骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫組化、PCR診斷淋巴瘤骨髓侵犯的價(jià)值

【摘要】 目的：探討骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫組化、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）診斷淋巴瘤骨髓侵犯的價(jià)值。方法：選取贛州市腫瘤醫(yī)院2021年1月—2023年8月收治的81例淋巴瘤患者，均接受骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、骨髓涂片免疫組化、PCR檢測，分析三者單獨(dú)及聯(lián)合檢出骨髓侵犯的價(jià)值。結(jié)果：81例患者中，骨髓活檢檢出21例、骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢出32例、骨髓涂片免疫組化檢出36例，PCR檢出19例。其中，聯(lián)合檢測與骨髓活檢的一致性最好，Kappa值為0.875；以骨髓活檢為參考標(biāo)準(zhǔn)，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、骨髓涂片免疫組化、PCR及聯(lián)合檢測的敏感度分別為80.95%、90.48%、71.43%、95.24%，特異度分別為75.00%、71.67%、93.33%、95.00%，準(zhǔn)確率分別為76.54%、76.54%、87.65%、95.06%，陽性預(yù)測值分別為53.13%，52.78%、78.95%、86.96%，陰性預(yù)測值分別為91.84%、95.56%、90.32%、98.28%。聯(lián)合檢測的敏感度高于PCR單項(xiàng)檢測，特異度、準(zhǔn)確率、陽性預(yù)測值均高于骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、骨髓涂片免疫組化單項(xiàng)檢測（P<0.05）。結(jié)論：淋巴瘤患者骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查聯(lián)合骨髓涂片免疫組化、PCR檢查可明顯提高對骨髓侵犯的診斷效能。

【關(guān)鍵詞】 淋巴瘤 骨髓侵犯 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué) 免疫組化 聚合酶鏈反應(yīng)

Value of Bone Marrow Cell Morphology， Immunohistochemistry and PCR in Diagnosing Lymphoma with Bone Marrow Involvement/LIAO Weilian. //Medical Innovation of China， 2024， 21（24）： -158

[Abstract] Objective： To explore the value of bone marrow cell morphology， immunohistochemistry and polymerase chain reaction （PCR） in the diagnosis of lymphoma with bone marrow involvement. Method： A total of 81 patients with lymphoma in Ganzhou Cancer Hospital were selected from January 2021 to August 2023. All patients underwent bone marrow cell morphology， bone marrow smear immunohistochemistry and PCR detection， and the value of the three alone and combined detection on bone marrow involvement were analyzed. Result： Among 81 patients， 21 cases were detected by bone marrow biopsy， 32 cases were detected by bone marrow cell morphology， 36 cases were detected by bone marrow smear immunohistochemistry and 19 cases were detected by PCR. The consistency between combined detection and bone marrow biopsy was the best， with Kappa value of 0.875. Taking bone marrow biopsy as the reference standard， the sensitivities of bone marrow cell morphology detection， bone marrow smear immunohistochemistry， PCR and combined detection were 80.95%， 90.48%， 71.43% and 95.24%， the specificities were 75.00%， 71.67%， 93.33% and 95.00%， accuracy rates were 76.54%， 76.54%， 87.65% and 95.06%， the positive predictive values were 53.13%， 52.78%， 78.95% and 86.96%， and the negative predictive values were 91.84%， 95.56%， 90.32% and 98.28% respectively. The sensitivity of combined detection was higher than that of PCR single detection， and the specificity， accuracy rate and positive predictive value were higher than those of bone marrow cell morphology and bone marrow smear immunohistochemistry （P<0.05）. Conclusion： Bone marrow cell morphology examination combined with bone marrow smear immunohistochemistry and PCR can significantly improve the diagnostic efficiency on bone marrow involvement in patients with lymphoma.

