基于β-二酮類銪(Ⅲ)配合物的單線態(tài)氧比率型熒光探針的合成及細(xì)胞成像應(yīng)用

關(guān)鍵詞銪（Ⅲ）配合物；比率熒光探針；單線態(tài)氧；熒光成像

單線態(tài)氧（1O2）是分子氧的最低電子激發(fā)態(tài)，通常由光敏化過程產(chǎn)生，作為生物系統(tǒng)中一種重要的活性氧，在生物體的生理和病理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。1O2 的氧化活性較高，易與生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物大分子反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞壞死，甚至引發(fā)癌癥和卟啉癥等一系列疾病[1-4]。此外，1O2 是生物體免疫系統(tǒng)中的主要?dú)⒕鷦?，可?yīng)用于癌癥的光動(dòng)力學(xué)療法[5-6]。因此，開發(fā)一種靈敏、準(zhǔn)確和特異性的活細(xì)胞內(nèi)1O2 的檢測(cè)方法尤為重要。

目前， 1O2 的檢測(cè)方法主要包括電子自旋共振法[7]、化學(xué)發(fā)光法[8]、分光光度法[9]和熒光探針法[10-12]等。其中，熒光探針法具有選擇性高、靈敏度高以及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適用于活細(xì)胞或生物體的原位、實(shí)時(shí)及可視化熒光成像檢測(cè)。近年來，已開發(fā)出多種以蒽基衍生物為識(shí)別單元、熒光素和BODIPY 等傳統(tǒng)熒光染料[13-18]或稀土配合物[19-21]為熒光母體的1O2 熒光探針。這些探針對(duì)1O2 表現(xiàn)出良好的熒光響應(yīng)，已被成功用于生物體中1O2 的熒光成像檢測(cè)，但在應(yīng)用過程中還存在一些問題，如探針以單個(gè)發(fā)射峰的強(qiáng)度變化作為定量依據(jù)時(shí)，易受到熒光團(tuán)的光漂白、生物樣品的背景熒光、儀器的不穩(wěn)定以及局部探針濃度不均等因素的干擾，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

比率型熒光探針具有兩個(gè)或多個(gè)發(fā)射峰，通過計(jì)算不同發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度比值可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的檢測(cè)，具有自校準(zhǔn)效應(yīng)，有效地提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度和可靠性[22-23]，因而備受關(guān)注。比率型熒光探針已被廣泛用于識(shí)別次氯酸[24-26]、過氧亞硝酸鹽[27-28]和一氧化氮[29-30]等生理活性物種，然而用于1O2 檢測(cè)的比率型熒光探針的研究報(bào)道較少[31-32]，并且都是以有機(jī)熒光物質(zhì)（如硫代香豆素和異苯并呋喃等）作為熒光團(tuán)，目前尚無基于銪（Ⅲ）配合物的1O2 比率型熒光探針的報(bào)道。本研究利用β-二酮類銪（Ⅲ）配合物的強(qiáng)熒光特性及三元結(jié)構(gòu)組成方式，將1O2 的識(shí)別基團(tuán)二甲基蒽環(huán)及作為熒光參照物的5-羧基四甲基羅丹明（CTMR）引入到β-二酮類銪（Ⅲ）配合物中，合成了1O2 的比率型熒光探針[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]。此探針具有選擇性好、靈敏和可靠等優(yōu)點(diǎn)，用于活細(xì)胞內(nèi)1O2 的熒光成像檢測(cè)，效果良好。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Vanio-EL型元素分析儀（德國Elementar公司）；HP1100LC/MSD型質(zhì)譜儀（美國Agilen科技有限公司）；Bruker Avance Ⅱ 400 型核磁共振儀（瑞士Bruker 儀器公司）；F-7000 型熒光分光光度計(jì)（日本Hitachi公司）；L-35 型紫外-可見分光光度計(jì)（美國Perkin Elmer 儀器公司）；真彩熒光顯微鏡[33]。

9-蒽醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；CTMR（上海邁瑞爾化學(xué)試劑有限公司）；5-氨基酮戊酸（ALA，上海張江生物醫(yī)藥有限公司）；1，10-菲咯啉、S-亞硝基-N-乙酰青霉胺（≥ 97%）、6%次氯酸鈉溶液和硫酸亞鐵銨（阿拉丁試劑公司）；30%過氧化氫溶液（科密歐化學(xué)試劑有限公司）。中間體1 和配位體Phen-N 分別按照文獻(xiàn)[34]和[35]的方法合成。所用實(shí)驗(yàn)試劑及溶劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 探針[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]的合成

