減蛋綜合征病毒Knob-S蛋白的表達(dá)和免疫原性研究

摘 要：為研究減蛋綜合征病毒亞單位疫苗，構(gòu)建了表達(dá)減蛋綜合征病毒（Egg drop syndrome virus，EDSV）Knob-S蛋白的大腸桿菌重組菌株，成功表達(dá)出可溶性的Knob-S蛋白，血凝（Hemagglutination，HA）和交叉血凝抑制（Hemagglutination inhibition，HI）試驗(yàn)結(jié)果表明，該蛋白具有良好的生物學(xué)活性。分別以HA效價(jià)為1：32、1：64、1：128的Knob-S蛋白制備油乳劑滅活疫苗，免疫147日齡SPF雞21 d后的HI抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，HA效價(jià)為1：64和1：128制備疫苗免疫組可產(chǎn)生良好的HI抗體（≥7.1log2），攻毒結(jié)果顯示，當(dāng)HI抗體效價(jià)≥6log2時(shí)可提供有效的攻毒保護(hù)。結(jié)果表明，表達(dá)的Knob-S蛋白具有良好免疫原性，可作為減蛋綜合征病毒亞單位疫苗制備的候選毒株。

關(guān)鍵詞：Knob-S蛋白；表達(dá)；免疫原性

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1673-1085（2024）08-0125-04

減蛋綜合征（Egg drop syndrome，EDS）是危害蛋雞生產(chǎn)最嚴(yán)重的病毒性傳染病之一，臨床癥狀以產(chǎn)蛋量突然下降、蛋殼異常、蛋品質(zhì)下降等為特點(diǎn)[1-3]。自1976年荷蘭發(fā)現(xiàn)該病以來(lái)，包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家與地區(qū)均報(bào)道了此病的發(fā)生和流行，對(duì)蛋雞生產(chǎn)造成嚴(yán)重的損失[4-6]。纖突蛋白質(zhì)是減蛋綜合征病毒（Egg drop syndrome virus，EDSV）的主要衣殼蛋白質(zhì)，纖突蛋白質(zhì)包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域，即Tail、Shaft和Knob區(qū)，Knob區(qū)不但可識(shí)別宿主細(xì)胞受體，而且能增強(qiáng)病毒的吸附能力[7]，Knob-S蛋白質(zhì)具有良好的免疫原性[8-9]。

2022年山東濰坊某養(yǎng)雞場(chǎng)228日齡的海蘭褐蛋雞出現(xiàn)突然性的產(chǎn)蛋下降，產(chǎn)蛋率由94%下降至68%，出現(xiàn)大量的軟殼蛋和少量畸形蛋，從其病料中成功分離到1株EDSV流行強(qiáng)毒株，命名為SD-YS株。本試驗(yàn)選用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)SD-YS株的Knob-S蛋白進(jìn)行表達(dá)，旨在對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行免疫原性研究，探索Knob-S蛋白的生物學(xué)活性和其用于制備亞單位疫苗的可行性。

1" 材料與方法

1.1" 減蛋綜合征病毒SD-YS株和質(zhì)粒

SD-YS株分離自發(fā)病雞群中產(chǎn)軟殼蛋的雞，取其卵巢和輸卵管進(jìn)行研磨凍融處理后，經(jīng)尿囊腔接種11日齡易感鴨胚，收集72～120 h死胚及活胚的尿囊液，連傳5代并鑒定后獲得，其HA效價(jià)為218，病毒含量為107.7 EID50/0.1 mL，由青島易邦生物工程有限公司保存。含有SD-YS株Knob-S基因的重組質(zhì)粒T-Knob-S（兩端含有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)）、原核表達(dá)載體pET-28a質(zhì)粒，均由青島易邦生物工程有限公司提供。

