關(guān)鍵詞：設(shè)施蔬菜；種植年限；黃壤；微生物群落結(jié)構(gòu)；高通量測序

中圖分類號：S154.3：S626 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2024）06-0065-10

設(shè)施蔬菜生產(chǎn)在滿足人們生活需求和增加農(nóng)民收入方面發(fā)揮著重要作用。2021年，我國設(shè)施蔬菜種植面積達(dá)到400萬hm²。然而，隨著生產(chǎn)規(guī)模的快速擴(kuò)大，長期集約化種植造成的連作障礙已成為制約我國設(shè)施蔬菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要瓶頸。因此，了解設(shè)施蔬菜連作障礙的機(jī)制，有利于制定有效措施來解決長期制約設(shè)施蔬菜可持續(xù)經(jīng)營中存在的難題。設(shè)施菜地長期種植通常會導(dǎo)致土壤質(zhì)量惡化，影響蔬菜產(chǎn)質(zhì)量，不利于設(shè)施蔬菜可持續(xù)生產(chǎn)。隨著設(shè)施菜地連年種植，土壤質(zhì)量的變化被認(rèn)為是造成連作障礙的重要原因，如土壤酸化和鹽堿化、土壤養(yǎng)分耗竭和失衡、植物毒性和自毒性化合物的釋放及積累等。此外，土壤生物特性也受到越來越多的關(guān)注，特別是土壤微生物在土壤質(zhì)量中占有重要地位，具有維持土壤肥力和減輕土壤污染的作用。相關(guān)研究表明，土壤微生物群落組成和多樣性在改善土壤質(zhì)量和保持土壤健康方面具有重要作用，通常作為衡量土壤質(zhì)量變化的重要指標(biāo)。眾多研究表明，種植制度和土地利用類型會強(qiáng)烈影響土壤微生物的豐度和群落結(jié)構(gòu)。然而，與露天栽培相比，設(shè)施種植通常具有高養(yǎng)分投入、高灌溉頻率和較高土壤溫度等特點(diǎn)，會導(dǎo)致土壤微生物群落發(fā)生顯著變化。由此可知，通過研究設(shè)施蔬菜長期種植過程中土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，并探索其與連作障礙之間的關(guān)系，有利于改善土壤質(zhì)量。

黃壤為我國西南地區(qū)的主要土壤類型，其中貴州黃壤占全國黃壤面積的30.27%，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要地位。黃壤具有質(zhì)地黏重、透水性差、養(yǎng)分含量低、酸性強(qiáng)等特點(diǎn)，不利于設(shè)施蔬菜的持續(xù)健康發(fā)展。目前，設(shè)施蔬菜土壤微生物方面的研究主要集中在潮土、褐土等類型上，關(guān)于設(shè)施黃壤中微生物群落的演變規(guī)律未見報(bào)道。為此，本研究利用高通量測序技術(shù)，通過對不同種植年限下貴州設(shè)施菜地黃壤微生物群落進(jìn)行分析，揭示細(xì)菌和真菌群落的演變特征及其環(huán)境驅(qū)動因子，從土壤微生物角度解析設(shè)施黃壤的連作障礙機(jī)制（土壤質(zhì)量退化的內(nèi)在因素），以期為實(shí)現(xiàn)設(shè)施黃壤的可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試土壤

供試土壤樣品采集于貴州省銅仁市和平鄉(xiāng)（109°07′44″E，27°46′46″N），土壤類型為黃壤，年降水量1313mm。2023年8月選擇4種不同種植年限（1、5、10、12年）設(shè)施菜地，主要種植黃瓜、茄子和豇豆等。以氮磷鉀復(fù)合肥作為基肥，施用量為1200～1500 kg/hm²；氮肥為追肥，施用量為600～750kg/hm²。各種植年限的設(shè)施菜地隨機(jī)選擇3個(gè)重復(fù)，每樣地內(nèi)按“S”形（五點(diǎn)法）采取0～20 cm土層土壤樣品后混合，過2mm篩，一部分-80℃保存用于土壤微生物（細(xì)菌和真菌）分析，一部分風(fēng)干后用于土壤理化性質(zhì)分析。

