多組學(xué)綜合分析白木通自花授粉后幼果脫落機(jī)制

摘要：【目的】通過(guò)多組學(xué)綜合分析白木通幼果在自花授粉后的脫落機(jī)制，為白木通良種繁育提供理論依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^(guò)人工授粉技術(shù)對(duì)白木通栽培種BMTGKAN1進(jìn)行自花授粉和栽培種間授粉，授粉后第13和18d取樣，利用苯胺藍(lán)染色法分析授粉后花粉管的萌發(fā)情況，石蠟切片技術(shù)觀察授粉后胚珠發(fā)育情況，統(tǒng)計(jì)不同授粉處理的幼果留存率，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析授粉后幼果脫落機(jī)制?！窘Y(jié)果】自花授粉和栽培種授粉的花粉在BMTGKAN1雌蕊內(nèi)萌發(fā)生長(zhǎng)情況相似，但在受精過(guò)程中，栽培種間授粉胚珠在授粉后6h發(fā)生核融合，自花授粉組的胚珠面積較小，未發(fā)生核融合，授粉后18d栽培種間授粉的胚珠發(fā)育出胚乳和胚，而自花授粉胚珠未發(fā)育出胚乳和胚，出現(xiàn)內(nèi)外珠被分離，且此時(shí)幼果留存率存在明顯差異，即自花授粉后第18d幼果留存率僅為5.92%，栽培種間授粉后第18d幼果留存率高達(dá)86.24%。在轉(zhuǎn)錄和代謝水平上，栽培種間授粉與自花授粉相比，授粉后第13d和第18d差異表達(dá)基因（DEGs）分別為444和3646條，差異代謝物（DEMs）分別為427和412個(gè)。在相同授粉方式的比較中，自花授粉后第13d與第18d相比，有3305個(gè)DEGs和457個(gè)DEMs，栽培種間授粉第13d與第18d相比，有1123個(gè)DEGs和420個(gè)DEMs。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)基本相同，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確。在各對(duì)比組DEGs和DEMs聯(lián)合分析中，至少在一個(gè)對(duì)比組中被富集到的KEGG信號(hào)通路共有162條，其中有48條在各對(duì)比組中均被富集到。植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、亞油酸代謝通路、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路和苯丙烷生物合成通路極有可能參與調(diào)控白木通自花授粉后的幼果脫落?！窘Y(jié)論】BMTGKAN1屬于晚期自交不親和植物，其自花授粉后13～18d大量脫落幼果，受其體內(nèi)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、亞油酸代謝通路、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路、苯丙烷生物合成通路調(diào)控，在種植實(shí)踐中選擇2個(gè)及以上花期相近的白木通栽培品種隔行交叉種植以提高坐果率。

關(guān)鍵詞：白木通；自花授粉；幼果脫落；轉(zhuǎn)錄組；代謝組

中圖分類號(hào)：S567.190.353文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）01-0137-14

Multi-omics comprehensive analysis of fruitlet abscission mecha-nism after self-pollination of Akebia trifoliata ssp.australis

LI Xian-hang，LONG Feng，XIONG Yi，CHEN Song-shu，LIU Hong-chang

（College of Agriculture，Guizhou University/Guizhou Key Laboratory of Propagation and Cultivation on Medicinal Plants，Guiyang，Guizhou550025，China）

Abstract：[Objective]In this study，multi-omics comprehensive analysis methods were used to explore the mecha-nism of fuitlet abscission after self-pollination of Akebia trifoliata ssp.anstralis，and to provide atheoretical basis for the breeding of improved varieties of A.trifoliata ssp.australis.【Method]Self-pollination and interspecific polination of A trifoliata ssp.australis cultivated variety BMTGKANI were carried out by artificial pollination techniques.Samples were taken on the13and18#d after pollination.The pollen tube germination was analyzed by aniline blue staining method，and ovule development was observed by paraffin section technique，and the retention rate of fruitlet under different polli-nation treatments was calculated.The mechanism offruitlet shedding after pollination was analyzed by transcriptome and metabolome.The germination and growth of pollen in BMTGKANI pisticles were similarbetween self-pollinated and cul-tivated varieties.However，during fertilization，the ovule of cultivated interspecific pollination occurred nuclear fusion at6h after pollination.The ovule area of self-polination group was small，and nuclear fusion did not occur.[Result]At18d after pollination，the ovules of inter-specific pollination developed endosperm and embryo，while the ovules of self-pollination developed no endosperm and embryo，and the inner and outer integuments were separated，and the fruitlet re-tention rate was quite different at this time.On the18*d after pollination，the fruitlet retention rate of self-pollinated was only5.92%，while that of cultivated species was as high as86.24%.At the level of transcription and metabolism，com-pared with self-pollination，there were444and3646differential expressed genes（DEGs）and427and412differentialme-tabolites（DEMs）on the13and18d after pollination.In the comparison of the same pollination methods，there were3305DEGs and457DEMs on the13d after self-pollination compared with the18#d after self-polination.There were1123DEGs and420DEMs in inter-species pollination.The results of real-time fluorescence quantitative PCR showed the same trend as the transcriptome data，indicating that the transcriptome data analysis results were relatively accurate.In the joint analysis ofDEGs and DEMs in each comparison group，a total of162KEGG metabolic pathways were enriched in at least one comparison group，of which48were enriched in each comparison group.Metabolic pathways such as planthor-mone signal transduction，linoleic acid metabolism，ABC transporters，and phenylpropanoid biosynthesis were likely to be involved in regulating the abscission of fruitlets after self-pollination of A.trifoliata ssp.australis.【Conclusion】BMTGKANI belongs to late self-incompatibility plant，its fruitlets of A.trifoliata ssp.australis will ll fall off within13-18d after self-pollination，and regulated by pathways of plant hormone signal transduction，linoleic acid metabolism，ABC transporters，phenylpropanoid biosynthesis.It is suggested that at least two varieties of A.trifoliata ssp.anstralis with similar flowering period should be selected for interlaced cross planting to improve fruit seting rate.