配位體的合成路線如圖1 所示。

1.2.1 中間體3 的合成

將9-甲基蒽（2.77 g， 14.00 mmol）、N-甲基苯基甲酰胺（3.89 g， 29.00 mmol）和三氯氧磷（3.89 g，25.00 mmol）混合，在110 ℃下加熱并持續(xù)攪拌1 h。隨后將混合物冷卻至約60 ℃，并加入70 mL 醋酸鈉溶液（1.37 mol/L）。在70 ℃下繼續(xù)攪拌2 h 后進(jìn)行過濾，收集沉淀物并干燥，得到中間體2。將中間體2用一縮二乙二醇（29 mL）溶解，并加入水合肼（2.70 g， 54.00 mmol）。將此混合物在115 ℃下回流0.5 h，然后加入KOH 溶液，并繼續(xù)回流0.5 h。之后，將溫度升至170 ℃并保持2 h。待反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液冷卻并倒入230 mL 的水中。通過抽濾和干燥得到粗產(chǎn)物。最后，使用柱色譜法對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行純化（洗脫劑為二氯甲烷和石油醚的混合液， 1∶20， V/V），得到1.80 g 的黃色固體目標(biāo)物，產(chǎn)率為60.6%。1H NMR（400 MHz， CDCl3-d6），δ（ppm）：3.14（s， 6H）， 7.54（dt， J = 10.0， 20.0 Hz， 4H）， 8.36（dt， J = 9.8， 19.6 Hz，4H）。ESI-MS， m/z：calcd. for C16H14， 206.1；found， 206.1。

1.2.2 中間體4 的合成

在冰水浴條件下，首先將無水氯化鋁（1.73 g， 13.00 mmol）迅速加入到干燥的二氯甲烷（20 mL）中。在氬氣保護(hù)下，將兩個(gè)分別含有乙酰氯（0.82 g， 10.00 mmol）和中間體3（1.80 g， 8.74 mmol）的20 mL 二氯甲烷溶液逐一緩慢滴加到上述氯化鋁的二氯甲烷溶液中。持續(xù)攪拌0.5 h 后，將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移到室溫下繼續(xù)反應(yīng)5 h。之后，將反應(yīng)體系加熱至60 至70 ℃并回流1 h 以完成反應(yīng)。將反應(yīng)液小心地倒入酸性冰水溶液中，通過減壓蒸餾去除二氯甲烷，通過抽濾收集固體并進(jìn)行干燥。最后，使用柱色譜法對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行純化（洗脫劑為二氯甲烷和石油醚的混合液， 1∶2， V/V），最終得到1.36 克的黃色固體目標(biāo)物，產(chǎn)率為63.0%。1H NMR（400 MHz， CDCl3-d6），δ（ppm）：2.80（s， 3H）， 3.10（s， 3H）， 3.18（s， 3H）， 7.54～7.62（m， 2H），8.01（dd， J = 1.7， 9.3 Hz， 1H）， 8.31-8.39（m， 3H）， 9.02（d， J=1.4 Hz， 1H）。ESI-MS， m/z：calcd. forC18H17O [M+H]+， 249.13；found， 248.90。

1.2.3 配位體Hpfdap 的合成

將中間體4（1.36 g， 5.48 mmol）、五氟丙酸乙酯（1.31 g， 6.82 mmol）和甲醇鈉（0.56 g， 10.37 mmol）用無水乙醚（15 mL）溶解。隨后，在室溫下攪拌48 h， 以確保反應(yīng)進(jìn)行完全，再將100 mL 10%的硫酸溶液加入到反應(yīng)體系中，并繼續(xù)攪拌10 min。使用乙醚對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行萃取，分離出有機(jī)相。隨后，通過減壓蒸餾的方式去除乙醚，得到固體沉淀物。對(duì)沉淀物進(jìn)行干燥，使用乙醇對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行重結(jié)晶，最終得到1.50 g 的紅色固體目標(biāo)物，產(chǎn)率為69.8%。1H NMR（400 MHz， CDCl3-d6），δ（ppm）：3.10（s， 3H），3.19（s， 3H）， 6.82（s， 1H）， 7.55～7.65（m， 2H）， 7.84（d， J=9.3 Hz， 1H）， 8.31-8.41（m， 3H）， 9.10（s， 1H），15.49（s， 1H）。ESI-MS， m/z：calcd. for C21H14F5O2 [M–H]–， 393.09；found， 393.22。