1.2土壤化學(xué)指標(biāo)測定

土壤pH值、有機(jī)碳（SOC）、全氮（TN）、堿解氮（AN）、速效磷（AP）和速效鉀（AK）含量的測定方法見表1。

1.3土壤DNA提取及高通量測序

利用DNA提取試劑盒（Sigma-Aldrich，Ger-many）提取土壤DNA，應(yīng)用核酸定量儀對DNA濃度和純度進(jìn)行檢測。土壤細(xì)菌和真菌擴(kuò)增引物見表2。利用Illumina MiSeq平臺對土壤細(xì)菌16SrRNA和真菌ITS進(jìn)行測序?；赒IIME分析平臺對原始FASTQ文件進(jìn)行過濾、拼接、去除嵌合體。序列比對后按照97%相似性水平劃分操作分類單元（OTU）。在細(xì)菌和真菌數(shù)據(jù)庫中，應(yīng)用RDP Classifier提供的參考序列和分類系統(tǒng)對土壤細(xì)菌和真菌中97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類注釋。

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

利用Mothur軟件計(jì)算細(xì)菌和真菌群落的α多樣性指數(shù)；運(yùn)用Origin 21軟件對土壤細(xì)菌和真菌優(yōu)勢類群作圖；利用R軟件進(jìn)行PCoA、RDA和SEM分析；采用SPSS 21.0軟件對土壤理化性質(zhì)、細(xì)菌和真菌群落α多樣性指數(shù)、群落相對豐度進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)（Plt;0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1不同種植年限對黃壤化學(xué)性質(zhì)的影響

設(shè)施蔬菜長期種植對黃壤的化學(xué)性質(zhì)有顯著影響，由表3可知，隨種植年限的延長，土壤pH值和速效鉀含量逐漸降低；其中pH值在種植5年后顯著下降，速效鉀含量在種植1年后就開始顯著下降。土壤有機(jī)碳含量隨種植年限呈先增后減的趨勢，種植12年時(shí)顯著低于其他年限。全氮和堿解氮含量隨種植年限增加逐漸增加：其中全氮含量在種植1年時(shí)顯著低于其他處理，其他種植年限之間差異不顯著：堿解氮含量在種植年限之間有顯著差異，種植12年時(shí)最高，為172.12mg/kg。速效磷含量在種植5年后呈現(xiàn)顯著遞增趨勢，種植12年較種植1、5、10年分別增加56.02%、63.28%、14.87%。

2.2不同種植年限黃壤細(xì)菌和真菌多樣性指數(shù)

由表4可知，不同種植年限設(shè)施菜地黃壤中細(xì)菌和真菌分別獲得質(zhì)控后序列數(shù)為83655～88856條和60016～74117條。隨種植年限增加，土壤細(xì)菌OTUs逐漸減少，種植12年時(shí)OTUs數(shù)為3116個(gè)，顯著低于其他種植年限。土壤真菌的OTUs在種植5年時(shí)最少，顯著低于種植1年和12年。

土壤細(xì)菌α多樣性指數(shù)均大于真菌。土壤細(xì)菌Chaol指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)變化大致相同，在種植1、5、10年間差異不顯著，種植12年時(shí)顯著低于1年、5年和10年。由此可知，設(shè)施黃壤中細(xì)菌群落α多樣性對1～10年之間的蔬菜栽培不敏感。種植1、10年和12年間黃壤真菌群落各α多樣性指數(shù)無顯著性差異。種植5年真菌群落的Chaol指數(shù)和ACE指數(shù)與種植1、12年間有顯著差異。種植5年時(shí)真菌群落的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)與1、10、12年之間有顯著差異。設(shè)施菜地黃壤中細(xì)菌豐富度和多樣性隨種植年限增加遞減，在種植12年時(shí)發(fā)生顯著變化：真菌豐富度和多樣性隨種植年限增加呈先減后增趨勢，種植5年時(shí)達(dá)到最低，并發(fā)生顯著變化。

2.3不同種植年限土壤細(xì)菌和真菌群落組成

在細(xì)菌門水平上，將平均相對豐度lt;1%的類群歸類為其他，得到9個(gè)類群（圖la），分別為變形菌門（Proteobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimo-nadetes）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、粘菌門（Myxococcota）、厚壁菌門（Firmicutes）和疣微菌門（Verrucomicrobiota），其中變形菌門（30.50%～36.68%）、芽單胞菌門（15.20%～19.39%）、放線菌門（14.83%～17.01%）、綠彎菌門（9.14%～13.38%）、酸桿菌門（8.11%～11.90%）為優(yōu)勢菌門，總相對豐度為85.25%～90.22%。在真菌門水平上，子囊菌門（Ascomycota）、被孢菌門（Mortierellomycota）和擔(dān)子菌門（ Basidiomycota）的相對豐度均達(dá)到1%以上，總相對豐度平均為97.32%（圖1b）。