[Key words] Lymphoma Bone marrow involvement Bone marrow cell morphology Immunohistochemistry Polymerase chain reaction

First-author's address： Department of Pathology， Ganzhou Cancer Hospital， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.24.035

淋巴瘤是起源于淋巴結(jié)、淋巴組織的惡性腫瘤，表現(xiàn)為淋巴結(jié)無痛性進(jìn)行性腫大，至疾病后期淋巴瘤細(xì)胞常通過淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散到肝、肺、骨髓等其他部位，其中骨髓是較常見的受累部位，可發(fā)展為淋巴瘤細(xì)胞白血病，預(yù)后較差[1-3]。因此，需重視淋巴瘤患者骨髓情況評估，以便準(zhǔn)確判斷病理分型及臨床分期，指導(dǎo)臨床醫(yī)師針對性調(diào)整治療方案。目前，臨床對淋巴瘤骨髓侵犯情況的評估方法多種多樣，但尚無統(tǒng)一診斷金標(biāo)準(zhǔn)，通常采用以多種診斷方式聯(lián)合檢測的方式對骨髓侵犯程度進(jìn)行鑒別與診斷[4-5]。骨髓形態(tài)學(xué)檢查、骨髓組織免疫組化及聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）等是常用診斷方法，但上述幾種方法單獨(dú)診斷及聯(lián)合診斷的效能比較研究較少[6-8]。因此本研究旨在探討淋巴瘤骨髓侵犯患者骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征及聯(lián)合免疫組化、PCR的診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取贛州市腫瘤醫(yī)院2021年1月—2023年8月收治的81例淋巴瘤患者，男35例，女46例；年齡31～61歲，平均（43.98±6.29）歲；其中霍奇金淋巴瘤8例，非霍奇金淋巴瘤73例；卡氏功能狀態(tài)評分：>60分56例，≤60分25例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均確診為淋巴瘤[9]；（2）疑似骨髓侵犯，Ann Arbor分期為Ⅳ期；（3）年齡≥18歲；（4）均接受骨髓涂片、骨髓活檢、免疫組化、PCR檢查；（5）初治。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤疾病；（2）存在血液系疾病或凝血功能障礙；（3）存在全身性感染性疾病或免疫系疾病；（4）哺乳期或妊娠期?；颊呔炇鹬橥鈺?。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 于髂前上棘或髂后上棘穿刺，穿刺針垂直進(jìn)入骨面，接觸骨質(zhì)后將穿刺針左右旋轉(zhuǎn)推進(jìn)至針入骨質(zhì)，穿刺針固定在骨內(nèi)時拔出針芯，用10 mL注射器抽取3 mL骨髓液，其中0.2 mL快速涂片10張，5張行骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查，另5張經(jīng)95%乙醇固定后行骨髓涂片免疫組化檢查；另外2.8 mL置入EDTA抗凝管中進(jìn)行PCR檢測。在同一穿刺部位，使用骨髓活檢組織檢查針進(jìn)行骨髓活檢穿刺術(shù)，順時針進(jìn)針至固定，拔出針芯，連上接柱后再插入針芯，仍順時針進(jìn)針，約進(jìn)針1 cm后，順時針旋轉(zhuǎn)3周后再逆時針旋轉(zhuǎn)2～3周至骨髓組織離斷，再順時針退針，取出骨髓組織置入10%的甲醛溶液中固定，進(jìn)行病理檢查。消毒穿刺點(diǎn)后使用無菌紗布覆蓋。

1.2.2 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué) 待涂片干燥后用瑞氏-吉姆薩染色法染色，在高倍油鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：5%<淋巴瘤細(xì)胞<20%[10]。

1.2.3 骨髓涂片免疫組化 應(yīng)用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色法，將已經(jīng)95%乙醇固定骨髓涂片放入蒸餾水中浸泡5 min，再用雙氧水浸泡10 min，后再浸于蒸餾水3 min，取出、擦干，用蠟筆圈出組織，滴加PBS沖洗至細(xì)胞被完全覆蓋，擦干周圍PBS后滴加一抗，1 h后取出玻片用PBS沖洗3遍，滴加二抗至完全覆蓋組織，30 min后用PBS沖洗至洗脫未能與一抗結(jié)合的二抗，滴加DAB（依據(jù)標(biāo)本量配制），室溫下放置10 min，用自來水沖洗1 min，使用蘇木精染色2 min，流水沖洗，分化，返藍(lán)，再流水沖洗4 min，80%乙醇浸泡5 s后用無水乙醇浸泡5 s，晾干，加蓋玻片。B細(xì)胞來源：CD10、CD19、CD20、CD79a、PAX-5，T、NK細(xì)胞來源：CD3、CD5、CD7。