1.2.4 配位體CTMR-Phen-N的合成

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，用超干N，N-二甲基甲酰胺（10 mL）溶解超干N，N-二異丙基乙胺（47 μL， 0.27 mmol），再將CTMR （57.40 mg， 0.13 mmol）和o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯（63.00 mg， 0.17 mmol）加入混合液中，室溫?cái)嚢?0 min。隨后，在室溫避光下將Phen-N（122.0 mg， 0.62 mmol）加入其中，繼續(xù)攪拌4 h 使反應(yīng)進(jìn)行完全。最后，將反應(yīng)液倒入由水（100 mL）和飽和NaCl 溶液（40 mL）組成的混合液中，用二氯甲烷對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行3 次萃取，分離出有機(jī)提取液，經(jīng)無水Na2SO4 干燥后再進(jìn)行過濾。減壓蒸餾去除濾液中溶劑后，最終得到57.0 mg的紫色固體目標(biāo)物，產(chǎn)率為70.0%。ESI-MS， m/z：calcd. for C37H30N5O4 [M+H]+，608.23；found， 608.34。

1.2.5 銪（Ⅲ）配合物[Eu（Hpfdap）3（Phen-N）]的合成

用乙醇溶液（10 mL）溶解Hpfdap（0.35 g， 0.90 mmol）、Phen-N（0.06 g， 0.30 mmol）和EuCl3·6H2O（0.11 g， 0.30 mmol），然后將1.0 mol/L 的氫氧化鈉溶液滴入其中，調(diào)節(jié)混合溶液的pH=6.5～7.0。隨后，將反應(yīng)液在90 ℃下回流2 h。反應(yīng)結(jié)束后離心收集沉淀，用體積比為1∶9 的乙醇-水混合溶液洗滌，再用乙醇對(duì)干燥后的粗產(chǎn)物進(jìn)行重結(jié)晶，最終得到0.21 g 的黃色固體目標(biāo)物，產(chǎn)率為45.7%。ESI-MS， m/z：calcd. for C75H51EuF15N3NaO6 [M+Na]+， 1550.26；found， 1549.88。元素分析（%）：calcd. for C75H51EuF15N3O6， C 58.99， H 3.37， N 2.75；found， C 58.52， H 3.38， N 2.69。

1.2.6 探針[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]的合成

用乙醇溶液（10 mL）溶解Hpfdap（0.35 g， 0.90 mmol）、CTMR-Phen-N（0.18 g， 0.30 mmol）和EuCl3·6H2O（0.11 g， 0.30 mmol）， 將1.0 mol/L NaOH 溶液滴入其中，調(diào)節(jié)混合溶液的pH=6.5～7.0。隨后，將反應(yīng)液在90 ℃下回流2 h。反應(yīng)結(jié)束后離心收集沉淀，用體積比為1∶9 的乙醇-水混合液洗滌，再用乙醇對(duì)干燥后的粗產(chǎn)物進(jìn)行重結(jié)晶，最終得到0.27 g 的紅色固體目標(biāo)物，產(chǎn)率為43.6%。ESI-MS， m/z：calcd. for C63H42EuF15NaO6 [M-（CTMR-Phen-N）+Na]+， 1355.18；found， 1355.59。元素分析（%）：calcd. for C100H71EuF15N5O10， C 61.92， H 3.69， N 3.61；found， C 61.53， H 3.69， N 3.59。

1.3 活性氧/氮物種的制備

參照文獻(xiàn)[36]的方法，通過鉬酸鈉與過氧化氫反應(yīng)制備1O2；ClO–通過稀釋6%次氯酸鈉溶液獲得；NO 來自于供體S-亞硝基-N-乙酰青霉胺；過氧亞硝酸陰離子（ONOO–）來自于供體SIN-1；NO2–來自于亞硝酸鈉；羥基自由基（·OH）通過硫酸亞鐵銨與過氧化氫的反應(yīng)獲得[37]。