由圖2可知，不同種植年限中，變形菌門、芽單胞菌門、放線菌門、綠彎菌門、酸桿菌門和子囊菌門存在顯著差異。其中，變形菌門相對豐度隨種植年限增加逐漸降低，種植1年時(shí)最高（36.68%），分別與種植5年、10年和12年間差異顯著；芽單胞菌門相對豐度隨種植年限增加遞增，種植12年時(shí)顯著高于其他種植年限：放線菌門相對豐度在種植1年后顯著增加，且種植5年、10年和12年之間無顯著差異；在種植10年時(shí)，綠彎菌門和酸桿菌門相對豐度顯著高于其他種植年限；子囊菌門相對豐度在種植1年、5年和10年中沒有顯著變化，種植12年時(shí)顯著下降。以上結(jié)果表明，長期種植對設(shè)施菜地黃壤細(xì)菌和真菌群落組成有顯著影響。

在細(xì)菌屬水平上，得到相對豐度在1%以上的10個(gè)類群（圖3a），其中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和芽單胞菌屬（Gemmatimonas）相對豐度高于其他屬。鞘氨醇單胞菌屬相對豐度在各種植年限之間均有顯著差異，種植1年后顯著降低，種植10年時(shí)最低（4.50%），在種植12年時(shí)表現(xiàn)出顯著增加。芽單胞菌屬相對豐度隨種植年限增加遞增，在種植12年時(shí)顯著高于其他種植年限，1年、5年和10年之間無顯著差異。

真菌屬水平上，相對豐度大于1%的類群有7個(gè)，其中毛葡孢屬（Botryotrichum）和青霉菌屬（Penicillium）為優(yōu)勢類群，相對豐度分別為11.36%～52.90%和6.99%～22.50%。毛葡孢屬相對豐度在種植5年時(shí)顯著高于其他種植年限：種植1年時(shí)最低（11.36%），與種植10年和12年之間差異不顯著。青霉菌屬相對豐度隨種植年限的增加遞增，在種植12年時(shí)最高，為22.50%，分別與1年和5年之間有顯著差異?？梢姡N植年限對細(xì)菌和真菌屬水平上優(yōu)勢類群影響較大。

2.4不同種植年限土壤細(xì)菌和真菌群落的層次聚類和PCoA分析

對不同種植年限土壤細(xì)菌和真菌OTU構(gòu)建的層次聚類樹分析（圖4）表明，種植年限明顯改變了土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)。土壤細(xì)菌相同種植年限的3個(gè)重復(fù)均聚類在一起，其中種植10年與12年距離較近，與種植1年距離較遠(yuǎn)（圖4a）。土壤真菌在種植1年與5、10、12年分離較明顯（圖4b）?？傮w可知，在設(shè)施菜地黃壤種植1年后，細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯分離，種植年限越長分離越明顯。

PCoA分析進(jìn)一步證實(shí)不同種植年限土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯。PCoAl和PCoA2對土壤細(xì)菌和真菌群落分別解釋了總變異的51.8%、39.4%和18.3%、24.2%（圖5）。總體可知，土壤細(xì)菌種植1年和5年分布在同一象限內(nèi)，距離較近，說明群落結(jié)構(gòu)相似度較高。12年與1、5、10年距離較遠(yuǎn)，說明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。土壤真菌種植10年與12年之間距離較近，1年與5年、10年和12年發(fā)生明顯分離，說明真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。結(jié)果表明，種植年限越長對土壤細(xì)菌群落影響越大，土壤真菌群落在種植1年后開始發(fā)生明顯變化。