1.2.4 PCR 將標(biāo)本以2 000 r/min的速度離心10 min去除上清液，混勻后加入紅細(xì)胞低滲液15 mL，室溫下放置30 min，再次以相同的速率離心2 min后去除紅細(xì)胞低滲液，再依次加入裂解液及蛋白沉淀液，最后提取DNA，以β-Actin檢測確認(rèn)有效，采用半巢式PCR方法檢測基因克隆性重排，引物序列根據(jù)PCR引物設(shè)計(jì)原則利用PP 5.0和Oligo 6.0系統(tǒng)自行設(shè)計(jì)。任一反應(yīng)陽性即為骨髓標(biāo)本DNA存在基因克隆性重排，判定為淋巴瘤骨髓侵犯陽性。

1.2.5 骨髓活檢 骨髓活檢組織在10%的甲醛溶液中固定4 h后水洗，常規(guī)脫鈣、脫水、浸蠟、包埋，切片（厚度3～4 μm），烤片，脫蠟，行Harris氏蘇木素-吉姆薩-伊紅染色，脫水透明后用樹膠封片。鏡檢觀察，按文獻(xiàn)[11]《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》，骨髓正常結(jié)構(gòu)被破壞，見異形淋巴細(xì)胞（胞體小、胞質(zhì)少、核圓）或伴有少量幼稚淋巴細(xì)胞則為骨髓侵犯陽性。

以兩項(xiàng)及以上檢測陽性為聯(lián)合檢測的陽性標(biāo)準(zhǔn)。本研究以骨髓活檢結(jié)果為診斷參考標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測、骨髓涂片免疫組化等各檢測結(jié)果與骨髓活檢結(jié)果的一致性分析采用配對四表格字2檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同診斷方法結(jié)果比較

81例患者中，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測的陽性率為39.51%（32/81），骨髓涂片免疫組化檢測陽性率為44.44%（36/81），PCR檢測陽性率為23.46%（19/81），骨髓活檢的陽性率為25.93%（21/81）。骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測與骨髓活檢比較，Kappa值為0.478；骨髓涂片免疫組化檢測與骨髓活檢比較，Kappa值為0.504；PCR檢測與骨髓活檢比較，Kappa值為0.668；上述三種診斷方法聯(lián)合檢測與骨髓活檢的一致性最好，Kappa值為0.875。見表1。

2.2 不同診斷方法的診斷效能比較

以骨髓活檢為參考標(biāo)準(zhǔn)，聯(lián)合檢測的敏感度高于PCR單項(xiàng)檢測（字2=4.286，P=0.038），特異度、準(zhǔn)確率、陽性預(yù)測值均高于骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、骨髓涂片免疫組化單項(xiàng)檢測（字2特異度=9.412、11.760，P特異度=0.002、0.001；字2準(zhǔn)確率=11.401、11.401，P準(zhǔn)確率=0.001、0.001；字2陽性預(yù)測值=6.957、7.316，P陽性預(yù)測值=0.010、0.007），見表2。

3 討論

淋巴瘤是臨床常見惡性腫瘤疾病，近年來發(fā)病率呈逐年增高趨勢，病因尚不明晰，可能與病毒感染因素、免疫功能低下、遺傳因素、環(huán)境因素等相關(guān)[12-13]。該病不同的病理類型、不同的臨床分期有不同的治療方案，在疾病早期，依據(jù)其病理分型及時進(jìn)行針對性治療，預(yù)后較好。但若淋巴瘤累及骨髓則可能進(jìn)展為淋巴瘤細(xì)胞白血病造成死亡。因此，及時對淋巴瘤患者骨髓累及情況進(jìn)行評估具有重要臨床意義。

