不同白油佐劑制備的雞新城疫、 禽流感（H9亞型）二聯(lián)滅活疫苗的比較試驗(yàn)

摘 要：為研究不同白油佐劑制備的滅活疫苗免疫效果，試驗(yàn)采用2個(gè)廠(chǎng)家的3個(gè)國(guó)外進(jìn)口白油樣品、1個(gè)國(guó)產(chǎn)白油樣品，制備4批雞新城疫、禽流感（H9亞型）（La Sota株+WD株）二聯(lián)滅活疫苗（以下簡(jiǎn)稱(chēng)：雞新-流二聯(lián)滅活疫苗），分別標(biāo)A、B、C、D，按照現(xiàn)行版《中華人民共和國(guó)獸藥典》方法，進(jìn)行性狀、安全檢驗(yàn)、抗體檢測(cè)以及吸收情況對(duì)比。結(jié)果表明，4批樣品析出量均小于0.1 mL，穩(wěn)定性合格。黏度對(duì)比結(jié)果，進(jìn)口白油B最低27.6 cP、進(jìn)口A(yíng) 48.2 cP、進(jìn)口C 56.5cP、國(guó)產(chǎn)D 52.0 cP，吸收情況D組最好，其次是C、A，B組最差。免疫持續(xù)期對(duì)比結(jié)果B組抗體最好，免疫后28 d抗體最高，ND抗體滴度為9.83log2，H9抗體滴度為11.33log2，直到免疫后154 d，ND抗體滴度為5.1log2，H9抗體滴度為8.6log2，仍可以達(dá)到保護(hù)效果；其次是D組，ND部分免疫后21 d抗體滴度最高為8.17log2，H9免疫后42 d抗體滴度最高為9.58log2，ND免疫后154 d抗體滴度為4.2log2，H9抗體滴度為7.8log2；最后為C、A兩組。綜合評(píng)定B組抗體滴度最高但吸收度最差，蛋雞免疫時(shí)可以考慮使用；D組抗體和吸收整體比較好，結(jié)合性?xún)r(jià)比確定為最佳白油佐劑。

關(guān)鍵詞：白油佐劑；抗體；吸收；免疫持續(xù)期；對(duì)比

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1673-1085（2024）08-0013-07

接種疫苗是養(yǎng)殖過(guò)程中常使用的疾病預(yù)防方式，根據(jù)疾病流行特點(diǎn)，對(duì)不同日齡的雞群進(jìn)行不同種類(lèi)疫苗的免疫，包括活疫苗、滅活疫苗、類(lèi)毒素、亞單位疫苗、多肽疫苗、基因工程疫苗等。目前常用的疫苗主要為活疫苗和滅活疫苗。滅活疫苗主要是選用免疫原性好的細(xì)菌、病毒等人工培養(yǎng)后，用物理或化學(xué)的方法將其殺死（滅活），使其失去活性，喪失傳染性，但保留免疫原性，具有安全、不散毒、便于貯存和運(yùn)輸、受母源抗體影響小、產(chǎn)生抗體水平高等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)際生產(chǎn)中，滅活疫苗與活疫苗相結(jié)合使用往往可以達(dá)到理想效果，一般采用活疫苗作基礎(chǔ)免疫，滅活疫苗作加強(qiáng)免疫。

滅活疫苗是由油相和水相（抗原）組成，油相的主要成分是白油，占70%左右，但市場(chǎng)上的白油品質(zhì)參差不齊，制備出的疫苗穩(wěn)定性不同，免疫效果也不同，影響雞群的生長(zhǎng)性能[1]及抗體水平。本文采用3個(gè)國(guó)外進(jìn)口、1個(gè)國(guó)產(chǎn)白油佐劑分別制備4個(gè)雞新城疫、禽流感（H9亞型）二聯(lián)滅活疫苗樣品[2]，按照現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[3]進(jìn)行各項(xiàng)檢驗(yàn)，對(duì)比各項(xiàng)指標(biāo)，并在此基礎(chǔ)上篩選樣品進(jìn)行免疫持續(xù)期試驗(yàn)，尋找一種成本低、質(zhì)量高的白油佐劑。

1" 材料

1.1" 白油

A、B、C組分別為進(jìn)口白油佐劑；D組為新型國(guó)產(chǎn)白油佐劑[4]。

1.2" 滅活疫苗及對(duì)照樣品

分別采用不同白油佐劑制備雞新-流二聯(lián)滅活疫苗4個(gè)樣品，標(biāo)記為A、B、C、D；對(duì)照樣品為生理鹽水，標(biāo)記E；以上樣品均由豪威生物科技有限公司提供。

1.3" 試驗(yàn)動(dòng)物及飼料

SPF雞購(gòu)于北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；滅菌飼料購(gòu)自北京科奧協(xié)力飼料有限公司。