Key words：Akebia trifoliatassp.australis;self-pollination;fruitlet abscission;transcriptome;metabolome

Foundation items：National Key Research and Development Program of China（2021YFD1601002）;Guizhou Scien-ceand Technology Plan Project（QKHPTRC[2020]2101）

0引言

【研究意義】白木通（Akebia trifoliata ssp.austra-lis）是木通科（Lardizabalaceae）木通屬（Akebia）多年生木質(zhì)藤本植物，具有一定的觀賞價(jià)值，在歐洲一些國(guó)家常作為觀賞植物種植，其果實(shí)具有較高的藥用價(jià)值，可加工成為中藥材預(yù)知子（中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，2001;Liet al.，2010;國(guó)家藥典委員會(huì)，2020;Maciag et al.，2021）。隨著市場(chǎng)對(duì)白木通果實(shí)的需求和相關(guān)研究的推進(jìn)，白木通已在廣西、貴州、四川、湖南等地進(jìn)行人工種植，但野生狀態(tài)下木通屬植物的坐果率較低，通過(guò)人工異花授粉可大副提高其坐果率（熊大勝，1996;Zou et al.，2022）。目前對(duì)白木通自花授粉的親和性、自花授粉后影響白木通幼果脫落的關(guān)鍵原因以及自花授粉后白木通幼果中的轉(zhuǎn)錄和代謝活動(dòng)變化情況均尚不明確，使得白木通無(wú)論是在良種繁育還是在高產(chǎn)栽培上的科學(xué)實(shí)踐較困難，也是導(dǎo)致目前栽培上品種混亂的原因之一。因此，研究白木通自花授粉后幼果脫落機(jī)制對(duì)了解其育性和開(kāi)發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】花器官發(fā)育不良和受精不良均會(huì)導(dǎo)致幼果脫落，受精不良主要指自交不親和（Mesejo et al.，2014;Garner and Lovatt，2016;Zhao et al.，2020）。自交不親和現(xiàn)象是開(kāi)花植物在遺傳演化中為了阻止自花受精演變而來(lái)的一種精確的遺傳機(jī)制，可分為孢子體自交不親和、配子體自交不親和及晚期自交不親和三大類（Franklin-Tong and Franklin，2003;Goldberg et al.，2010;Waligórski and Szaleniec，2010;Zhou et al.，2020）。在晚期自交不親和植物中，自花授粉后花粉與柱頭能成功識(shí)別，且花粉管在花柱中能成功生長(zhǎng)，胚珠抑制發(fā)生在合子前或合子后（Gibbs，2014）。胚珠抑制發(fā)生后進(jìn)一步引發(fā)幼果脫落。晚期自交不親和為植物的遺傳進(jìn)化提供幫助，但該遺傳機(jī)制會(huì)導(dǎo)致幼果大量脫落而降低坐果率，成為生產(chǎn)上制約作物產(chǎn)量的關(guān)鍵因素（Tatari et al.，2018）。在細(xì)胞學(xué)水平上，植物器官的脫落區(qū)細(xì)胞分化后獲得在脫落過(guò)程中響應(yīng)環(huán)境刺激和生長(zhǎng)發(fā)育信號(hào)的能力，受到脫落信號(hào)刺激時(shí)脫落區(qū)的細(xì)胞降解形成離層（Shi et al.，2023）。在授粉失敗、幼果受脅迫或果實(shí)成熟時(shí)，脫落區(qū)的附著能力就會(huì)減弱致使果實(shí)或幼果脫落（Nakano et al.，2013;Ito and Nakano，2015）。隨著現(xiàn)代組學(xué)技術(shù)發(fā)展，植物自花授粉后幼果脫落在轉(zhuǎn)錄水平和代謝水平上的調(diào)控機(jī)制逐步被揭示。有研究表明，植物激素在調(diào)控幼果脫落中發(fā)揮著重要作用，如乙烯、生長(zhǎng)素、脫落酸、赤霉素等激素相互協(xié)調(diào)作用促進(jìn)或延緩幼果脫落（Mahouachi et al.，2009;Nakano et al.，2014;Pathar-kar and Walker，2017;Mornya and Cheng，2018）。此外，亞油酸代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和苯丙烷生物合成等通路常在脫落幼果的轉(zhuǎn)錄組和代謝組富集分析中出現(xiàn)（Rees et al.，2009;Zhou et al.，2020;Qiu et al.，2021）。因此，這些通路在幼果脫落調(diào)控中發(fā)揮主要作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于白木通的研究主要集中在藥理和資源開(kāi)發(fā)，對(duì)其繁育特性研究較少，尤其是自花授粉后在細(xì)胞、轉(zhuǎn)錄和代謝層次的幼果脫落機(jī)制研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)人工授粉技術(shù)進(jìn)行白木通栽培種BMTGKAN1自花授粉和栽培種間授粉，利用苯胺藍(lán)染色法分析授粉后花粉管的萌發(fā)情況，石蠟切片技術(shù)觀察授粉后胚珠發(fā)育情況，統(tǒng)計(jì)各授粉處理的幼果留存率，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析授粉后幼果脫落機(jī)制，以期為白木通的良種繁育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料來(lái)源于貴州省開(kāi)陽(yáng)縣南江鄉(xiāng)的2個(gè)白木通栽培種BMTGKAN1和BMTGKAN2，經(jīng)貴州大學(xué)植物鑒定中心鑒定為白木通Akebia trifoliata（Thunb）Koidz.ssp.australis（Diels）Rehd。供試材料株齡5年，株行距1.5m×1.5m。選擇長(zhǎng)勢(shì)、分支數(shù)和開(kāi)花量相當(dāng)?shù)闹仓曜鳛樵囼?yàn)植株。主要試劑：氯仿購(gòu)自重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；石蠟、番紅和固綠購(gòu)自北京索菜寶科技有限公司；透明液購(gòu)自南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司；RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；乙醇、冰醋酸、甲醇（純度≥99.0%）、2-氯-L-苯丙氨酸（內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）（純度98%）、乙腈（純度≥99.9%）、甲酸（LC-MS grade）和甲酸銨（純度≥99.9%）購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；Bio-marker One Step SYBR Green RT-qPCR Kit試劑盒和無(wú)核酸酶水購(gòu)自北京百邁客生物科技有限公司。主要儀器設(shè)備：BX61正置熒光相差顯微鏡（Olympus，日本）、LeiCA RM2016病理切片機(jī)[徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司]、Pannoramic MIDI高分辨玻片掃描系統(tǒng)（上海乾思生物科技有限公司）、Nano-Drop2000/2000c超微量紫外分光光度計(jì)（Thermo-Fisher，美國(guó)）、DYY-6C電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、GelDoc2000凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)）、NovaSeq6000測(cè)序儀（IIlumina，美國(guó)）、Vanquish液相色譜儀（ThermoFisher，美國(guó)）、ACQUITYUPLCHSST3色譜柱（2.1mm×150mm，1.8μm）（Waters，美國(guó)）、Q Exactive HF-X質(zhì)譜儀（ThermoFisher，美國(guó)）、SB-5200DT超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）、QL-866混勻儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）和qTower2.2型熒光定量PCR（Analy-tik Jena，德國(guó)）

