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    可注射熒光硫化鉍/金納米簇水凝膠用于腫瘤術(shù)后光熱治療和促進(jìn)傷口愈合性能分析

    2024-09-11 00:00:00李卓楊紹賢劉蕊楊正林曹玉玉孫紅梅
    分析化學(xué) 2024年7期
    關(guān)鍵詞:熒光

    關(guān)鍵詞多功能水凝膠;硫化鉍-金納米簇;光熱治療;熒光;術(shù)后傷口

    世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2020 全球癌癥報(bào)告》顯示, 2020 年全球癌癥新發(fā)1930 萬,死亡近1000 萬,預(yù)計(jì)到2040 年,全球癌癥新發(fā)病例將達(dá)到2700 萬[1]。目前,手術(shù)切除仍是實(shí)體腫瘤主要的臨床治療方式之一。手術(shù)切除后輔助全身化療或局部放療是目前防治癌癥復(fù)發(fā)的主要策略[2-3]。但是,由于某些惡性腫瘤對(duì)輻射或化療藥物不敏感,加上術(shù)后組織缺失容易引發(fā)細(xì)菌感染,造成術(shù)后傷口愈合不良[4-5]。因此,亟需開發(fā)新的術(shù)后輔助治療平臺(tái),實(shí)現(xiàn)殘留腫瘤細(xì)胞清除,防止手術(shù)切除部位細(xì)菌感染。

    水凝膠是目前生物材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。水凝膠具有良好的生物相容性、生物降解性、穩(wěn)定性以及可調(diào)的孔隙度和機(jī)械強(qiáng)度,可使傷口區(qū)域保持相當(dāng)?shù)某睗駸o菌環(huán)境。盡管傳統(tǒng)水凝膠制備方法簡(jiǎn)單,但由于不能完全覆蓋不規(guī)則傷口,限制了其在傷口愈合過程中的應(yīng)用。目前,研究者已經(jīng)開發(fā)了具有不同特性的各種新型水凝膠敷料[6-12],其中,可注射水凝膠可通過微創(chuàng)給藥實(shí)現(xiàn)持續(xù)的藥物釋放,引起了廣泛關(guān)注。熒光成像因具有非放射性、可視化、簡(jiǎn)便、安全和高靈敏度等優(yōu)勢(shì),已被廣泛用于腫瘤診斷、生物分子檢測(cè)和藥物分析等領(lǐng)域[13-18]。將熒光納米材料與水凝膠結(jié)合構(gòu)筑多功能可注射水凝膠,可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)精確可視化監(jiān)測(cè)傷口填充情況,防止傷口創(chuàng)面敷料貼合不完全造成傷口創(chuàng)面暴露而影響傷口愈合。

    光熱治療(PTT)是指在近紅外(NIR)激光照射下,聚集在腫瘤組織部位的納米光熱材料將光能轉(zhuǎn)化為熱能,從而使腫瘤部位局部升溫并產(chǎn)生大量氧自由基,進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞的治療方法[19-21]?;贜IR的光熱治療被認(rèn)為是一種有效的癌癥治療策略。同時(shí),光熱試劑可通過局部升溫引發(fā)細(xì)菌內(nèi)蛋白質(zhì)變性和膜通透性的變化,最終殺死細(xì)菌[22],進(jìn)而改善傷口病灶微環(huán)境,促進(jìn)傷口愈合。

    基于此,本研究采用快速凝膠的方法設(shè)計(jì)了具有黏附性、光熱性能、熒光性能和可注射的Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠。在室溫(25 ℃)下,鄰苯二酚改性殼聚糖(CHI-C)和硫化鉍-金納米簇納米顆粒(Bi2S3-Au NCs NPs)經(jīng)過簡(jiǎn)單攪拌混勻后,放置1 min 即可形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。所制備的水凝膠具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)可在小鼠創(chuàng)面原位凝膠化,適應(yīng)不規(guī)則的創(chuàng)面形狀,促進(jìn)創(chuàng)面愈合;(2)具備優(yōu)異的光熱性能,可殺死腫瘤殘余組織及感染細(xì)菌,為降低術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)及改善術(shù)后傷口微環(huán)境提供保障;(3)具有熒光性能,可用于實(shí)時(shí)精確監(jiān)測(cè)其在傷口部位的填充情況。本研究所制備的水凝膠為降低腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和防止傷口感染提供了新的策略。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器與試劑

