叉枝蒿對粘蟲殺蟲活性成分及作用機制研究

摘要：【目的】探究叉枝蒿對粘蟲的殺蟲活性及殺蟲機制，為粘蟲的高效綠色防控提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎媒x浸葉法測定10種蒿屬植物提取物及叉枝蒿不同極性4部分萃取物對粘蟲3齡幼蟲的殺蟲活性；分別采用小葉碟添加法、浸葉法和浸蟲法確定叉枝蒿石油醚萃取物對粘蟲的主要殺蟲方式；通過浸蟲法測定叉枝蒿石油醚萃取物、餾分及主要成分對粘蟲3齡幼蟲的觸殺活性。叉枝蒿石油醚萃取物經(jīng)柱層析分離及氣相色譜—質(zhì)譜分析，確定其活性成分，并測定活性成分對粘蟲體內(nèi)4種酶活力的影響?！窘Y(jié)果】叉枝蒿石油醚萃取物對粘蟲3齡幼蟲的觸殺活性最好，處理第7d時對粘蟲的致死中濃度（LC?）為6.85mg/mL。經(jīng)硅膠柱色譜分離，從叉枝蒿石油醚萃取物中得到21個餾分，其中餾分8表現(xiàn)出最好的觸殺活性；氣相色譜—質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，餾分8的主要化合物為棕櫚酸乙酯（49.57%）、十三烷（14.55%）、硬脂酸乙酯（4.86%）和壬烷（4.74%），4種化合物中以棕櫚酸乙酯的觸殺活性最好，處理后第7d時對粘蟲的LC?為1.82mg/mL。棕櫚酸乙酯LC處理粘蟲第7d時掃描電鏡顯示，粘蟲表皮蠟質(zhì)層顆粒排列疏松，間隙增大。棕櫚酸乙酯LC，處理粘蟲1、3、5和7d時，粘蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶（AChE）和Nat-K*-ATP酶隨時間的推移表現(xiàn)出抑制作用，羧酸酯酶（CarE）表現(xiàn)出先激活后抑制作用，過氧化氫酶（CAT）表現(xiàn)出先抑制后激活作用?！窘Y(jié)論】叉枝蒿對粘蟲具有良好的殺蟲活性。叉枝蒿石油醚萃取物中的棕櫚酸乙酯對粘蟲的觸殺活性最好，可作為粘蟲生物防治的潛力化合物進行開發(fā)利用。

關(guān)鍵詞：叉枝蒿；粘蟲；棕櫚酸乙酯；作用機制

中圖分類號：S433.4文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2024）01-0105-12

Insecticidal activity constituents and mechanism of Artemisia divaricata against Mythimna separata（Walker）

LI Chun-yan'，LIANG Qian1*，ZHAO Wen-xing'，LIANG Zong-suo2，WANG Fang'

（'College of Forestry，Southwest Forestry University，Kunming，Yunnan650224，China;2Shaoxing Academy of Biomedicine，Zhejiang Scienceand Technology University，Shaoxing，Zhejiang312000，China）

Abstract：[Objective]In order to study the insecticidal activity and preliminary insecticidal mechanism of Artemisia divaricata against Mythimna separate（Walker），and provide theoretical basis for efficient and green prevention and con-trolofM.separate.【MethodJTheinsecticidal activitiesof extracts from10species Artemisia plants and four parts extracts with different polarities from A.divaricata against the3°instar larvae of M.separatawere determined by the method of soaking insects and leaves.The main insecticidal methods of the petroleum ether extract of A.divaricata were determined by the leaf disc method，leaf soaking method，and insect soaking method respectively.The contact toxicity of the petro-leum ether extract，fractions，and main compounds of A.divaricata were determined by insect immersion method.The petroleum ether extract ofA.divaricata was separated by column chromatography and analyzed by gas chromatography-mass spectrum to determine its active components，and the four enzyme activities of the active components was deter-mined.[Result]Contact toxicity effect of petroleum ether extract of A.divaricata against the3#instarlarvae of M.separata was the best.The results showed that the lethal medium concentration（LCs）of the petroleum ether extract of A.divaricata on the7d of treatment for the30instar larvae of M.separata was6.85mg/mL.After silica gel column chromatography separation，21fractions were obtained，and fraction8showed the best contact toxicity.According to gas chromatography-mass spectrum，hexadecanoic acid ethyl ester（49.57%），tridecane（14.55%），octadecanoic acid ethyl ester（4.86%）and nonane（4.74%）were the main compounds in fraction8.Hexadecanoic acid ethyl ester had the best contact activity among the four compounds，on the7d of treatment，LCso on M.separata was1.82mg/mL.On the7#d of treatment with hexadecanoic acid ethyl ester LCso，the scanning electron microscopy results showed that the wax layer particles on the surface of M.separata were loosely arranged and the gaps increased.When treated with hexadecanoic acid ethyl ester LCsofor1，3，5and7d，the acetylcholinesterase（AChE）and Na*-K*-ATP of M.separata showed inhibition effect over time，carboxylesterase（CarE）showed activation first and then inhibition，and catalase（CAT）showed inhibition first and then activation.【Conclusion]A.divaricata has fine insecticidal activity against M.separate.Hexadecanoicacid ethyl ester of the petroleum ether extract from A.divaricata has the best contact toxicity and can be developed and utilized as apo-tential compound for biological control of M.separate.