1.2樣品處理及采集

試驗(yàn)共設(shè)2個(gè)處理，即栽培種間授粉（IP）和自花授粉（SP）（表1）。在雄花散粉前2d將雄蕊剪除，并將幼果套袋，散粉時(shí)于9：00—11：00進(jìn)行授粉，授粉后繼續(xù)套袋直至花期結(jié)束取下。在授粉后第13和18d每處理分別選取9株白木通植株，每3株4～6個(gè)幼果作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用IP1和IP2分別代表栽培種間授粉第13和18d樣品，SP1和SP2分別代表自花授粉第13和18d樣品。取樣后置于液氮中速凍，使用干冰轉(zhuǎn)運(yùn)至蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和代謝組相關(guān)檢測(cè)。幼果留存率統(tǒng)計(jì)方法：幼果留存率（%）=現(xiàn)存幼果數(shù)/幼果總數(shù)×100。

1.3苯胺藍(lán)染色方法

將采集的幼果用卡諾固定液（60%乙醇：30%氯仿：10%冰醋酸）固定24h后轉(zhuǎn)移至70%的酒精保存?zhèn)溆?。?mol/L的NaOH于65℃水浴軟化處理15～30min，再用0.1%苯胺藍(lán)溶液（苯胺藍(lán)0.05g，磷酸氫二鉀0.871g，雙蒸水50mL）染色。壓片后于正置熒光相差顯微鏡下觀測(cè)。