目前，淋巴瘤骨髓侵犯的診斷方法較多，有研究認(rèn)為計(jì)算機(jī)斷層顯像可用于淋巴瘤骨髓侵犯情況的診斷[14]，也有部分研究認(rèn)為血小板計(jì)數(shù)、乳酸脫氫酶等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)可指導(dǎo)淋巴瘤骨髓侵犯的臨床診斷[15]，但研究更多的還是骨髓涂片、骨髓活檢等檢查[16]。本研究81例患者中，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示骨髓侵犯陽性率為39.51%，可見淋巴瘤骨髓侵犯患者存在骨髓細(xì)胞形態(tài)改變或淋巴細(xì)胞數(shù)異常增多，骨髓液涂片能從骨髓細(xì)胞形態(tài)改變評估骨髓累及情況，且陽性率較高，優(yōu)點(diǎn)在于涂片均勻，胞體舒展，使得異型細(xì)胞易于識別，且可量化，但細(xì)胞成分較單一，且邊界不清，可能造成假陽性、假陰性。對于部分淋巴瘤細(xì)胞還需免疫組化進(jìn)行鑒別，本研究對同一病例標(biāo)本進(jìn)行骨髓涂片免疫組化檢查，免疫組化聯(lián)合抗原抗體反應(yīng)、呈色反應(yīng)，或能提高陽性率，結(jié)果顯示檢測陽性率為44.44%，但在標(biāo)本的制備過程中重復(fù)的染色、沖洗等步驟可能破壞細(xì)胞，影響結(jié)果準(zhǔn)確率，因此筆者認(rèn)為上述兩項(xiàng)檢測結(jié)合或能提高診斷效能。另外，在標(biāo)本制備過程中，骨髓涂片需快速以免骨髓液凝固，同時避免反復(fù)涂片，以防造成細(xì)胞破壞。

淋巴瘤屬于一種克隆性疾病，PCR技術(shù)檢測基因克隆性重排對檢測骨髓累及情況也有重要價(jià)值[17-18]。本研究中PCR檢查結(jié)果顯示骨髓侵犯陽性率為23.46%，較骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、骨髓涂片免疫組化的陽性率低，但其與骨髓活檢的一致性更好，這可能因?yàn)楣撬栊螒B(tài)學(xué)及骨髓涂片免疫組化均會有不同比例的假陽性，而PCR檢測提取骨髓液相對較多，用快速提取法提取DNA，質(zhì)量好，濃度高，因此準(zhǔn)確率較高[19]。但在DNA提取過程中仍會有DNA流失，造成假陰性。結(jié)果中骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、骨髓涂片免疫組化、PCR聯(lián)合診斷與骨髓活檢的一致性最高，且聯(lián)合檢測的敏感度高于PCR單項(xiàng)檢測，特異度、準(zhǔn)確率、陽性預(yù)測值均高于骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、骨髓涂片免疫組化單項(xiàng)檢測，證實(shí)聯(lián)合檢測可提高診斷效能，減少假陽性率、假陰性率。上述可見骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、骨髓涂片免疫組化、PCR單項(xiàng)檢測均各有優(yōu)缺點(diǎn)導(dǎo)致誤診、漏診，而三項(xiàng)聯(lián)合檢測則可一定程度上互補(bǔ)，進(jìn)而可減少誤診、漏診率，提高診斷效能。

綜上所述，淋巴瘤骨髓侵犯患者存在骨髓細(xì)胞形態(tài)改變或淋巴細(xì)胞數(shù)異常增多；淋巴瘤患者骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查聯(lián)合骨髓涂片免疫組化、PCR檢查可明顯提高對骨髓侵犯的診斷效能。本研究的局限在于樣本量較少，可能存在選擇偏倚，后續(xù)會繼續(xù)收集樣本數(shù)據(jù)以證實(shí)研究結(jié)論。

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（收稿日期：2024-01-22） （本文編輯：白雅茹）

①贛州市腫瘤醫(yī)院病理科 江西 贛州 341000

通信作者：廖偉蓮