2.5土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

種植年限對微生物群落的作用可能主要由土壤化學(xué)性質(zhì)的變化引起。通過RDA分析細(xì)菌和真菌優(yōu)勢菌屬與土壤化學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)系，結(jié)果（圖6a）顯示，RDA1和RDA2分別解釋了土壤細(xì)菌群落變異的74.19%和13.68%，前兩軸解釋了總變異的87.87%。RDA1和RDA2分別解釋了土壤真菌群落變異的50.04%和29.38%，前兩軸解釋了總變異的79.42%（圖6b）。表明微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境密切相關(guān)。由表5可知，pH值對土壤細(xì)菌和真菌群落有顯著影響；有機(jī)碳、速效鉀、速效磷對土壤細(xì)菌和真菌群落有極顯著影響；全氮和堿解氮對土壤真菌群落有極顯著影響：堿解氮對土壤細(xì)菌群落有顯著影響。

通過結(jié)構(gòu)方程，構(gòu)建種植年限一土壤養(yǎng)分一細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性之間的關(guān)系模型（圖7）表明，種植年限對設(shè)施菜地黃壤中細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)均有直接的顯著影響（Plt;0.05），其中對細(xì)菌群落有負(fù)影響，對真菌群落有正影響，對真菌的影響強(qiáng)于細(xì)菌。種植年限直接對速效磷產(chǎn)生顯著的正影響（Plt;0.05），直接對堿解氮產(chǎn)生極顯著的正影響（Plt;0.001），對土壤pH值和速效鉀直接產(chǎn)生極顯著的負(fù)影響（Plt;0.001）。種植年限通過降低土壤pH值和速效鉀含量，間接抑制真菌群落和細(xì)菌群落及其多樣性。速效鉀對土壤真菌多樣性有極顯著負(fù)影響（Plt;0.001）。

3討論與結(jié)論

本研究中，設(shè)施菜地黃壤種植5年以上顯著降低了土壤pH值，表明長期種植導(dǎo)致土壤酸化，可能與黃壤的特性、長期施用氮肥和蔬菜大量吸收鈣等因素有關(guān)。土壤有機(jī)碳含量隨種植年限先增加后逐漸減少，與Zhao等的研究結(jié)果不一致，可能與本研究區(qū)域有機(jī)肥料施用較少和蔬菜復(fù)種指數(shù)高有關(guān)。此外，全氮含量和堿解氮含量隨種植年限增加而增加，表現(xiàn)出營養(yǎng)積累現(xiàn)象，可能與設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中當(dāng)?shù)剞r(nóng)民持續(xù)大量施用氮肥，以及長期種植抑制蔬菜對養(yǎng)分的吸收等因素有關(guān)。速效鉀含量隨種植年限增加逐漸降低，與宋蒙亞等的研究結(jié)果一致。設(shè)施菜地黃壤中速效鉀含量不斷減少可能有兩個(gè)方面原因：一是氮肥施用較多，鉀肥施用較少，蔬菜在吸收氮素時(shí)，也吸收較多的鉀；二是設(shè)施菜地有機(jī)肥料施用較少，沒有對鉀進(jìn)行有效補(bǔ)充。

土壤微生物多樣性在維持土壤健康和質(zhì)量方面具有重要意義，對土壤環(huán)境變化較敏感。長期施用無機(jī)肥料，特別是大量施用氮肥可降低土壤細(xì)菌和真菌多樣性。本研究中，土壤細(xì)菌群落的Chaol指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在種植1～10年之間沒有顯著差異，種植10年后土壤細(xì)菌豐富度和多樣性顯著下降。這可能是由于黃壤本身缺少養(yǎng)分，施肥在一定時(shí)間內(nèi)有利于改善土壤質(zhì)量，為細(xì)菌生長提供適宜的環(huán)境條件；然而，長期種植和施肥會導(dǎo)致土壤細(xì)菌豐富度和多樣性下降。土壤真菌多樣性和豐富度指數(shù)在種植5年時(shí)顯著降低，隨后在種植10、12年時(shí)略有增加。原因可能是隨種植年限增加，土壤微生物會保持一定的彈性，同時(shí)真菌在不良土壤環(huán)境下具有較強(qiáng)的耐受能力。相關(guān)研究表明，設(shè)施種植年限通過改變土壤理化性質(zhì)，進(jìn)而影響土壤微生物群落。本研究中，OTU層次聚類和PCoA分析表明，種植年限顯著改變了設(shè)施菜地黃壤中細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)直接反映土壤的生物功能。因此，解決設(shè)施栽培長期連作障礙的關(guān)鍵在于不斷改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，使土壤固有的生物功能保持暢通。

