基于鐵基γ-環(huán)糊精納米粒子的類過氧化物酶活性比色檢測肌氨酸

摘要 采用溶劑熱法合成了具有類過氧化物酶活性的鐵基γ-環(huán)糊精納米粒子（Fe-γ-CD），并基于此構(gòu)建了簡單、靈敏測定肌氨酸（SAR）的比色傳感方法。Fe-γ-CD 可催化過氧化氫（H2O2）氧化無色的3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），生成藍色的氧化態(tài)TMB（oxTMB），在652 nm 處有強吸收峰?？疾炝朔磻?yīng)條件對Fe-γ-CD催化的TMB-H2O2 顯色反應(yīng)的影響，并進行了催化機理和穩(wěn)態(tài)動力學分析。實驗結(jié)果表明， Fe-γ-CD 催化H2O2 產(chǎn)生羥基自由基、單線態(tài)氧和超氧自由基，這些活性氧物種進一步氧化TMB，此催化反應(yīng)歷程遵循典型的Michaelis-Menten 動力學模型。SAR 在肌氨酸氧化酶（SOx）催化下可水解產(chǎn)生H2O2，具有類過氧化物酶活性的Fe-γ-CD 催化H2O2 氧化TMB，使得溶液顏色變藍，并且在652 nm 處的吸光度增加，吸光度升高程度與SAR 的濃度有關(guān)，由此可對SAR 濃度進行定量檢測。本方法的線性檢測范圍為1.0～70.0 μmol/L，檢出限為0.46 μmol/L（S/N=3），并具有良好的特異性。將本方法用于血清中SAR 含量的測定，結(jié)果令人滿意。

關(guān)鍵詞 鐵基γ-環(huán)糊精納米粒子；肌氨酸；過氧化氫；比色

肌氨酸（Sarcosine， SAR）是膽堿代謝為甘氨酸過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，人體內(nèi)SAR 濃度異常會誘發(fā)腎功能衰竭、肌氨酸血癥和前列腺癌等多種疾病。目前， SAR 已被證實可作為早期前列腺癌的臨床標志物，相比于前列腺特異性抗原測試， SAR 的差異表達能夠更準確地區(qū)分前列腺癌的不同發(fā)病階段[1-3]。因此，建立簡單、高效和靈敏的SAR 檢測方法對于相關(guān)疾病診斷和人體健康監(jiān)測具有重要意義。

目前，研究者已將色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[4-6]、微分遷移率分析-質(zhì)譜聯(lián)用[7]和毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用[8]等技術(shù)用于SAR 的定量檢測。這些方法的靈敏度和準確性較高，但所用儀器昂貴，樣品處理過程復雜，并且需要專業(yè)的操作人員。肌氨酸氧化酶（SOx）可以催化O2 氧化SAR，產(chǎn)生甘氨酸、甲醛和過氧化氫（H2O2）。基于對O2 消耗量或H2O2 生成量的測定，研究者開發(fā)了更簡便、快捷的SAR 間接檢測方法，如電化學法[9-11]、表面增強拉曼散射法[12]、熒光法[13-15]和比色法[16-19]等。其中，比色法由于操作簡單、檢測成本低和結(jié)果可視化等優(yōu)勢，在SAR 檢測過程中廣泛應(yīng)用。目前報道的比色法主要基于SOx 與辣根過氧化物酶（HRP）或其模擬酶的級聯(lián)反應(yīng)進行SAR 檢測，其原理如下：SOx 催化SAR 氧化產(chǎn)生H2O2， H2O2 進一步在過氧化物酶的催化下氧化顯色底物，輸出比色信號。但是，天然的HRP 難以循環(huán)利用且易失活，研究者利用聚合物將HRP 與SOx 共同固定在試紙上，構(gòu)建了較穩(wěn)定和靈敏的SAR 檢測方法，檢出限（LOD）低至0.6 μmol/L[18]。利用理化性質(zhì)更穩(wěn)定且可大量制備、活性易調(diào)控、種類多樣、成本低的納米酶，可構(gòu)建更簡便且穩(wěn)定的SAR 比色檢測體系。目前，大多數(shù)納米酶的催化活性低于天然HRP，導致SAR 檢測靈敏度不高。為了滿足實際樣品中低濃度SAR 檢測的需求，多數(shù)基于納米酶的SAR 比色檢測法仍需對酶進行固定化以產(chǎn)生限域效應(yīng)[19]，或者以高消光系數(shù)的貴金屬納米棒為顯色底物[17]來提高靈敏度，但是同時也增加了操作難度和檢測成本。

鐵基納米酶是最早被發(fā)現(xiàn)具有類過氧化物酶活性的納米酶[20]，因具有低成本、高效且催化性能易調(diào)控等優(yōu)點，在生物傳感領(lǐng)域具有顯著的應(yīng)用優(yōu)勢[21]。目前，已經(jīng)報道的鐵基類過氧化物納米酶包括金屬氧/硫化物、金屬-有機框架（MOF）和單原子納米酶等[21-23]。Xu 等[24]以三磷酸腺苷活化的Fe3O4@MIL-100（Fe）為類過氧化物酶，通過對H2O2 的檢測而實現(xiàn)膽固醇的間接檢測；Xu 等[25]將葡萄糖氧化酶固定在具有類氧化酶活性的Fe-MOF 上，實現(xiàn)了葡萄糖的檢測。盡管如此，采用簡便方法獲得催化活性高、穩(wěn)定且分散性良好的鐵基納米酶仍具有挑戰(zhàn)性。環(huán)糊精（CD）含有豐富的官能團且分子內(nèi)部存在空腔，可以結(jié)合或包埋多種無機納米粒子，賦予材料較高的穩(wěn)定性和水溶性[26]。Salvatore等[27]通過光照β-CD和Pt 鹽獲得了小尺寸、高水溶性的β-CD 保護的Pt 納米粒子；Setareh 等[28]以α-、β-和γ-CD 為保護劑、NaBH4 為還原劑，合成了α-、β-和γ-CD 保護的銀納米粒子，其中， γ-CD 保護的銀納米粒子具有更優(yōu)異的穩(wěn)定性。然而， CD 保護的鐵基納米酶及其生物傳感應(yīng)用鮮有報道。

本研究以六水合氯化鐵（FeCl3·6H2O）和γ-CD 為前驅(qū)體，通過簡單的溶劑熱法一步合成了具有優(yōu)異類過氧化物酶活性的鐵基γ-環(huán)糊精納米粒子（Fe-γ-CD）。Fe-γ-CD 可催化H2O2 產(chǎn)生羥基自由基（·OH）、單線態(tài)氧（1O2）和超氧自由基（O2·–），這些強氧化性的活性氧物種（ROS）可將無色3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）氧化為藍色產(chǎn)物。由于H2O2 可通過SOx 催化SAR 水解產(chǎn)生， Fe-γ-CD 催化的H2O2-TMB 顯色反應(yīng)可用于SAR 的比色檢測。本方法檢測靈敏度高且特異性好，可用于血清中SAR 濃度的測定。