1.4石蠟切片方法

將SP和IP處理后6和18d的BMTGKAN1幼果用卡諾固定液（60%乙醇：30%氯仿：10%冰醋酸）固定24h后轉(zhuǎn)移至70%的酒精保存?zhèn)溆谩⒃囼?yàn)材料依次用75%、85%、95%、100%和100%乙醇梯度脫水。經(jīng)透明液透明后，依次經(jīng)過(guò)透明液和石蠟混合液（1：1）、純石蠟中進(jìn)行滲蠟，滲蠟溫度65℃。然后將蠟塊于石蠟切片機(jī)中切片，切片厚度為8μm。將切片經(jīng)過(guò)酒精和透明液脫蠟后用番紅—固綠染色。將染色后載玻片于高分辨玻片掃描系統(tǒng)掃描后觀測(cè)。

1.5轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析

使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取樣品總RNA，并用NanoDrop2000/2000c超微量紫外分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品質(zhì)量。合格樣品經(jīng)過(guò)RNA抽提、純化、建庫(kù)之后，使用NovaSeq6000測(cè)序儀對(duì)文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序。

過(guò)濾原始下機(jī)數(shù)據(jù)[NGDC數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//ngdc.cncb.ac.cn/），Bioproject為PRJCA012651]，去除平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于Q20的Reads，Cutadapt去除3'端帶接頭的序列，得到Clean data。使用HISAT2v2.0.5將配對(duì)末端Clean reads與白木通參照基因組（Biopro-ject為PRJCA012651）比對(duì)。使用FeatureCounts比對(duì)到每一條基因上Read Count值，采用TPM（每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的Transcripts）進(jìn)行表達(dá)定量標(biāo)準(zhǔn)化，使用DESeq2進(jìn)行表達(dá)分析，篩選出|log?Fold Change|gt;1且Plt;0.05的差異表達(dá)基因（DEGs）。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

挑選參與自花授粉后白木通幼果脫落代謝通路的關(guān)鍵基因，對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，遵照實(shí)時(shí)熒光定量PCR的最小公開(kāi)信息（Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments，MIQE）指南進(jìn)行試驗(yàn)。使用Primer3Input（https：/primer3.ut.ee/）設(shè)計(jì)定量引物（表2），選用ACT7作為內(nèi)參基因（Vashisth et al.，2011）。所有基因引物序列由通用生物（安徽）股份有限公司合成。采用qTower2.2型熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)3次重復(fù)。反應(yīng)體系參照Bio-marker One Step SYBR Green RT-qPCR Kit說(shuō)明書(shū)配制。擴(kuò)增程序：42℃5min，95℃60s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；95℃5s，47℃32s。采用2-AAQ法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，使用Rv4.3.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7代謝物檢測(cè)及分析

使用甲醇（含2-氯-L-苯丙氨酸）提取樣品，采用Vanquish液相色譜儀進(jìn)行色譜檢測(cè)[ACQUITYUPLCHSST3色譜柱（2.1mm×150.0mm，1.8μm），流速0.25mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量2μL]，色譜條件參照Z(yǔ)elena等（2009）的方法。使用QExactiveHF-X質(zhì)譜檢測(cè)器、電噴霧離子源（ESI）及正負(fù)離子模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，質(zhì)譜條件參照Want等（2013）的方法。

使用ProteoWizard對(duì)原始下機(jī)數(shù)據(jù)[NGDC數(shù)據(jù)庫(kù)（https：/ngdc.cncb.ac.cn/），Bioproject為PRJCA012651]進(jìn)行處理，使用R XCMS并設(shè)定bw=2，ppm=15，peakwidth=c（5，30），mzwid=0.015，mzdiff=-0.01，method='centWave'對(duì)峰進(jìn)行檢測(cè)、對(duì)齊、過(guò)濾處理。設(shè)定ppmlt;30，在HMDB、MassBank、LipidMaps、mzCloud、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)及蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司自建物質(zhì)庫(kù)中進(jìn)行物質(zhì)鑒定，并過(guò)濾掉QC樣本中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）gt;30%的物質(zhì)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)計(jì)算P值、OPLS-DA降維方法計(jì)算變量投影重要度（VIP）和差異倍數(shù)（Fold Change），輔助篩選標(biāo)志代謝物，當(dāng)Plt;0.05和VIPgt;1時(shí)，判定代謝物具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用MetaboAnalyst對(duì)篩選差異代謝分子進(jìn)行功能通路富集。

