高效液相色譜法在葡萄酒著色劑檢測(cè)中的應(yīng)用問(wèn)題及其對(duì)策

摘 要：本研究探討了高效液相色譜法在檢測(cè)葡萄酒中非法添加著色劑方面的應(yīng)用。雖然著色劑可顯著改善葡萄酒的色澤品質(zhì)，但相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)明確要求不得在葡萄酒中使用合成著色劑。高效液相色譜法憑借其優(yōu)異的分離與分析復(fù)雜樣品的能力，成為檢測(cè)葡萄酒著色劑的重要工具。然而，葡萄酒復(fù)雜的基質(zhì)、多樣的著色劑結(jié)構(gòu)及儀器檢出限不滿(mǎn)足要求仍是該技術(shù)應(yīng)用的難點(diǎn)。因此，本文提出優(yōu)化色譜柱與流動(dòng)相、引入多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)、在線(xiàn)富集與衍生化等方法，以提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性，保障葡萄酒質(zhì)量安全。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；葡萄酒；著色劑；食品安全

Abstract： This study explores the application of high-performance liquid chromatography in the detection of illegally added colorants in wine. While colorants can significantly improve the color quality of wine， the standards explicitly state that synthetic colorants must not be used in wine. High performance liquid chromatography is an important tool for the detection of wine colorants due to its excellent ability to separate and analyze complex samples. However， the complex matrix， diverse colorant structure and unsatisfactory detection limit of the instrument are still difficult to apply this technology. Therefore， in this paper， we propose methods such as optimizing the column and mobile phase， introducing multi-stage mass spectrometry， online enrichment and derivatization， etc.， to improve the detection efficiency and accuracy， and ensure the quality and safety of wine.

Keywords： high performance liquid chromatography; wine; colorants; food safety

葡萄酒是廣受歡迎的酒精飲品，《葡萄酒》（GB/T 15037—2006）要求“所有產(chǎn)品中均不得添加合成著色劑、甜味劑、香精、增稠劑”，但劣質(zhì)產(chǎn)品為了提高葡萄酒的感官品質(zhì)可能非法添加著色劑。著色劑有增色、掩蓋缺陷等作用，但過(guò)量添加會(huì)危害人體健康[1]?！吨腥A人民共和國(guó)食品安全法》對(duì)食品違規(guī)使用添加劑行為有明確禁止性規(guī)定。高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是分離分析復(fù)雜樣品的有力工具。本文將探討HPLC在葡萄酒著色劑檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀，分析當(dāng)前存在的技術(shù)難點(diǎn)，并提出提高HPLC檢測(cè)能力的建議。

1 著色劑在葡萄酒中的作用

葡萄酒生產(chǎn)中，著色劑的應(yīng)用旨在調(diào)整和改善葡萄酒的色澤。天然葡萄酒的色澤主要來(lái)源于葡萄果皮中的花色苷類(lèi)物質(zhì)，如葡萄皮黃酮醇和花青素。然而，由于葡萄品種、種植條件、釀造工藝等因素的影響，葡萄酒的色澤往往難以達(dá)到理想效果。為了迎合消費(fèi)者對(duì)酒液色澤的審美期待，部分不法生產(chǎn)者會(huì)使用食用著色劑對(duì)葡萄酒的色澤進(jìn)行調(diào)整。常見(jiàn)的葡萄酒著色劑包括胭脂紅、莧菜紅、姜黃素等。這些著色劑能夠彌補(bǔ)葡萄酒自身色澤的不足，賦予其鮮艷奪目的色彩[2]。例如，在加工低色度的白葡萄酒時(shí)，添加適量的姜黃素可以使酒液呈現(xiàn)出柔和的淡黃色，增強(qiáng)其視覺(jué)吸引力。對(duì)于一些陳年葡萄酒，由于在貯藏過(guò)程中花色苷類(lèi)物質(zhì)發(fā)生了緩慢降解，導(dǎo)致酒液色澤逐漸褪去，這時(shí)添加少量胭脂紅即可恢復(fù)其色澤特征。此外，著色劑還能掩蓋葡萄酒在生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的某些瑕疵，如氧化褐變、雜質(zhì)沉淀等引起的色澤異常，維持產(chǎn)品的感官品質(zhì)穩(wěn)定。