1.2" 抗原、陽(yáng)性血清和主要試劑

減蛋綜合征病毒血凝抑制試驗(yàn)抗原、陽(yáng)性血清及新城疫病毒陽(yáng)性血清均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。禽流感病毒（H5、H7、H9亞型）陽(yáng)性血清購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司。Taq酶、限制性?xún)?nèi)切酶、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）等均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3" 試驗(yàn)動(dòng)物

易感鴨胚購(gòu)自山東省濟(jì)寧市某鴨場(chǎng)，經(jīng)檢測(cè)其卵黃中EDSV血凝抑制（Hemagglutination inhibition，HI）抗體效價(jià)≤2log2，孵化至11日齡用于病料接種和病毒傳代。SPF雞購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

1.4" 表達(dá)Knob-S蛋白的大腸桿菌重組菌株構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒T-Knob-S和原核表達(dá)載體pET-28a質(zhì)粒分別用EcoRⅠ和HindⅢ酶切，回收連接后，轉(zhuǎn)入BL21受體菌，經(jīng)酶切鑒定后挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。具體方法為：接入含有100 μg/mL Kana的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6，取樣1 mL作為未誘導(dǎo)對(duì)照，其余菌液加入IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）置30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h，離心收集菌體，加入1/5原體積的PBS重懸菌體，經(jīng)超聲波破碎后，離心取上清液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.5" 表達(dá)Knob-S蛋白的特異性鑒定

采用常規(guī)微量法，測(cè)定表達(dá)Knob-S蛋白的血凝（Hemagglutination，HA）效價(jià)；分別與減蛋綜合征病毒、新城疫病毒、禽流感病毒（H5、H7、H9亞型）陽(yáng)性血清，進(jìn)行交叉血凝抑制試驗(yàn)（HI）鑒定。

1.6" 免疫原性試驗(yàn)

1.6.1" 疫苗制備與免疫" 將表達(dá)Knob-S蛋白分別稀釋至HA效價(jià)為1：32、1：64、1：128，經(jīng)終濃度0.1%甲醛溶液35 ℃滅活10 h，按水油比=1：1.5加入油佐劑經(jīng)乳化后制備滅活疫苗。取147日齡SPF雞50只，隨機(jī)分5組，10只/組。第1、2、3組分別經(jīng)頸部皮下免疫亞單位疫苗0.2 mL/只，第4、5組不免疫。免疫21日后進(jìn)行采血，用減蛋綜合征病毒血凝抑制試驗(yàn)抗原測(cè)定HI抗體效價(jià)。

1.6.2" 分組與攻毒" 根據(jù)HI抗體效價(jià)結(jié)果，將相同HI抗體效價(jià)的試驗(yàn)雞分組，經(jīng)肌肉注射攻毒，1.0 mL/只（病毒含量為107.0 EID50），第4組同時(shí)攻毒，作為攻毒對(duì)照組。第5組不攻毒，作為空白對(duì)照。攻毒后觀(guān)察4周，統(tǒng)計(jì)發(fā)病和產(chǎn)蛋情況。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 重組Knob-S蛋白的表達(dá)

挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將誘導(dǎo)后菌液離心，經(jīng)破碎后取菌體沉淀和上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，與未誘導(dǎo)菌液比較，誘導(dǎo)后的上清液中出現(xiàn)約26 kDa的蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，表明Knob-S蛋白獲得可溶性的表達(dá)。詳見(jiàn)圖1。

2.2" 表達(dá)Knob-S蛋白的特異性鑒定

HA測(cè)定結(jié)果顯示，表達(dá)的Knob-S蛋白HA效價(jià)為1：1 024。交叉HI試驗(yàn)結(jié)果顯示，Knob-S蛋白僅與EDSV陽(yáng)性血清HI試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性（1：256）；與雞新城疫病毒、禽流感病毒（H5、H7、H9亞型）陽(yáng)性血清HI試驗(yàn)結(jié)果均為陰性（均lt;1：2）。

2.3" 免疫原性試驗(yàn)