Key words：Artemisia divaricata;Mythimma separate（Walker）;hexadecanoic acid ethyl ester;action mechanism

Foundation items：Zhejiang Science and Technology Plan Project（2022C02023）;Young Talent Project of“Yunnan Revitalization Talent Support Project”（XDYC-QNRC-2022-0226）

0引言

【研究意義】粘蟲[Mythimna separate（Walker）]又名行軍蟲、剃枝蟲，屬鱗翅目夜蛾科昆蟲，也是一種世界性遠距離遷飛性害蟲（江幸福等，2014），幼蟲喜食玉米、小麥和水稻等禾本科糧食作物，我國除新疆地區(qū)未見其為害記錄外，其他地區(qū)均有發(fā)生為害的報道，對我國糧食安全威脅極大。2020年9月，粘蟲被列入一類農(nóng)作物病蟲害名錄（柳凡等，2023）。目前，對粘蟲主要采用化學農(nóng)藥進行防治，粘蟲對蟲螨腈和氯氟氰菊酯（董杰等，2014）、毒死蜱和辛硫磷（Zhao et al.，2018）等殺蟲劑已產(chǎn)生不同程度的抗性，盡管對甲維鹽等（Zhao et al.，2018）農(nóng)藥仍然敏感，但長期反復使用也會導致害蟲產(chǎn)生抗藥性，引起農(nóng)藥殘留、生態(tài)環(huán)境污染、生物多樣性下降、食品安全等熱點問題而受到廣泛關(guān)注（閆碩和沈杰，2019）。植物源農(nóng)藥靶標多樣、害蟲不易產(chǎn)生抗性、選擇性高、易降解、環(huán)境友好且對非靶標生物毒性較?。钚癖龋?023）。因此，篩選和研發(fā)植物源殺蟲劑是解決害蟲抗性的主要途徑。【前人研究進展】目前，對粘蟲殺蟲活性物質(zhì)的研究主要集中在植物源粗提物和合成殺蟲劑研究方面。劉翠茹（2007）研究黑沙蒿（Artemisia ordosica）等16種植物丙酮提取物對3齡粘蟲的觸殺活性，發(fā)現(xiàn)駱駝蓬（Peganum harmala）、原葉牽牛（Pharbitis purpurea）和黑沙蒿的殺蟲活性較好，3種植物丙酮提取物50mg/mL處理后72h時的校正死亡率分別為76.67%、86.67%和80.00%;對黑沙蒿做進一步研究，其石油醚、氯仿、正己烷、乙酸乙酯和丙酮萃取物50mg/mL處理72h時的校正

死亡率分別為50.00%、25.00%、64.29%、89.29%和71.43%。胡冠芳等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，紅蓼（Polygo-num orientale）種子乙酸乙酯萃取物濃度為16.80mg/mL時對粘蟲觸殺活性的校正死亡率為88.89%，好于其莖稈乙酸乙酯萃取物及種子甲醇提取物。田曉霖等（2018）測定了32種植物甲醇提取物在10mg/mL濃度下對粘蟲的觸殺活性，結(jié)果顯示，垂盆草（Sedumsarmentosum）、白及（Bletillastriata）、仙鶴草（Agrimonia pilosa）和硬毛棘豆（Oxytropis hirta）甲醇提取物72h時的校正死亡率分別為68.97%、" 75.87%、82.76%和89.66%。張潔和李雪嬌（2019）研究發(fā)現(xiàn)，五加皮（Acanthopanar gracilistylus）丙酮提取物對粘蟲3齡幼蟲第2和3d時觸殺活性的致死中濃度（LC?）分別為77.52和25.95mg/mL。姚陽意等 （2021）合成了含芳基三氮唑結(jié)構(gòu)的3-乙砜基吡啶類化合物，化合物9c、9g和9h在濃度100mg/L下72h時對粘蟲胃毒活性的校正死亡率均達80%。李晶等""" （2022）研究發(fā)現(xiàn)，藏橐吾（Ligularia rumicifolia）、黃帚橐吾（L.virgaurea）和箭葉橐吾（L.sagitta）3種橐吾屬植物乙醇提取物對粘蟲3齡幼蟲第7d時觸殺活性的LC，分別為3.52、5.84和25.60mg/mL。Chen等（2021）合成了一系列含α-氨基酸的二胺衍生物，含有L-苯基甘氨酸骨架的化合物活性較好，（R）-A6化合物72h時對粘蟲殺蟲活性的LC?為86.8mg/L。陳睿嘉等（2022）合成了21個含環(huán)丙甲酸類二酰胺衍生物，其中化合物10K在500mg/L濃度下處理第" 3d時對粘蟲的校正致死率達100%。Zhu等（2023）以不同氨基酸為氨基取代基合成了69個4-丙基氧基苯磺酰胺衍生物，其中D18、D19和D16在48h時對粘蟲的胃毒活性分別為4.28、2.96和2.38mg/mL。【本研究切入點】植物與有害生物協(xié)同進化過程中會產(chǎn)生許多防御性次生代謝物質(zhì)（尹海辰等，2023），這些活性物質(zhì)可以影響昆蟲的呼吸系統(tǒng)、抑制昆蟲的生長發(fā)育、影響消化系統(tǒng)、神經(jīng)及肌肉系統(tǒng)，對昆蟲具有觸殺、胃毒、拒食、驅(qū)避和抑制生長發(fā)育等多種作用（羅都強和張興，2001）。目前，關(guān)于叉枝蒿（A."""""" divaricata）僅有重金屬吸附積累特性方面的研究（李庚飛和盧愛剛，2012），未見有關(guān)其殺蟲活性成分及作用機制方面的報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過活性跟蹤的方法研究叉枝蒿對粘蟲的殺蟲活性，探究其主要活性成分及對粘蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶（AChE）、Na*-K*-ATP酶、羧酸酯酶（CarE）和過氧化氫酶（CAT）活力的影響，為粘蟲的高效綠色防控提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