高通量測序結(jié)果表明，細(xì)菌門水平上的優(yōu)勢類群為變形菌門、芽單胞菌門、放線菌門、綠彎菌門和酸桿菌門，與前人研究結(jié)果類似。然而，Tian等研究認(rèn)為，變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門和放線菌門是優(yōu)勢類群，與本研究有所差異，可能與土壤類型和種植年限等不同有關(guān)。變形菌門在土壤中分布較為廣泛，適宜生長在pH值和碳含量較高的營養(yǎng)環(huán)境。本研究中，變形菌門相對豐度在設(shè)施種植1年時(shí)最高，可能與該時(shí)期土壤pH值和有機(jī)碳含量均較高有關(guān)。芽單胞菌門具有嗜鹽的特點(diǎn)，適宜生長在鹽堿環(huán)境，對極端環(huán)境具有較強(qiáng)的耐受性。芽單胞菌門相對豐度隨種植年限增加遞增，可見長期設(shè)施栽培下較強(qiáng)的土壤鹽堿化有利于該類群生長。放線菌門具有分解動植物殘?bào)w的作用。放線菌門相對豐度隨種植年限增加遞增，可能由于設(shè)施蔬菜在長期種植中產(chǎn)生較多的蔬菜殘?bào)w對放線菌生長有促進(jìn)作用。酸桿菌門相對豐度在種植10年時(shí)顯著高于其他種植年限，可能由于酸桿菌門具有寡營養(yǎng)特點(diǎn)，適宜生長在有機(jī)質(zhì)較低的酸性環(huán)境。子囊菌門為真菌的優(yōu)勢門，與前人研究結(jié)果一致，且在農(nóng)業(yè)土壤中廣泛分布。子囊菌門相對豐度在種植12年時(shí)最低，且與其他種植年限差異顯著，這可能由于子囊菌種群特別容易受到高營養(yǎng)水平的影響，特別是設(shè)施蔬菜長期種植中過量氮肥的輸入，對子囊菌有抑制作用。

土壤作為土壤微生物生存最重要的生境，長期設(shè)施栽培中土壤理化性質(zhì)的顯著改變可能是導(dǎo)致土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要因素。土壤pH值是影響土壤微生物群落組成的最重要環(huán)境因子。事實(shí)上，許多土壤性狀如有機(jī)碳和鹽度等指標(biāo)，都直接或間接地與pH值有關(guān)。Zhang等研究認(rèn)為，土壤有機(jī)碳的變化及種植年限的延長，可通過減少微生境中的氧氣擴(kuò)散來影響微生物群落組成。由此可知，土壤pH值在確定微生物群落方面的重要性并不能完全排除其他土壤特性對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)方面的影響。因此，在不同種植年限設(shè)施菜地黃壤微生物群落組成中，土壤養(yǎng)分可能發(fā)揮著重要作用。本研究中，速效鉀與土壤細(xì)菌和真菌群落有極顯著相關(guān)關(guān)系，該發(fā)現(xiàn)具有重要的意義。因?yàn)榻陙泶蠖鄶?shù)相關(guān)研究關(guān)注氮、磷容易導(dǎo)致土壤富營養(yǎng)化和地下水污染，而鉀由于對地下水污染影響較小，其重要性常常被忽略。本研究發(fā)現(xiàn)，土壤理化性質(zhì)對土壤真菌的影響程度強(qiáng)于細(xì)菌，說明真菌可能對土壤質(zhì)量的變化更敏感。

綜上所述，連續(xù)種植5年以上顯著改變了設(shè)施菜地黃壤的化學(xué)性質(zhì)和微生物群落。隨種植年限延長，變形菌門和子囊菌門相對豐度逐漸降低，芽單胞菌門相對豐度逐漸增加，放線菌門和綠彎菌門相對豐度呈先增后減趨勢。種植年限均對細(xì)菌和真菌群落有直接顯著影響，且對真菌的影響比細(xì)菌更加明顯。土壤pH值和速效鉀對土壤細(xì)菌和真菌群落有直接顯著影響。本研究為了解設(shè)施菜地黃壤對種植年限的響應(yīng)提供了較多的見解，并明確了影響土壤微生物群落的主要因素，有助于加強(qiáng)黃壤的質(zhì)量管理，實(shí)現(xiàn)設(shè)施蔬菜的可持續(xù)發(fā)展和土壤質(zhì)量的改善。