1.4 光譜測(cè)量

精密稱量探針[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]，用丙酮溶解，配制濃度為1 mol/L 的探針儲(chǔ)備液，備用。用蒸餾水溶解各種活性氧/氮物種，得到濃度為1 mol/L 的活性物種儲(chǔ)備液，備用。向含有Na2MoO4（0.15 mmol）和0.25%氫化蓖麻油的0.1 mol/L 碳酸緩沖溶液（pH=10.5）中加入90 μL 探針儲(chǔ)備液，避光條件下振蕩反應(yīng)5 min， 再將適量H2O2 溶液加入其中，將反應(yīng)液定容至3 mL， 避光條件下振蕩反應(yīng)4 h。用0.05 mol/L硼酸緩沖溶液（pH=7.2）對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行3倍稀釋后，測(cè)定吸收光譜和熒光光譜。測(cè)量熒光光譜時(shí)，激發(fā)波長(zhǎng)為330 nm，而激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。在所有的光譜測(cè)量中，探針濃度均為10 μmol/L。在選擇性實(shí)驗(yàn)中，各活性物種的濃度均為12.2 mmol/L，探針與活性物種的反應(yīng)時(shí)間為30 min。

1.5 細(xì)胞熒光成像

在進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前，將Hela 細(xì)胞置于含10%胎牛血素、1%青霉素和1%鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、含5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將探針溶液加入至含0.25%氫化蓖麻油的二甲亞砜溶液中，再用等滲鹽溶液（含140 mmol/L NaCl、3.5 mmol/L KCl 和10 mmol/L 葡萄糖）稀釋至80 μmol/L，用于細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。

向Hela 細(xì)胞中加入1 mL 含80 μmol/L ALA 的等滲鹽溶液，在37 ℃、含5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5 h 后，用等滲鹽溶液清洗數(shù)次，然后加入含80 μmol/L 探針[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]的等滲鹽溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h， 用汞燈激發(fā)20 min， 然后用于熒光成像檢測(cè)。作為對(duì)照，采用同樣的方法將Hela 細(xì)胞分別與含80 μmol/L ALA 的等滲鹽溶液、含80 μmol/L 探針的等滲鹽溶液以及依次含80 μmol/L ALA、200 μmol/L 疊氮化鈉和80 μmol/L 探針的等滲鹽溶液進(jìn)行孵育，用于熒光成像檢測(cè)。此外，按照上述方法，將細(xì)胞分別與80 μmol/L ALA 和80 μmol/L 探針孵育后，考察汞燈的激發(fā)時(shí)間對(duì)細(xì)胞內(nèi)1O2 熒光成像的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]的設(shè)計(jì)原理

利用β-二酮類銪（Ⅲ）配合物的三元結(jié)構(gòu)組成方式，將1O2 的識(shí)別基團(tuán)蒽環(huán)引入到β-二酮配位體的結(jié)構(gòu)中，設(shè)計(jì)出識(shí)別配位體Hpfdap，利用氨基與羧基之間的鍵合反應(yīng)將作為熒光參照物的CTMR結(jié)合到氨基菲咯啉（Phen-N）上，作為輔助配位體CTMR-Phen-N，將兩種配位體與銪（Ⅲ）離子進(jìn)行配位，構(gòu)建基于銪（Ⅲ）配合物-羅丹明雙熒光團(tuán)的比率型熒光探針[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]用于1O2 檢測(cè)。利用蒽環(huán)識(shí)別1O2 的銪（Ⅲ）配合物熒光探針的研究結(jié)果[38-40]表明，與1O2 反應(yīng)前，由蒽環(huán)導(dǎo)致的三線態(tài)-三線態(tài)相互作用使銪（Ⅲ）配合物的熒光強(qiáng)度很弱；與1O2 反應(yīng)后，蒽環(huán)被氧化為內(nèi)氧化物，銪（Ⅲ）配合物的紅色熒光得以恢復(fù)。與1O2 反應(yīng)前后，探針結(jié)構(gòu)中的羅丹明部分不變，推測(cè)其熒光強(qiáng)度也不會(huì)發(fā)生明顯變化，可用于熒光檢測(cè)的內(nèi)部校準(zhǔn)。根據(jù)文獻(xiàn)[38-39]推測(cè)的探針與1O2 的反應(yīng)原理如圖2 所示。