1.4" 檢驗(yàn)用試劑

新城疫抗原和陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；陰性血清由豪威生物科技有限公司提供；禽流感病毒（AIV）H9亞型抗原購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；禽流感病毒（AIV）H9亞型陽(yáng)性血清購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司。

1.5" 主要儀器

正負(fù)壓禽用隔離器（型號(hào)CC-J-H-I型），天津市津航凈化空調(diào)工程公司；移液器，Sartorius、eppendorf。

2 方法

2.1" 疫苗配制

油相（佐劑）與水相（抗原）按一定比例進(jìn)行配制。

2.2" 乳化

三種佐劑（油相）分別加入乳化桶中，開(kāi)啟攪拌至2 500 r/min時(shí)，緩慢加入水相。攪拌速度調(diào)到3 000～3 500 r/min，乳化8 min。

2.3" 物理性狀檢驗(yàn)

按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行測(cè)定[2] 。

2.4" 安全檢驗(yàn)

按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行測(cè)定。

2.5" 吸收試驗(yàn)

篩選5日齡SPF雞110只，免疫組隨機(jī)分為4組，每組25只，分別頸部皮下注射A、B、C、D" 4組滅活疫苗樣品，0.3 mL/只，標(biāo)記好注射部位；同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組10只，按同樣方法、劑量免疫生理鹽水，每天觀(guān)察注射部位的吸收情況。于免疫后14、21、28、35、42 d，每組各剖檢5只，對(duì)照組每次剖檢2只，觀(guān)察注射部位的吸收情況。

2.6" 免疫持續(xù)期試驗(yàn)

篩選21日齡SPF雞50只，試驗(yàn)組40只，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別頸部皮下注射A、B、C、D" 4組滅活疫苗，0.3 mL/只；另設(shè)10只未免疫雞作為對(duì)照。免疫前采血、免疫后每周采血，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄HI方法測(cè)抗體，至任何一種抗體幾何平均值下降到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，即ND的抗體效價(jià)為1：16（4 log2）、AI（H9）為1：64（6 log2）時(shí)，停止試驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1" 物理性狀檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果顯示，4種白油佐劑配制的疫苗，外觀(guān)、劑型、穩(wěn)定性、黏度均符合獸用生物制品疫苗成品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，其中外觀(guān)、劑型、穩(wěn)定性、物理性狀無(wú)明顯差異；在疫苗黏度方面，B組疫苗黏度更低、流動(dòng)性更好，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2" 安全檢驗(yàn)

將4種白油佐劑制備的雞新-流二聯(lián)滅活疫苗大劑量免疫接種SPF雞，結(jié)果均顯示安全、 無(wú)不良反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 吸收情況

吸收情況見(jiàn)表3。由表3可知，免疫14、21 d后4種白油的吸收均不完全，免疫28 d后仍有部分未吸收，結(jié)果對(duì)比為樣品D最好，其次是樣品C、樣品A、樣品B。疫苗未吸收與完全吸收的對(duì)照剖檢情況，見(jiàn)圖1。

3.4 免疫持續(xù)期抗體水平

由表4、圖2可知，ND抗體平均值水平A、B、C、D" 4組疫苗在免疫7 d內(nèi)抗體上升不明顯，免疫后7～14 d內(nèi)迅速上升且在免疫后28 d均達(dá)到最高值，之后抗體水平緩慢下降，且在免疫后140 d時(shí)A、C兩組下降到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以下，B組抗體水平一直高于其他3組，D組抗體水平下降趨勢(shì)平穩(wěn)。

由表5、圖3可知，H9抗體平均值水平A、B、C、D" 4組疫苗在免疫7 d內(nèi)抗體上升不明顯，免疫后7～14 d內(nèi)迅速上升且在免疫后28～42 d分別達(dá)到最高值，之后抗體水平緩慢下降，至免疫154 d后4組H9抗體水平均滿(mǎn)足質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，B組抗體水平最高，D組抗體水平下降趨勢(shì)平穩(wěn)。

由圖4可知，所有免疫組與空白對(duì)照組ND抗體結(jié)果差異顯著（Plt;0.05），對(duì)照組抗體為陰性，試驗(yàn)成立。A組與B組差異顯著（Plt;0.05），B組抗體水平遠(yuǎn)高于A(yíng)組，其他組之間相比差異均不顯著（Pgt;0.05）；4組疫苗在免疫后126 d抗體仍保持在4log2以上，ND抗體整體評(píng)價(jià)順序?yàn)锽gt;Dgt;Cgt;A。

由圖5可知，所有免疫組與空白對(duì)照組H9抗體結(jié)果差異顯著（Plt;0.05），對(duì)照組抗體為陰性，試驗(yàn)成立。所有免疫組之間相比差異均不顯著（Pgt;0.05），4組疫苗在免疫后154 d抗體仍保持在7log2以上，H9抗體整體評(píng)價(jià)順序?yàn)锽gt;Dgt;C=A。