2結(jié)果與分析

2.1授粉后花粉萌發(fā)和胚珠發(fā)育情況

SP組第13d的幼果留存率為21.62%，第18d為5.92%;IP組第13d的幼果留存率為98.72%，第18d為86.24%（圖1-A）。幼果內(nèi)花粉管生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，SP與IP組的花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)情況相似，均表現(xiàn)為授粉后3h萌發(fā)，12h聚集成簇向子房?jī)?nèi)生長(zhǎng)（圖2-B～圖2-G）。通過(guò)石蠟切片技術(shù)對(duì)授粉后胚珠進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IP組授粉后6h的胚珠極核附近被染紅面積較大，發(fā)生了核融合，而SP組的胚珠面積較小，未發(fā)生核融合，此后并未觀察到核融合現(xiàn)象（圖2-H和圖2-I）。授粉后18d，IP組的胚珠發(fā)育出胚乳和胚；而SP組的胚珠內(nèi)外珠被分離，未出現(xiàn)胚乳和胚，且中央細(xì)胞極核消失，表現(xiàn)出非正常雙子葉植物種子形成的特征（圖2-J和圖2-K）。綜上所述，SP和IP處理后花粉對(duì)白木通柱頭均具有親和性，均能產(chǎn)生正常生長(zhǎng)的花粉管，但SP組的胚珠卻不能成功受精致使種子不能正常發(fā)育，表現(xiàn)為在授粉后第13和18d，IP組的幼果留存率均遠(yuǎn)高于SP處理，最終SP處理的柱頭全部脫落，表明在BMTGKAN1中存在晚期自交不親和。

2.2轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果

去除在IP1 vs IP2與SP1vs SP2對(duì)比組中表達(dá)趨勢(shì)相同的DEGs，將其余4632個(gè)DEGs可分為四大類群（圖3），第I和第Ⅲ類DEGs在各樣本間表達(dá)情況差異最大，推測(cè)其與BMTGKAN1自花授粉導(dǎo)致

幼果脫落生理調(diào)控密切相關(guān)。使用皮爾遜相關(guān)系數(shù)表示樣品間基因的表達(dá)水平相關(guān)性，結(jié)果如圖4所示。相同生物學(xué)重復(fù)間具有極強(qiáng)線性相關(guān)性；授粉后13d SP與IP兩組相關(guān)性較高，授粉后第18d SP與IP組相關(guān)性較低，授粉后第13和18d2個(gè)時(shí)期相關(guān)性較低。同時(shí)，聚類結(jié)果表明SP2的轉(zhuǎn)錄情況異于SP1、IP1和IP2。

從SP與IP組授粉后第13d轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中共鑒定到444個(gè)DEGs，其中有127個(gè)下調(diào)表達(dá)，有317個(gè)上調(diào)表達(dá)；授粉后第18d轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共鑒定到3646個(gè)DEGs，其中2062個(gè)下調(diào)表達(dá)，1584個(gè)上調(diào)表達(dá)。從IP組授粉后第13和18d轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中共鑒定到DEGs有1123個(gè)，其中有493個(gè)上調(diào)表達(dá)，有630個(gè)下調(diào)表達(dá)；從SP組授粉后第13～18d轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中共鑒定到3305個(gè)DEGs，其中1247個(gè)上調(diào)表達(dá)，2058個(gè)下調(diào)表達(dá)（圖5），表明授粉后第18d時(shí)SP組基因表達(dá)與IP組存在明顯差異。SP組授粉后第13和18d，在所有分組中共有的DEGs為51個(gè)；在相同時(shí)期不同處理間共有的DEGs為220個(gè)，授粉后第13d IP組與SP組特有的DEGs為196個(gè)，授粉后第18d IP組與SP組特有的DEGs為3397個(gè)；在不同時(shí)期相同處理中，授粉后第13和18d時(shí)共有的DEGs為567個(gè)，特有的DEGs在SP組和IP組中分別為2739和557個(gè)（圖6）。

綜上所述，從對(duì)比組DEGs數(shù)量來(lái)看，授粉后第13d的DEGs數(shù)目遠(yuǎn)少于授粉后第18d，IP組的DEGs基因數(shù)目遠(yuǎn)少于SP組。這可能是在授粉后第13和18d時(shí)，SP組生理活動(dòng)與IP組存在較大差異的原因，該結(jié)果與幼果在13～18d內(nèi)出現(xiàn)大量脫落的現(xiàn)象保持一致，表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)和取樣合理。

2.3代謝組分析結(jié)果

為揭示白木通自花授粉后幼果脫落機(jī)制，使用非靶向代謝技術(shù)鑒定了所有樣本中初生代謝物和次生代謝物。代謝模式相似的代謝物具有相似的功能，或共同參與同一代謝過(guò)程或細(xì)胞通路。本研究檢測(cè)到二級(jí)代謝物可聚類為三大類，其中第Ⅲ的表達(dá)量最高但在樣本間變化較少，第I和第Ⅱ類則相反（圖7）。由圖8可知，代謝檢測(cè)樣本在第一主成分（PC1）上表現(xiàn)出組內(nèi)樣本聚集，組間樣本分散，表明分析結(jié)果較可靠。本研究共檢測(cè)到958種代謝物（MS/MS），其中110種羧酸及其衍生物（Carboxylic acids and derivatives）、89種苯及其取代衍生物（Ben-zene and substituted derivatives）、75種脂肪?；‵atty acyls）、61種有機(jī)氧化合物（Organooxygen com-pounds）、48種甾體及其衍生物（Steroids and steroid derivatives）、42種異戊醇脂質(zhì)（Prenol lipids）、28種黃酮類（Flavonoids）、19種有機(jī)氧化物（Organic oxides）、18種氮雜環(huán)化合物（Azacyclic compounds）、18種酚類（Phenols）和其他類453種（圖9）。

