［31］。

3.3治療其他陰道炎生物膜相關新型藥物

新型銀離子納米顆粒（silver nanoparticles，AgNPs）不僅對對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有抑制作用，還可以抑制二者混合生物膜的形成（MBIC90=1 000ppm）。采用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌（1∶1）的方法建立成年小鼠需氧性陰道炎模型，當AgNPs作為抗菌劑，而左旋肉堿作為氧化劑聯合使用時，可調節(jié)小鼠的發(fā)情周期，有效治療AV相關癥狀［32］。王冬納等［33］發(fā)現大腸桿菌和金黃色葡萄球菌共同感染可促進陰道上皮VK2/E6E7細胞和陰道組織中白細胞介素（interleukin，IL）-6和IL-1β的生成，而硫氫化鈉能顯著抑制這些促炎細胞因子的產生，并可能通過降低細胞內氯離子濃度而抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路的激活，從而抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌感染引起的陰道炎癥反應。

早在1986年，郭仁輿報道豬膽汁提取物及去氧膽酸鈉對人陰道毛滴蟲具有抑制作用。近期報道發(fā)現苦參總堿對AV相關無乳鏈球菌、糞腸球菌，以及VVC相關白假絲酵母菌及其生物膜均有抑制作用［34-35］。銅苯二酮對多種假絲酵母菌、革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）和革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和無乳鏈球菌）均有抑菌活性，且能夠干擾多種生物膜形成，并具有抗滴蟲活性，可與甲硝唑產生協同效應［36-37］。近年來，乳桿菌的抑菌和抑制生物膜活性被陸續(xù)報道，如鼠李糖乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、德氏乳桿菌、植物乳桿菌、乳桿菌衍生物等被證實具有抑制陰道內致病菌生長及生物膜的作用［38-39］。

4結語

陰道中微生物生物膜的形成受微生物種類、陰道局部微環(huán)境、抗菌藥物使用等多種因素的影響。陰道微生態(tài)恢復需要重視預防早期生物膜的形成。盡管目前有很多關于生物膜的基礎研究，但關于多種微生物生物膜的研究目前仍較少，由于動物模型缺乏和臨床試驗制約，很多藥物尚未開展臨床前研究。越來越多的研究報道了益生菌在治療生物膜相關陰道感染的作用，將上述破壞生物膜的藥物和益生菌結合，共同增強對陰道中病原菌生物膜的清除，同時恢復陰道內乳桿菌的功能可能是未來針對生物膜治療的趨勢，也為生物膜相關臨床研究提供了新的治療策略。

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