2 高效液相色譜法概述

高效液相色譜法是一種應(yīng)用廣泛的現(xiàn)代分離分析技術(shù)，其基本原理是利用待測(cè)物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)差異實(shí)現(xiàn)分離。在色譜柱中，填充有粒徑均勻、比表面積大的微粒固定相，通過(guò)高壓泵將流動(dòng)相泵入色譜柱，形成穩(wěn)定的液流。當(dāng)被測(cè)樣品隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱后，樣品組分在兩相之間發(fā)生吸附-解吸平衡，由于不同組分的分配系數(shù)不同，其在色譜柱中的遷移速率也不同，從而實(shí)現(xiàn)分離。分離后的組分隨流動(dòng)相依次流出色譜柱，進(jìn)入檢測(cè)器產(chǎn)生信號(hào)，繪制成色譜圖。

高效液相色譜法的分離效能主要取決于色譜柱的類(lèi)型。例如，采用以硅膠為基質(zhì)、鍵合十八烷基的反相色譜柱，可有效分離葡萄酒中的花色苷類(lèi)物質(zhì)；而使用以葡聚糖凝膠為填料的凝膠滲透色譜柱，則能根據(jù)分子大小實(shí)現(xiàn)葡萄酒香氣成分的分離[3]。除了色譜柱之外，流動(dòng)相的優(yōu)化也非常重要。根據(jù)待測(cè)物的極性選擇合適的流動(dòng)相體系，調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值、離子強(qiáng)度等，可顯著改善色譜峰形，提高分離度和靈敏度。常見(jiàn)的流動(dòng)相體系包括甲醇-水、乙腈-水等。此外，高效液相色譜法的檢測(cè)器種類(lèi)多樣，可根據(jù)分析需求選擇合適的檢測(cè)器，如紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器等，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的靈敏檢測(cè)。

3 葡萄酒著色劑檢測(cè)中高效液相色譜法應(yīng)用難點(diǎn)

3.1 樣品基質(zhì)復(fù)雜導(dǎo)致分離效果不佳

葡萄酒中含有大量的酚類(lèi)、糖類(lèi)、有機(jī)酸等天然組分，這些復(fù)雜的基質(zhì)成分會(huì)對(duì)著色劑的色譜分離產(chǎn)生顯著的干擾效應(yīng)。①某些酚類(lèi)物質(zhì)如原花青素、白藜蘆醇等與著色劑的極性相近，在色譜柱上易發(fā)生共洗脫，導(dǎo)致目標(biāo)色譜峰出現(xiàn)拖尾、展寬等形變，分離效果不理想。②葡萄酒中游離的單寧酸、黃烷型單寧等還可通過(guò)疏水作用、氫鍵等與色譜填料發(fā)生不可逆吸附，造成固定相活性位點(diǎn)的堵塞，使柱效下降。③葡萄酒中的糖類(lèi)、金屬離子等雜質(zhì)也會(huì)影響著色劑與固定相的相互作用，進(jìn)而改變其保留行為。以葡萄酒中的鐵離子為例，其可與胭脂紅等著色劑形成配合物而減弱色譜保留；而果糖、葡萄糖等還原糖則會(huì)引起填料表面的還原反應(yīng)，削弱疏水作用位點(diǎn)，影響柱穩(wěn)定性[4]。