IP與SP組在授粉后第13d時(shí)共有427種差異代謝物（DEMs），其中235種上調(diào)，192種下調(diào)；在授粉后第18d時(shí)，共有412種DEMs，其中166種上調(diào)，246種下調(diào)；IP組授粉后第13和18d間共有420種DEMs，其中254種上調(diào)，166種下調(diào)；SP組授粉后第13和18d間共有DEMs457種，其中221種上調(diào)，236種下調(diào)（圖10）?？傮w來(lái)說(shuō)，各對(duì)比組中DEMs數(shù)目保持在同一水平。

2.4木通幼果脫落相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)可靠性，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中選取9個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白代謝通路和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因（KEGG基因編號(hào)見(jiàn)表2）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，其中ABCBI、ABCC10和ABCC4屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白代謝通路調(diào)控基因；ARF18、AUX22、AUX28、GH3.11、GH3.6和IAA12屬于激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝通路調(diào)控基因，ACT7作為內(nèi)參基因。由圖11可知，9個(gè)基因在不同時(shí)期和處理轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果變化趨勢(shì)基本一致，證明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確。

對(duì)篩選出的DEGs和DEMs進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，結(jié)果顯示SP與IP組相同時(shí)期和不同時(shí)期DEGs共9010個(gè)，被富集到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的新陳代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic informa-tion processing）、環(huán)境信息處理（Environmental infor-mation processing）、細(xì)胞過(guò)程（Cellular processes）和生物系統(tǒng)（Organismal systems）5個(gè)分支（圖12-A）。對(duì)代謝組檢測(cè)到各對(duì)比組中DEMs進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，并挑選差異顯著性排名前10的通路進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在SP1vs SP2對(duì)比組中富集到植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Plant hormone signal trans-duction）、苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosyn-thesis）等通路，IP1vs SP1和IP1vs IP2對(duì)比組中均富集到苯丙烷生物合成和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC transporters）等通路（圖12-B）。SP和IP組在不同時(shí)期差異主要是由授粉時(shí)間不同導(dǎo)致，相同時(shí)期差異主要是授粉方式不同所導(dǎo)致。

為進(jìn)一步了解由白木通自花授粉引起幼果內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和代謝變化機(jī)制，本研究將同一個(gè)比較組的DEGs和DEMs進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示有162條通路在轉(zhuǎn)錄組和代謝組中均被富集到，其中在4個(gè)比較組中均被富集到的代謝通路有48條（圖13）。結(jié)合Rees等（2009）、Zhou等（2020）、Qiu等（2021）和Shi等（2023）的研究報(bào)道進(jìn)行分析，篩選出4條與自花授粉導(dǎo)致幼果脫落反應(yīng)密切相關(guān)代謝通路，依次為植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、亞油酸代謝通路、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporter pro-teins，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）通路和苯丙烷生物合成通路，其中富集到植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的5種植物激素和77個(gè)相關(guān)基因，富集到苯丙烷生物合成通路中的19種代謝物和19個(gè)相關(guān)基因；富集到ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路中的30種代謝物和12個(gè)相關(guān)基因。在亞油酸代謝途徑中共檢測(cè)到7種代謝物和8個(gè)相關(guān)基因（圖14）。

在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，赤霉素A4（Gib-berellinA4）、（S）-脫落酸[（S）-abscisic acid]、順式玉米素（Cis-zeatin）、茉莉酸（Jasmonic acid）和水楊酸（Salicylic acid）5種植物激素參與調(diào)控白木通幼果脫落。在授粉后第13d至第18d過(guò)程中，除順式玉米素在IP1vs IP2對(duì)比組中相對(duì)表達(dá)量上調(diào)外，其余4種植物激素在SP1vs SP2和IP1vs IP2對(duì)比組中均下調(diào)。但在IP1vs SP1和IP2vs SP2對(duì)比組中表達(dá)趨勢(shì)出現(xiàn)差異，具體表現(xiàn)為水楊酸和赤霉素A4上調(diào)，但水楊酸不是DEM;順式玉米素下調(diào)；茉莉酸和（S）—脫落酸在IP1vs SP1對(duì)比組中上調(diào)，在IP2vs SP2對(duì)比組中下調(diào)。乙烯響應(yīng)因子基因（ERFIB）在所有對(duì)比組中均上調(diào)表達(dá)，SP組的ERFIB基因表達(dá)量較IP組顯著上調(diào)。乙烯受體基因（ETR1、ETR2、CTRI、EIN2和EIN3）在SPI vs SP2對(duì)比組中均表達(dá)上調(diào)，在IP1vs IP2和IP1vs SP1對(duì)比組中均不是DEGs，但均上調(diào)表達(dá)，在IP2vs SP2對(duì)比組中除ETR2不是DEG外均上調(diào)表達(dá)。富集到生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路的DEGs共37個(gè)，分別為ARF家族成員5個(gè)、GH3家族成員5個(gè)、AUX/IAA家族成員10個(gè)、AUX/LAXs家族成員2個(gè)、SAUR家族成員13個(gè)、TIR1和AFB2。其中，GH3家族5個(gè)DEGs雖然同屬一個(gè)家族，但在各對(duì)比組中表達(dá)趨勢(shì)各不相同，LAX家族成員LAX5與LAX2基因表達(dá)模式相反。茉莉酸調(diào)控基因TIFY9在SP1vs SP2對(duì)比組中下調(diào)表達(dá)，在其他對(duì)比組中差異不明顯。脫落酸調(diào)控基因AFB2在SP1vs SP2對(duì)比組中上調(diào)表達(dá)，在IP1vs IP2處理中表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，但AFB2基因在該對(duì)比組中差異未達(dá)到顯著水平（Pgt;0.05，下同）（圖15）。