4" 討論與結(jié)論

免疫佐劑是指與抗原同時(shí)或先于抗原使用，能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原免疫應(yīng)答能力或改變免疫反應(yīng)類(lèi)型的物質(zhì)[5-6]。注射用白油作為一種重要佐劑，關(guān)系到疫苗成品的質(zhì)量。各疫苗生產(chǎn)廠(chǎng)家均將注射用白油作為一種關(guān)鍵原材料。進(jìn)口白油佐劑是目前公認(rèn)的質(zhì)量較好的白油佐劑，但因價(jià)格較高，近年來(lái)很多疫苗企業(yè)正嘗試選擇質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的國(guó)產(chǎn)白油佐劑。白油質(zhì)量對(duì)于疫苗安全性及其免疫效力有著重大影響。黏度高低是評(píng)價(jià)疫苗優(yōu)劣的一個(gè)主要指標(biāo)，黏度低，更易于注射、臨床使用方便。此外，免疫后的副反應(yīng)，也就是用戶(hù)普遍反應(yīng)的應(yīng)激問(wèn)題，其本質(zhì)與礦物白油佐劑的內(nèi)在質(zhì)量相關(guān)[7]。

本試驗(yàn)采用SPF雞免疫評(píng)價(jià)方法，可排除雞體自身各種因素的影響，便于疫苗生產(chǎn)企業(yè)客觀(guān)地評(píng)價(jià)白油質(zhì)量，4批樣品析出量均小于0.1 mL，穩(wěn)定性合格，進(jìn)口白油B最低黏度27.6cP，與其他組無(wú)明顯差異。吸收情況對(duì)比：D組最好，其次是C、A、B。免疫持續(xù)期對(duì)比：B組最好，在免疫后28 d抗體滴度最高，ND抗體滴度為9.83log2，H9抗體滴度為11.33log2；到免疫后154 d，ND抗體滴度為5.1log2，H9抗體滴度為8.6log2，仍達(dá)到保護(hù)效果；其次是D組，ND部分在免疫后21 d抗體滴度最高為8.17log2，H9在免疫后42 d抗體滴度最高為9.58log2；到免疫后154 d，ND抗體滴度為4.2log2，H9抗體滴度為7.8log2；最后為C、A兩組。綜合評(píng)定，B組抗體滴度水平最高，但吸收度較差，蛋雞免疫時(shí)可以考慮使用；D組抗體滴度水平和吸收整體比較優(yōu)秀，確定為最佳白油佐劑。

參考文獻(xiàn)：

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Comparative Test of Newcastle Disease and Avian Influenza

（ H9 subtype ） Inactivated Vaccine Prepared with Different

Ehite Oil Adjuvants

ZHANG Na， SHI Yanfeng， JIANG Dong" "， WANG Yanan， HUANG Liying， MA Tongtong， SU Hui

（ HAOVAC Biotechnology Co.， Ltd.， Wuqing" 301700，China ）

Abstract： In order to study the immune effect of inactivated vaccines prepared with different white oil adjuvants， three foreign white oil samples and one domestic white oil sample from two manufacturers were used to prepare four batches of chicken Newcastle disease and avian influenza （ H9 subtype ） （ La Sota + WD ） bivalent inactivated vaccine （ hereinafter referred to as ：" Newcastle disease and avian influenza bivalent inactivated vaccine ） [ 1 ]， Marks A， B， C， D， respectively according to the current edition of the 'Veterinary Pharmacopoeia of the People 's Republic of China 'method [ 2 ]， the characteristics， safety test， antibody detection and absorption comparison were carried out. The antibody was detected by subcutaneous injection of 0.3 ml in the neck. The results showed that the precipitation amount of 4 batches of samples was less than 0.1ml， and the stability was qualified. The lowest viscosity of imported white oil B was 27.6cP， imported A ： 48.2cP， imported C ： 56.5cP， domestic D ： 52.0cP， and the absorption of group D was the best， followed by group C， A and B， and group B was the worst.Compared with the duration of immunization， the antibody in group B was the best. The highest ND antibody was 9.83 log2 and H9 was 11.33 log2 on the 28 th day after immunization. Until 154 days after immunization， the ND antibody was 5.1 log2 and H9 was 8.6 log2， which could still achieve the protective effect. The second was group D. The highest ND antibody was 8.17 log2 on the 21 st day after immunization， and the highest H9 antibody was 9.58 log2 on the 42 nd day after immunization. Until 154 days after immunization， ND antibody was 4.2 log2， H9 was 7.8 log2， and finally C and A groups. Comprehensive evaluation Although the antibody of group B was the highest but the absorption was the worst， the immune use of laying hens can be considered. The antibody and absorption of group D were better as a whole， and then combined with the cost performance， it was determined as the best white oil adjuvant.

Keywords：" White oil adjuvant; Antibody; absorption; Immune duration; Contrast