3.2 著色劑結(jié)構(gòu)相似引起定性定量困難

葡萄酒中常見(jiàn)的合成著色劑大多屬于偶氮類(lèi)和三苯甲烷類(lèi)化合物，這些物質(zhì)普遍存在結(jié)構(gòu)相似性高的問(wèn)題，給基于高效液相色譜法的定性定量分析帶來(lái)困擾。①以偶氮類(lèi)著色劑為例，日落黃、胭脂紅等均含有偶氮基團(tuán)和萘環(huán)結(jié)構(gòu)，二者的分子式僅相差一個(gè)亞硝基，極性十分接近[1]。當(dāng)采用常規(guī)的反相色譜柱如C18柱進(jìn)行分離時(shí)，這類(lèi)結(jié)構(gòu)相似的著色劑在色譜圖上往往表現(xiàn)出峰形重疊、分離度低的特征，難以獲得理想的定性效果。②三苯甲烷類(lèi)著色劑如檸檬綠、麝香紅等同樣面臨這一問(wèn)題。它們的分子結(jié)構(gòu)中均含有3個(gè)苯環(huán)和多個(gè)磺酸基團(tuán)，保留行為十分類(lèi)似，在常規(guī)條件下極易發(fā)生共洗脫。此外，食用藍(lán)1、食用藍(lán)2等結(jié)構(gòu)相似的三苯甲烷類(lèi)著色劑的最大吸收波長(zhǎng)高度重疊，采用紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器定性時(shí)易產(chǎn)生誤識(shí)別[3]。

3.3 檢出限不滿(mǎn)足要求

目前，高效液相色譜法在葡萄酒痕量著色劑檢測(cè)中仍存在檢出限不夠低的問(wèn)題，難以滿(mǎn)足日趨嚴(yán)苛的食品安全監(jiān)管要求。這主要源于著色劑在葡萄酒基質(zhì)中含量較低，且易被基質(zhì)效應(yīng)所掩蓋。以檀木素為例，其在葡萄酒中的添加量通常在0.1 mg·L-1以下，常規(guī)的高效液相色譜-紫外檢測(cè)方法的定量下限僅為0.5 mg·L-1左右，靈敏度不足。而當(dāng)采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)，葡萄酒中共存的花色苷類(lèi)物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)，導(dǎo)致檀木素的離子化效率下降，難以進(jìn)一步降低定量檢出限。類(lèi)似地，三聚氰胺也是葡萄酒中潛在的有害著色劑，其殘留量一般在μg·L-1水平。但是，三聚氰胺在常用的C18色譜柱上的保留時(shí)間較短，易與極性基質(zhì)組分發(fā)生共洗脫，背景干擾嚴(yán)重，無(wú)法實(shí)現(xiàn)低檢出限分析[5]。此外，葡萄酒樣品在進(jìn)樣分析前通常需經(jīng)凈化、濃縮等預(yù)處理步驟，但這些操作往往伴隨著目標(biāo)物損失，也限制了檢測(cè)靈敏度的提升。

4 加強(qiáng)高效液相色譜法檢測(cè)能力的建議

4.1 優(yōu)化色譜柱與流動(dòng)相，提高分離度

針對(duì)葡萄酒樣品基質(zhì)復(fù)雜導(dǎo)致的高效液相色譜分離效果不佳問(wèn)題，可從優(yōu)化色譜柱和流動(dòng)相兩方面著手，提高目標(biāo)組分的分離度。

（1）色譜柱的選擇。要綜合考慮葡萄酒樣品的極性特征和目標(biāo)著色劑的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。對(duì)于含有多酚類(lèi)等強(qiáng)極性干擾物質(zhì)的葡萄酒，采用嵌入極性基團(tuán)的反相色譜柱如PFP柱、F5柱等，可有效增強(qiáng)色譜柱對(duì)極性組分的選擇性保留，改善色譜峰形，提高分離效果。同時(shí)，減小柱內(nèi)徑、縮短柱長(zhǎng)、降低填料粒徑等措施也有助于提升柱效，獲得更高的分離度。