亞油酸代謝途徑調(diào)控基因LOX5、LOX1.5和SDPI在IP2vs SP2和SP1vs SP2對(duì)比組中顯著上調(diào)表達(dá)，其他對(duì)比組中則差異不顯著;代謝物9-OxoODE、9，12，13-TriHOME和13-OxoODE在IP1vs IP2和SP1vs SP2對(duì)比組呈顯著上調(diào)，IP1vs SP1和IP2vs SP2對(duì)比組中顯著下調(diào)，而13S-hydroxyoctadecadienoicacid則相反（圖16-A）。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑7個(gè)功能模塊共涉及30個(gè)代謝物，寡糖、多元醇和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白模塊代謝物最多，共16個(gè)。磷酸鹽和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白模塊共有7個(gè)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑涉及4個(gè)亞族12個(gè)基因，分別為ABCB（6個(gè)）、ABCC（4個(gè)）、ABCC10（1個(gè)）和ABCG2（1個(gè)）（圖16-B）。從苯丙烷生物合成途徑中篩選到最多的基因是編碼過(guò)氧化物酶的基因，共19個(gè)，PER家族基因有15個(gè)（圖16-C）。

3討論

3.1晚期自交不親和或早期近交衰退導(dǎo)致白木通自花授粉后幼果脫落

白木通在自花授粉后幼果約在1周內(nèi)表現(xiàn)同栽培種間授粉，而且自花授粉和栽培種間授粉的花粉管萌發(fā)現(xiàn)象一致，但在授粉后第13～18d時(shí)幼果大量脫落。本研究發(fā)現(xiàn)，IP組胚珠在授粉后6h發(fā)生核融合，SP組則無(wú)該現(xiàn)象，授粉后18d IP組胚珠發(fā)育出胚乳和胚，而SP組胚珠未發(fā)育出胚乳和胚，并出現(xiàn)內(nèi)外珠被分離。晚期自交不親和的植物花粉能正常萌發(fā)，甚至到達(dá)胚珠、穿透胚珠或形成合子（Gibbs，2014）?；谏鲜霈F(xiàn)象，推測(cè)BMTGKAN1屬于自交不親和型。在前一周內(nèi)SP組幼果的表現(xiàn)與IP組一致，其原因可能是受到花粉刺激使幼果開(kāi)始發(fā)育，但由于胚珠不能受精，進(jìn)而不能正常發(fā)育，最終導(dǎo)致幼果脫落。

3.2植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與調(diào)控白木通自花授粉后幼果脫落

乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在植物器官脫落中具有不可替代的作用（Shi et al.，2023）。ERF1B是乙烯響應(yīng)因子（ERFs）家族成員。本研究檢測(cè)到ERFIB基因在所有對(duì)比組中表達(dá)上調(diào)，SP組的ERFIB基因表達(dá)較IP組顯著上調(diào)。前人研究也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)芐基氨基嘌呤（BA）處理的蘋果脫落的幼果中，乙烯受體ETR1和ETR2表達(dá)上調(diào)（Eccher et al.，2015）;經(jīng)乙烯誘導(dǎo)后芒果MiERF3和MiERF113基因在幼果中顯著上調(diào)，引起芒果脫落，且乙烯下游信號(hào)調(diào)控基因CTR1和EIN3在脫落區(qū)顯著上調(diào)表達(dá)（Rai et al.，2021）?？梢?jiàn)，乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在蘋果和芒果幼果脫落中具有重要作用。本研究中ETR1、ETR2、CTRI、EIN2和EIN3基因在SP1vs SP2對(duì)比組中均上調(diào)表達(dá)，在IP1vs IP2和IP1vs SP1對(duì)比組中均不是DEGs，但表現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)；在IP2vs SP2對(duì)比組中除ETR2基因不是DEG外，其余均為DEGs，表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，與上述前人研究結(jié)果基本一致，推測(cè)該轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與調(diào)控BMTGKAN1種間授粉后幼果脫落。生長(zhǎng)素參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育，包括植物器官的衰老和脫落（Pathar-kar and Walker，2017）。本研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中大量有關(guān)生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄本被檢測(cè)到，其中，LAX5與LAX2基因表達(dá)模式剛好相反，再次驗(yàn)證了生長(zhǎng)素內(nèi)流載體家族成員在果實(shí)脫落中發(fā)揮不同作用的結(jié)論（Denisov et al.，2017）。本研究共檢測(cè)GH3家族的DEGs共有5個(gè)，該家族成員很可能介導(dǎo)花和果的脫落（Cheng et al.，2015）。生長(zhǎng)素信號(hào)通路負(fù)抑制因子（AUX/IAAs）、生長(zhǎng)素響應(yīng)因子（ARFs和SAURs）在生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中至關(guān)重要（Shi et al.，2023）。本研究發(fā)現(xiàn)，富集到生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)途徑的DEGs共37個(gè)，包含ARF、GH3、AUX/IAA、AUX/LAX、SAUR、TIR1等家族基因。其中AUX/IAA、GH3、SAUR、ARF等家族基因與荔枝（Litchi chinen-sis）幼果脫落相關(guān)（Kuang et al.，2012）。本研究從BMTGKAN1SP和IP組幼果中檢測(cè)到許多與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的DEGs，推測(cè)該途徑參與調(diào)控白木通幼果脫落。綜上所述，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑極有可能參與白木通自花授粉后幼果脫落，尤其是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。白木通自花授粉后幼果脫落的調(diào)控是復(fù)雜的，具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還有待深入研究。