    RF-6000 熒光分光光度計(jì)(日本島津公司);VERTEX70 近紅外激光器(美國(guó)布魯克公司);ZEN3690馬爾文激光粒度儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司);FD-1D-50 冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);WFH-203B 三用紫外燈(上海耀壯檢測(cè)儀器設(shè)備有限公司);FLIR E40 紅外熱成像儀(上海前視紅外光電科技有限公司);Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀、HAAKE RheoStress 6000 旋轉(zhuǎn)流變儀和ThermoScientific Nicolet iN10 傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher 公司);HITACHI SU8010 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本Hitachi 公司)。

    牛血清白蛋白(BSA,≥98.0%,德國(guó)Biofroxx 公司);HNO3(65%~68%,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);殼聚糖(CS,脫乙酰度≥ 95%,黏度100~200 mPa·s, 中分子量,上海麥克林生化科技有限公司);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司);青霉素-鏈霉素溶液(雙抗)和DMEM 培養(yǎng)基(北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)。其它試劑均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。昆明鼠(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16F10)、金黃色葡萄球菌(S. aureus,編號(hào)ATCC6538)和大腸桿菌(E. coli,編號(hào)ATCC25922)均購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究所。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.2 MΩ?cm)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 水凝膠的制備

    配制CS-HCl 溶液(0.5 g CS 溶于50 mL 0.1 mol/L HCl 溶液中)。將0.24 g 3,4-二羥基苯甲酸、1.24 g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)和0.37 g N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于25 mL HCl-無水乙醇(1∶1, V/V)混合溶液中,將此溶液加入到CS 溶液中,調(diào)至pH 4.5~5.5,室溫?cái)嚢?2 h,得到的粗產(chǎn)物在稀HCl(pH 5)中透析2 d, 冷凍干燥后,得到CHI-C。

    參考文獻(xiàn)[23]的方法制備Bi2S3-Au NCs NPs。稱取33 mg Bi2S3-Au NCs NPs 固體粉末,超聲下溶于450 μL 超純水中。稱取0.015 g CHI-C 于樣品瓶中,加入550 μL 超純水,攪拌溶解。將Bi2S3-Au NCs NPs溶液和CHI-C 溶液混合,渦旋振蕩約1 min, 靜置1 min 左右,制得Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠。

    1.2.2 水凝膠的光熱性能評(píng)價(jià)

    配制不同濃度(CBi=0、1、2、3 和4 μg/mL)的Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠,總體積為1 mL,采用808 nm NIR(2 W/cm2)照射10 min, 用數(shù)顯溫度儀每30 s 記錄一次溶液溫度。

    1.2.3 水凝膠的體外抗菌性能評(píng)價(jià)

    將E. coli 或S. aureus 懸浮液(100 μL, 107 CFU/mL)與1 mL Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠混合,用808 nm NIR(2 W/cm2)照射10 min。1 h 后, 用1 mL 無菌PBS 重懸細(xì)菌。取100 μL 重懸菌液涂布于瓊脂平板上,在37 ℃下培養(yǎng)24 h。以未經(jīng)NIR 照射的Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠為對(duì)照組。

    1.2.4 MTT 法評(píng)價(jià)材料的細(xì)胞相容性

    采用MTT 法研究水凝膠的細(xì)胞相容性[24]。在37 ℃下,將滅菌的Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠在含有胎牛血清(10%)和青霉素-鏈霉素(1%)的DMEM 完全培養(yǎng)基中共孵育24 h, 然后取上清液,與B16F10 細(xì)胞繼續(xù)孵育24 h, 測(cè)量吸光度。

    1.2.5 活體小鼠傷口愈合實(shí)驗(yàn)性評(píng)價(jià)

    將20 只C57BL/6 雌性小鼠大腿內(nèi)側(cè)部位毛發(fā)剔除,皮下注射B16F10 細(xì)胞(100 μL,約106 cell)后,每天定期觀察小鼠原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)情況,以及小鼠的體重、進(jìn)食、活動(dòng)和精神狀態(tài),大約7 d 后完成荷瘤小鼠模型構(gòu)建。