2.2 探針對(duì)1O2 響應(yīng)前后的發(fā)光性質(zhì)

采用紫外-可見吸收光譜考察了探針[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]和未修飾CTMR 的銪（Ⅲ）配合物[Eu（Hpfdap）3（Phen-N）]與1O2 反應(yīng)前后的光譜特性。如圖3A 所示，未與1O2 反應(yīng)時(shí)，兩種配合物在336 nm 和429 nm 處均顯示出明顯的吸收峰，這兩個(gè)吸收峰歸屬于Hpfdap 結(jié)構(gòu)中蒽環(huán)的特征吸收。與未鍵合CTMR 的銪（Ⅲ）配合物[Eu（Hpfdap）3（Phen-N）]相比，探針在550 nm 處新增一個(gè)CTMR 的吸收峰，表明配位體Phen-N 上成功修飾了CTMR。如圖3B 所示，當(dāng)探針與1O2 反應(yīng)后，在336 nm 和429 nm 處的吸收峰消失，這說明Hpfdap 結(jié)構(gòu)中的蒽環(huán)部分被1O2 氧化形成了內(nèi)氧化物；而位于550 nm 處CTMR 的吸收峰在反應(yīng)后基本保持不變，這表明CTMR 并未與1O2 發(fā)生反應(yīng)?；谶@一特性，該探針可以對(duì)1O2 進(jìn)行比率測(cè)定。

進(jìn)一步考察了探針和未修飾CTMR 的銪（Ⅲ）配合物與1O2 反應(yīng)前后的熒光光譜。如圖4A 和4B 所示，與1O2 反應(yīng)后，探針和未修飾CTMR 的銪（Ⅲ）配合物均在330 nm 和614 nm 處顯示出銪（Ⅲ）離子特征的最大激發(fā)和發(fā)射峰；與銪配合物[Eu（Hpfdap）3（Phen-N）]相比，探針在550 nm 和575 nm 處分別增加了一個(gè)CTMR 的激發(fā)和發(fā)射峰，表明羅丹明已成功鍵合到探針結(jié)構(gòu)中。探針與1O2 反應(yīng)前后的熒光光譜如圖4C 所示，與1O2 反應(yīng)后，探針的銪（Ⅲ）離子特征發(fā)射峰強(qiáng)度顯著升高，量子產(chǎn)率也由1.60%提高至25.16%（電子版文后支持信息表S1），而位于575 nm 處的CTMR 發(fā)射峰強(qiáng)度卻基本保持不變，這說明探針中的蒽環(huán)部分已被完全氧化為內(nèi)氧化物結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致配位體與銪（Ⅲ）離子的“天線效應(yīng)”得以恢復(fù)，同時(shí)也說明該探針可用作檢測(cè)1O2 的比率型熒光探針。

2.3 pH 值對(duì)探針熒光性能的影響

考察了pH 值對(duì)探針與1O2 反應(yīng)前后熒光強(qiáng)度比值（F614/F575）的影響。如圖5 所示，當(dāng)緩沖溶液的pH=3～10 時(shí)，探針本身的F614/F575 很小且基本保持不變；與1O2 反應(yīng)后，探針的F614/F575 在pH=7.2 時(shí)達(dá)最大值，并隨溶液酸度和堿度的增強(qiáng)而呈逐漸下降的趨勢(shì)。因此，該探針適用于弱酸性至弱堿性體系中1O2的比率熒光檢測(cè)。

2.4 探針對(duì)1O2 的選擇性及動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

為了考察探針[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]檢測(cè)1O2 的選擇性，對(duì)常見的活性氧/氮物種與探針反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度變化進(jìn)行了測(cè)試，各活性物種的劑量為1O2 劑量的5 倍。如圖6 所示，與探針溶液本身的本底熒光相比，加入1O2 后， F614/F575 顯著增強(qiáng)，而ClO–、H2O2、ONOO–、NO2–、NO 和·OH 幾乎不影響。此結(jié)果表明，探針對(duì)1O2 的響應(yīng)具有較高的選擇性，不受其它常見活性物種的干擾。