2.3.1" 抗體檢測(cè)結(jié)果" 免疫21日后，以HA效價(jià)為1：32的Knob-S蛋白制備疫苗免疫組的HI抗體效價(jià)平均值為6.0log2，以HA效價(jià)為1：64、1：128的Knob-S蛋白制備疫苗免疫組的HI抗體效價(jià)平均值分別為7.1log2、7.9log2，對(duì)照組的HI抗體效價(jià)均為陰性（lt;1.0log2）。結(jié)果表明，血清HI抗體效價(jià)與制苗的HA效價(jià)呈正相關(guān)。詳見(jiàn)表1。

2.3.2" 攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果" 免疫21日后攻毒結(jié)果顯示，試驗(yàn)雞臨床表現(xiàn)均無(wú)異常。產(chǎn)蛋情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，未攻毒對(duì)照組產(chǎn)蛋率為73%；攻毒對(duì)照組產(chǎn)蛋率為44%；5log2組產(chǎn)蛋率為56%；6log2、7log2、8log2組產(chǎn)蛋率為70%～73%，與未攻毒對(duì)照組產(chǎn)蛋率接近。結(jié)果表明，HI抗體效價(jià)≥6log2試驗(yàn)雞攻毒后可獲得有效保護(hù)。詳見(jiàn)表2。

3" 討論

常規(guī)的減蛋綜合征疫苗的抗原是采用EDSV接種鴨胚繁殖后收獲尿囊液制備，若滅活不完全存在巨大的安全隱患[9]，同時(shí)鴨胚來(lái)源和母源抗體等會(huì)影響EDSV的繁殖滴度和疫苗質(zhì)量。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)因其表達(dá)蛋白量高，同時(shí)發(fā)酵工藝和蛋白提取工藝成熟，是目前應(yīng)用最廣泛的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。

本試驗(yàn)將分離的臨床流行強(qiáng)毒SD-YS株的Knob-S基因，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，誘導(dǎo)后SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示，Knob-S蛋白獲得可溶性表達(dá)，與預(yù)期結(jié)果一致。血凝試驗(yàn)和交叉血凝抑制試驗(yàn)證明了表達(dá)Knob-S蛋白的生物學(xué)活性，其具有與天然蛋白質(zhì)相似的抗原性。免疫試驗(yàn)結(jié)果和攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，Knob-S蛋白可刺激產(chǎn)生較高的HI抗體效價(jià)，當(dāng)HI抗體效價(jià)≥6log2可獲得良好的攻毒保護(hù)。預(yù)防減蛋綜合征的最有效方法是對(duì)開(kāi)產(chǎn)前蛋雞進(jìn)行免疫[10]。

4" 小結(jié)

綜上所述，本試驗(yàn)表達(dá)的Knob-S蛋白具有良好的免疫原活性，可為EDS亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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Expression and Immunogenicity of Egg Drop Syndrome

Virus Knob S Protein

WANG Xiuli" " ， SHI Hongchao， LIU Xinwen， ZHU Hongwei， LIU Dawei， YU Kechao， XIA Na

（Qingdao Yebio Bioengineering Co.， Qingdao" "266113， China）

Abstract： To study the subunit vaccine of EDSV， the soluble Knob-S protein was successfully expressed in E.coli. The results of hemagglutination and cross hemagglutination inhibition tests showed that the Knob-S protein had good biological activity. After the Knob-S protein was inactivated as antigen， oil emulsion inactivated vaccine was prepared with HA titer of 1：32， 1：64 and 1：128， respectively. After immunizing 147-day-old SPF chickens， HI antibody detection results showed that the immunized group with HA titer of 1：64 and 1：128 prepared vaccine could produce good HI antibody （≥7.1log2）. When the titer of HI antibody is not less than 6log2， it can provide effective attack protection. The results showed that the Knob-S protein had good immunogenicity and could be used as a candidate strain for preparation of EDSV subunit vaccine.

Keywords： Knob-S protein; Expression; Immunogenicity