    在無菌條件下,在小鼠腹腔注射80 μL 1.5%戊巴比妥溶液進(jìn)行麻醉,用手術(shù)剪剝離腫瘤后,將50 μLS. aureus 菌液(107 CFU/mL)滴在傷口上。所有小鼠隨機(jī)分為5 組:(1) 空白對(duì)照組,對(duì)傷口不做任何治療處理;(2) 創(chuàng)口貼組,作為陽性對(duì)照組;(3) BSA-CHI-C 水凝膠組;(4) Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠組;(5) Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠+NIR(808 nm, 2 W/cm2)組。實(shí)驗(yàn)期間共給藥4 次,記錄3、7、11 和14 d 小鼠傷口愈合情況,在14 d 處死小鼠并收集傷口組織。

    1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用t 檢驗(yàn)對(duì)不同組間的重復(fù)樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)算p 值。當(dāng)plt;0.05(*)、plt;0.01(**)和plt;0.001(***)時(shí),其差異被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 Bi2S3-Au NCs材料性能評(píng)價(jià)

    以牛血清白蛋白(BSA)為模板制備了Bi2S3-Au NCs 復(fù)合材料,其水合粒徑為134.2 nm(圖1A), Zeta電位約為–18.1 mV(圖1B)。較低的電位使其在水溶液中可以穩(wěn)定存在,透射電鏡(TEM)圖如圖1C 所示, Bi2S3-Au NCs 復(fù)合材料單個(gè)納米顆粒的粒徑約為3 nm。所制備Bi2S3-Au NCs 復(fù)合材料的水合粒徑比透射電鏡測(cè)量的粒徑大,可能是由于在水溶液中納米材料表面大量的BSA 分子伸展所致。圖1D 的X-射線光電子能譜(XPS)圖顯示納米材料中含有Au 和Bi 元素,證明已經(jīng)成功制備出Bi2S3-Au NCs。由于Bi2S3-Au NCs 溶液顯示出強(qiáng)烈的紅色熒光(圖1E 插圖),因此進(jìn)一步分析了其熒光性能。圖1E 的熒光光譜顯示,所制備材料的熒光強(qiáng)度顯示出明顯的濃度依賴性,隨著濃度升高,熒光強(qiáng)度逐漸增大,在濃度為4 μg/mL 時(shí)熒光強(qiáng)度最大,并且未出現(xiàn)熒光淬滅現(xiàn)象。

    Bi2S3 和Au NCs 都具有較強(qiáng)的光熱轉(zhuǎn)換能力,因此考察了Bi2S3-Au NCs復(fù)合材料的光熱性能。以純水為對(duì)照,采用808 nm紅外激光器照射不同濃度(CBi=1、2、3和4 μg/mL)的Bi2S3-Au NCs溶液, 采用數(shù)顯溫度儀記錄溫度升溫曲線。結(jié)果表明, Bi 濃度為4.0 μg/mL 時(shí), Bi2S3-Au NCs 溶液經(jīng)NIR(808 nm、2 W/cm2)照射10 min 后, 溶液溫度達(dá)到47 ℃, 升高了18.2 ℃, 而純水在相同條件下溫度僅升高了2.6 ℃(圖1F),表明Bi2S3-Au NCs 具有較好的光熱性能。

    2.2 Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠的構(gòu)建

    在室溫?cái)嚢柘拢瑢i2S3-Au NCs 與CHI-C溶液混合, 1 min 內(nèi)即可快速形成水凝膠(圖2A)。在此過程中, CHI-C 和Bi2S3-Au NCs 中的BSA 通過氫鍵作用形成多孔網(wǎng)絡(luò)。從圖2B中可看出, Bi2S3-Au NCs-CHI-C水凝膠可緊密附著于翻轉(zhuǎn)的手指和豬皮上,說明此水凝膠具有優(yōu)異的黏附性,為其用于術(shù)后傷口管理提供了基礎(chǔ)(圖2B)。

    所制備的水凝膠在紫外光激發(fā)下顯示出強(qiáng)烈的熒光,這為其用于實(shí)時(shí)檢測(cè)水凝膠敷料傷口填充情況提供了可能(圖3A 和3B)。為了驗(yàn)證Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠的成功制備,首先對(duì)其進(jìn)行了紅外光譜分析。結(jié)果顯示, CS 和CHI-C 均顯示出歸屬于O—H 和N—H 的伸縮振動(dòng)吸收峰(3356 cm–1);與CS 相比, CHI-C 在1539 和1298 cm–1 處分別出現(xiàn)了對(duì)應(yīng)于芳香族C=C 及酚類結(jié)構(gòu)的特征吸收峰[25],進(jìn)一步證實(shí)了CHI-C 的成功合成(圖3C)