（2）流動(dòng)相優(yōu)化。①可采用酸化流動(dòng)相體系，抑制酚類(lèi)物質(zhì)的電離，減弱其與填料表面殘留硅羥基的相互作用，從而避免峰拖尾。例如，在流動(dòng)相中添加0.1%三氟乙酸，可顯著改善原花青素、白藜蘆醇等酚類(lèi)物質(zhì)的色譜行為[5]。②針對(duì)葡萄酒中游離單寧酸、黃烷型單寧等易引起填料不可逆吸附的問(wèn)題，可在流動(dòng)相中加入四氫呋喃等強(qiáng)極性溶劑，削弱其與固定相的疏水作用力，延緩單寧酸的保留，避免柱堵塞。③需要注意的是，流動(dòng)相的pH值也是影響分離效果的關(guān)鍵因素。適當(dāng)調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值，可改變著色劑分子的電離狀態(tài)和極性，進(jìn)而調(diào)控其色譜保留行為。如在分析酸性偶氮類(lèi)著色劑時(shí)，采用堿性流動(dòng)相可提高分離選擇性；而對(duì)堿性三苯甲烷類(lèi)著色劑，酸性流動(dòng)相則更為適宜。④優(yōu)化流動(dòng)相梯度洗脫條件也是提高復(fù)雜樣品分離效果的有效策略。針對(duì)性地設(shè)計(jì)梯度洗脫程序，可在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物與干擾物的充分分離，縮短分析時(shí)間，提高檢測(cè)通量。

4.2 采用多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)，提升定性定量準(zhǔn)確性

為了有效解決葡萄酒著色劑結(jié)構(gòu)相似所引起的定性定量困難，可采用多級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，全面提升分析的準(zhǔn)確性和可靠性。①將高效液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，可在保留時(shí)間相近的色譜峰中準(zhǔn)確鑒別目標(biāo)著色劑。例如，對(duì)于結(jié)構(gòu)相似的檸檬綠和麝香紅，采用高分辨質(zhì)譜測(cè)定其精確分子量，并結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜分析母離子的裂解規(guī)律，可實(shí)現(xiàn)定性鑒別[3]。②多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)還能夠有效克服基質(zhì)效應(yīng)干擾，提高復(fù)雜樣品中痕量著色劑的檢測(cè)靈敏度。通過(guò)優(yōu)化質(zhì)譜電離參數(shù)，控制離子源溫度、霧化氣流速等，可顯著提升著色劑的離子化效率。同時(shí)，選擇合適的特征離子對(duì)作為定量依據(jù)，并采用同位素內(nèi)標(biāo)法校正基質(zhì)效應(yīng)，可最大限度地消除葡萄酒樣品中共存物質(zhì)的影響，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確可靠的定量分析。③質(zhì)譜條件的優(yōu)化還應(yīng)針對(duì)不同類(lèi)型著色劑的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來(lái)開(kāi)展。對(duì)于酸性偶氮類(lèi)著色劑，負(fù)離子模式通常能獲得較高的靈敏度；而堿性的三苯甲烷類(lèi)著色劑則在正離子模式下更易電離。此外，采集二級(jí)質(zhì)譜信息時(shí)，合理設(shè)置碰撞能量也非常重要，既要保證獲得豐富的結(jié)構(gòu)解析信息，又要避免過(guò)度碎裂導(dǎo)致靈敏度損失。④色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用還需要與相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理方法相結(jié)合。針對(duì)葡萄酒著色劑種類(lèi)繁多、結(jié)構(gòu)相似的特點(diǎn)，建立涵蓋多種著色劑的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，并采用專(zhuān)屬算法如同系物定量法等，可進(jìn)一步提高分析效率和可靠性，為葡萄酒質(zhì)量安全控制提供有力保障。