以辣根過氧化物酶（HRP）-吲哚乙酸（IAA）反應(yīng)體系[41]作為單線態(tài)氧源，考察了探針在含有0.25%氫化蓖麻油的0.05 mol/L 醋酸緩沖溶液（pH=4.0）中與1O2 反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)過程。如圖7 所示，向含一定濃度的探針（10 μmol/L）和HRP（0.5 μmol/L）溶液中加入不同量的IAA，反應(yīng)一段時(shí)間后， F614/F575 逐漸上升，并在20 min 時(shí)達(dá)到平臺(tái)，表明此探針能快速捕獲1O2 并產(chǎn)生熒光響應(yīng)。

2.5 探針對(duì)1O2的熒光測(cè)定

考察了探針與不同濃度1O2 反應(yīng)前后熒光光譜的變化。如圖8A 所示，隨著H2O2 濃度的增大，在614 nm 處探針中銪（Ⅲ）離子的熒光強(qiáng)度逐漸升高，最高約達(dá)16 倍，而在575 nm 處探針中CTMR 的熒光強(qiáng)度未發(fā)生明顯變化。以F614/F575 對(duì)1O2 濃度作圖（圖8B）， 1O2 濃度在0.11～2.44 mmol/L 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y = 1.087x + 0.205（R2 = 0.995），檢出限（S/N = 3）為3 μmol/L， 測(cè)定結(jié)果與已報(bào)道的β-二酮類銪（Ⅲ）配合物熒光探針測(cè)定1O2 的結(jié)果[40]相當(dāng)，表明探針具有較高的靈敏度，可用于1O2 的定量測(cè)定。

2.6 細(xì)胞內(nèi)1O2的熒光成像檢測(cè)

采用MTT 法[42]對(duì)探針的細(xì)胞毒性進(jìn)行了考察（電子版文后支持信息圖S15），結(jié)果表明，探針具有較低的細(xì)胞毒性。為了探究探針用于活細(xì)胞內(nèi)1O2 熒光成像的可行性，將細(xì)胞與光敏化劑及探針孵育，再用汞燈激發(fā)產(chǎn)生1O2，進(jìn)行熒光成像，如圖9 所示。當(dāng)細(xì)胞只與探針孵育時(shí)，細(xì)胞內(nèi)發(fā)出綠色熒光信號(hào)（圖9E），這是羅丹明的粉色熒光與細(xì)胞的本底藍(lán)色熒光相互疊加的結(jié)果；當(dāng)細(xì)胞只與光敏化劑ALA 孵育時(shí)，細(xì)胞呈現(xiàn)出微弱的綠色熒光信號(hào)（圖9F）；當(dāng)細(xì)胞先后與ALA 及探針共同孵育時(shí)，細(xì)胞中顯示出很強(qiáng)的黃綠色熒光信號(hào)（圖9G），這是圖9E 中的綠色熒光與探針和1O2 反應(yīng)后產(chǎn)生的銪（Ⅲ）離子的紅色熒光相互疊加的結(jié)果；當(dāng)繼續(xù)向與ALA 和探針孵育的細(xì)胞中加入疊氮化鈉（1O2 的猝滅劑）時(shí)，細(xì)胞又恢復(fù)為與圖9E 相同的綠色熒光（圖9H）。上述結(jié)果說明探針可穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，與光敏化劑經(jīng)照射后產(chǎn)生的1O2 在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了不同光照時(shí)間下細(xì)胞內(nèi)1O2 的熒光成像情況。如圖10 所示，隨著光照時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)1O2 的生成量逐漸增加，紅色熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，而疊加的綠色熒光信號(hào)基本不變，說明此探針可用于細(xì)胞內(nèi)1O2 的比率熒光成像。

3 結(jié)論

以含蒽環(huán)的β-二酮化合物為識(shí)別配位體、鍵合了羅丹明的菲咯啉為輔助配位體，設(shè)計(jì)并合成了1O2比率型熒光探針[Eu（Hpfdap）3（CTMR-Phen-N）]，通過1H NMR、MS 和元素分析方法確定了探針的結(jié)構(gòu)。吸收光譜及熒光光譜研究結(jié)果表明，此探針對(duì)1O2 顯示出增強(qiáng)型比率熒光識(shí)別性質(zhì)，具有選擇性好、準(zhǔn)確度高、響應(yīng)速度快以及檢出限低等優(yōu)點(diǎn)。將此探針成功應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)1O2 的熒光成像。未來有望應(yīng)用于生物醫(yī)療及癌癥的光動(dòng)力學(xué)治療領(lǐng)域。