    采用旋轉(zhuǎn)流變儀研究了水凝膠的流變特性。如圖3D 所示,在1%~100%應(yīng)變范圍內(nèi), Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠對(duì)振蕩呈線性響應(yīng),并且G′高于G′′,表明此水凝膠為黏彈性固體。頻率掃描測(cè)試結(jié)果(圖3E)顯示, Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠的黏度隨剪切速率的增加而明顯降低。借助掃描電鏡觀察水凝膠其內(nèi)部結(jié)構(gòu)、形貌及孔徑大?。▓D3F),此水凝膠為多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。TEM 圖顯示, Bi2S3-Au NCs 均勻分布在水凝膠中(圖3G)。以上結(jié)果均證明已成功制備具有熒光性能的Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠。

    2.3 Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠的光熱性能評(píng)價(jià)

    考察了Bi2S3-Au NCs-CHI-C水凝膠在808 nm近紅外光照射下的光熱性能。如圖4所示,當(dāng)Bi濃度達(dá)到4.0 μg/mL時(shí), Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠的溫度升高了14.8 ℃,而在相同條件下BSA-CHI-C 水凝膠的溫度僅升高了3.7 ℃, 表明所制備的多功能Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠具有良好的光熱性能。

    2.4 Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠的抗菌性能評(píng)價(jià)

    采用涂布平板法考察了水凝膠的光熱抗菌活性。如圖5 所示, Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠+NIR 組的瓊脂平板表面未出現(xiàn)明顯菌落,而對(duì)照組均出現(xiàn)了大量菌落,說明Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠具有較強(qiáng)的光熱殺菌活性。

    2.5 Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠的細(xì)胞生物相容性和細(xì)胞水平光熱性能評(píng)價(jià)

    水凝膠傷口敷料作為生物材料,應(yīng)具備良好的生物相容性。細(xì)胞相容性是評(píng)價(jià)材料的生物相容性的主要方法之一。通過MTT 法評(píng)價(jià)了制備的水凝膠的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明, Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠與B16F10 細(xì)胞共孵育24 h 后,細(xì)胞存活率均在90%以上,說明此水凝膠具有良好的細(xì)胞相容性(圖6A)。經(jīng)過NIR 光照后, Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠組細(xì)胞存活率明顯降低,說明Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠在NIR 照射下具有較強(qiáng)的殺死腫瘤細(xì)胞的能力(圖6B)。

    2.6 Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠活體評(píng)價(jià)

    采用小鼠模型進(jìn)一步評(píng)價(jià)了Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠促進(jìn)傷口愈合的性能。Bi2S3-Au NCs-CHI-C水凝膠可以貼合于術(shù)后小鼠的傷口上(圖7A),并且顯示出較強(qiáng)的紅色熒光,通過監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度可實(shí)時(shí)精確監(jiān)測(cè)其在傷口部位的填充情況(圖7B)。經(jīng)808 nm 近紅外光照射10 min 后, Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠(CBi=2 μg/mL)溫度能夠達(dá)到49.2 ℃(圖7C)。在近紅外光照射下,治療11 d 后, Bi2S3-Au NCs-CHI-C水凝膠組小鼠的傷口出現(xiàn)明顯收縮;14 d 后, 這一組小鼠傷口幾乎完全愈合,其它組小鼠傷口愈合效果較弱,甚至有腫瘤復(fù)發(fā)跡象(圖7D 和7E)。在治療期間,實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重平穩(wěn)增長(zhǎng),表明所制備的水凝膠沒有影響小鼠的正常生理機(jī)能(圖7F)。Hamp;E 染色結(jié)果顯示,對(duì)比其它組, Bi2S3-Au NCs-CHI-C+NIR 水凝膠治療組小鼠傷口處形成了較薄的完整表皮,并且沒有明顯的淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),說明所制備的水凝膠在近紅外光照射下具有較好的防止腫瘤復(fù)發(fā)及促進(jìn)傷口愈合的功能(圖7G)。

    3 結(jié)論

    采用快速凝膠法制備了一種黏附能力強(qiáng)、光熱轉(zhuǎn)換效率高的的可注射熒光Bi2S3-Au NCs-CHI-C 水凝膠,并將其用于黑色素瘤術(shù)后輔助治療。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,此水凝膠可以有效殺死殘留腫瘤細(xì)胞,防止術(shù)后傷口細(xì)菌感染,促進(jìn)術(shù)后傷口快速愈合。本研究為實(shí)體腫瘤術(shù)后輔助治療提供了新方法。

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