3.3白木通自花授粉后幼果脫落的相關(guān)代謝途徑分析

本研究中除植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路外，亞油酸代謝通路、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路和苯丙烷生物合成通路在IP1vs SP1、IP2vs SP2、SPI vs SP2對(duì)比組中存在明顯差異，推測(cè)這3個(gè)通路與BMTGKAN1幼果的脫落緊密相關(guān)。前人研究發(fā)現(xiàn)，亞油酸代謝途徑與小麥雄性育性、玉米灌漿有關(guān)，而胚敗育往往會(huì)導(dǎo)致果實(shí)脫落（Malik et al.，2003;Yu et al.，2023;Zhang et al.，2023）。本研究LOX5、LOX?.5和SDP1基因在IP2vs SP2和SP1vs SP2對(duì)比組中顯著上調(diào)表達(dá)，其他對(duì)比組中差異不顯著;代謝物9-OxoODE、9，12，13-TriHOME和13-OxoODE在IP1vs IP2和SP1vs SP2對(duì)比組表達(dá)上調(diào)，而13S-hydroxyoctadecadienoic acid則相反，且BMTGKAN1SP組胚珠同樣表現(xiàn)出敗育特征，即在自花授粉后18d出現(xiàn)內(nèi)外珠被分離的現(xiàn)象。本研究中檢測(cè)到較多ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路的基因和代謝物，如ABCC10、ABCG5、L-Lysine和Nopa-line等。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路主要負(fù)責(zé)利用ATP水解產(chǎn)生能量將底物逆濃度梯度跨膜運(yùn)輸，該通路與油茶晚期自交不親和相關(guān)（Rees et al.，2009;Zhou et al.，2020）。還有研究發(fā)現(xiàn)，糖、多胺和多肽與植物落花落果相關(guān)，而已鑒定的ABCB亞族成員中大多與激素（生長(zhǎng)素）調(diào)控和運(yùn)輸密切相關(guān)，ABCC亞族成員具有轉(zhuǎn)運(yùn)代謝物功能（Francisco et al.，2013;Oforiet al.，2018;Shi et al.，2023）。據(jù)此推測(cè)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同調(diào)控BMTGKAN1自花授粉后幼果脫落。研究表明，苯丙烷生物合成代謝通路與細(xì)胞木質(zhì)化有關(guān)，可促進(jìn)細(xì)胞分離過(guò)程中的機(jī)械性細(xì)胞壁斷裂（Liljegren et al.，2000）。此外，Qiu等（2021）在甜櫻桃（Prunus avium）脫落的幼果中也富集到了該通路。本研究在該途徑中篩選到最多的基因是編碼過(guò)氧化物酶的基因，共19個(gè)，PER家族基因有15個(gè)。綜上所述，亞油酸代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、苯丙烷生物合成同樣極有可能參與白木通自花授粉后幼果脫落，其具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。此外，BMTGKAN1由自花授粉引起的幼果脫落是一個(gè)高度程序化且較為復(fù)雜的生理過(guò)程，自花授粉后受精障礙有待進(jìn)一步研究。植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、亞油酸代謝、苯丙烷的生物合成及其他代謝通路協(xié)同調(diào)控白木通幼果脫落的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還需進(jìn)一步探究。

4結(jié)論

BMTGKAN1屬于晚期自交不親和植物，其自花授粉后13～18d大量脫落幼果，受其體內(nèi)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、亞油酸代謝通路、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路和苯丙烷生物合成通路調(diào)控，在種植實(shí)踐中選擇2個(gè)及以上花期相近的白木通栽培品種隔行交叉種植以提高坐果率。

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（責(zé)任編輯 陳燕）