4.3 引入在線(xiàn)富集與衍生化方法，降低檢出限

為有效提高高效液相色譜法檢測(cè)痕量著色劑的靈敏度，突破現(xiàn)有檢出限的瓶頸，可引入在線(xiàn)富集和衍生化等樣品前處理新技術(shù)。

采用在線(xiàn)固相萃取富集技術(shù)，利用柱前填裝吸附材料的微柱，在進(jìn)樣階段實(shí)現(xiàn)目標(biāo)著色劑的選擇性捕集和濃縮，可顯著提高進(jìn)樣量，降低基質(zhì)背景干擾，從而達(dá)到痕量檢出的目的。例如，在檀木素的分析中，采用分子印跡聚合物（Molecular Imprinted Polymer，MIP）微柱在線(xiàn)富集，可將其在葡萄酒基質(zhì)中的檢出限從μg·L-1水平降低至ng·L-1水平[1]。

在線(xiàn)衍生化技術(shù)則通過(guò)提高目標(biāo)物的極性或引入特殊基團(tuán)，改善其色譜行為和檢測(cè)靈敏度。對(duì)于缺乏發(fā)色團(tuán)的著色劑如三聚氰胺，采用在線(xiàn)鄰苯二甲醛（Ortho-Phthalaldehyde，OPA）衍生化，生成具有強(qiáng)紫外吸收的異吲哚衍生物，可將檢測(cè)靈敏度提高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。衍生化條件的優(yōu)化對(duì)于實(shí)現(xiàn)靈敏檢測(cè)也至關(guān)重要，反應(yīng)溫度、進(jìn)樣體積、衍生劑濃度等參數(shù)應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)考察，以保證在衍生反應(yīng)完全的同時(shí)，最大限度地減少樣品的稀釋效應(yīng)。

在線(xiàn)固相萃取與衍生化技術(shù)還可以實(shí)現(xiàn)耦合，進(jìn)一步簡(jiǎn)化樣品前處理過(guò)程，縮短分析時(shí)間。富集柱上富集的目標(biāo)物直接用含衍生劑的洗脫液洗脫，經(jīng)過(guò)柱后衍生裝置反應(yīng)后被分離檢測(cè)，整個(gè)過(guò)程實(shí)現(xiàn)在線(xiàn)自動(dòng)化，避免了人工操作帶來(lái)的誤差和損失。這種聯(lián)用模式已在植酸、胭脂紅鋁色淀等弱紫外吸收著色劑的痕量分析中得到應(yīng)用，取得了良好效果。需要注意的是，在線(xiàn)富集和衍生化方法需依據(jù)不同著色劑的理化性質(zhì)而建立，如選擇合適的吸附填料、優(yōu)化洗脫液組成、篩選高效衍生試劑等，以最大限度地發(fā)揮各項(xiàng)技術(shù)的增敏潛力，滿(mǎn)足葡萄酒著色劑日益嚴(yán)苛的痕量檢測(cè)要求。

5 結(jié)語(yǔ)

本文系統(tǒng)分析了高效液相色譜法在葡萄酒著色劑檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)。通過(guò)優(yōu)化色譜柱與流動(dòng)相、采用多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)、引入在線(xiàn)富集與衍生化方法，能夠有效提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，解決當(dāng)前存在的技術(shù)難題。未來(lái)研究應(yīng)繼續(xù)深入探索新型色譜材料及先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)，以提高痕量分析的能力，確保葡萄酒的質(zhì)量安全與消費(fèi)者權(quán)益。此外，開(kāi)發(fā)快速、經(jīng)濟(jì)的在線(xiàn)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，將為葡萄酒行業(yè)的質(zhì)量控制提供有力支持。

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作者簡(jiǎn)介：崔成祥（1970—），男，山東平度人，本科，主任技師。研究方向：衛(wèi)生檢驗(yàn)。

通信作者：張愛(ài)萍（1970—），女，山東平度人，本科，主任技師。研究方向：衛(wèi)生檢驗(yàn)。E-mail： 1939396612@qq.com。