10種蒿屬植物材料的種名、拉丁名、采集部位、采集地和采集時間見表1。每種植物均經(jīng)西南林業(yè)大學林學院植物學教研室杜凡教授鑒定。

供試粘蟲蟲卵由河南省濟源白云實業(yè)有限公司提供。飼養(yǎng)條件：溫度26～28℃，相對濕度70%～80%，在光周期L：D=16h：8h的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待卵粒孵化后用新鮮玉米葉飼養(yǎng)至3齡幼蟲供試。

主要儀器設備：RGX-250B人工氣候培養(yǎng)箱（上海坤天實驗儀器有限公司）、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent7890A-5975C，美國Agilent科技有限公司）、OCE-Y30組織研磨器（天根生化科技有限公司）、Thermo-17R高速冷凍離心機（南京以馬內(nèi)利儀器設備有限公司）和Zeiss Gemini300掃描電鏡儀（北京普瑞賽司儀器有限公司）。供試試劑和酶試劑盒：石油醚、乙酸乙酯、甲醇和乙醇（云南利妍科技有限公司）;吐溫80（天津風船化學試劑科技有限公司），壬烷（≥99.5%）、十三烷（≥98%）、棕櫚酸乙酯（≥98%）和硬脂酸乙酯（≥99%）（上海麥克林生化科技股份有限公司）;AChE試劑盒、Na*-K*-ATP酶試劑盒、CarE試劑盒和CAT試劑盒（蘇州格銳思生物科技有限公司）。

1.2試驗方法

1.2.110種蒿屬植物及叉枝蒿石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水萃取物殺蟲活性篩選將10種蒿屬植物樣品陰干粉碎，乙醇提取得提取物。用0.5%吐溫80水溶液將10種蒿屬植物提取物配制成質(zhì)量濃度10mg/mL的溶液。叉枝蒿乙醇提取物加水懸浮，分別用石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取，得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水萃取物。用0.5%吐溫80水溶液將叉枝蒿不同極性的4部分萃取物配成質(zhì)量濃度5mg/mL的溶液。采用浸蟲浸葉法（張潔和李雪嬌，2019）測定10種蒿屬植物提取物及叉枝蒿不同極性4部分萃取物對粘蟲3齡幼蟲的殺蟲活性。將玉米葉剪成長度2.0～3.0cm的葉段，取粘蟲和玉米葉段分別在相應的溶液中浸漬5s，吸取多余藥液，用毛筆將粘蟲分別挑入帶蓋圓柱形塑料盒中，每盒1頭，加入適量浸過藥液的玉米葉，10只為1組，5次重復，觀察第1、3、5和7d時粘蟲的存活情況。以0.5%吐溫80水溶液作陰性對照。用毛筆輕觸蟲體無反應時判斷為死亡。用公式（1）和公式（2）計算粘蟲死亡率及校正死亡率。

死亡率（%）=死亡蟲數(shù)/處理總蟲數(shù)×100（1）

校正死亡率（%）=（處理死亡率-對照死亡率）/（1-對照死亡率）×100（2）

1.2.2叉枝蒿石油醚萃取物對粘蟲主要殺蟲方式的確定

1.2.2.1拒食活性測定采用小葉碟添加法（張潔和李雪嬌，2019）測定拒食活性。將新鮮玉米葉用打孔器打成直徑2.0cm的圓形小葉碟，小葉碟在供試溶液中浸漬5s，取出自然晾干后放入圓形帶蓋塑料盒中，每盒2片，接入1頭饑餓4h的試蟲。配制10.00、5.00、2.50、1.25和0.63mg/mL5個質(zhì)量濃度溶液，每個濃度處理10頭試蟲，5次重復。以印楝素溶液為陽性對照，處理后第1和2d時測定粘蟲的取食面積，用公式（3）計算拒食率，根據(jù)拒食率計算拒食中濃度（AFC50）

拒食率（%）=（對照取食面積-處理取食面積）/對照取食面積×100（3）

1.2.2.2胃毒活性測定采用浸葉法（向立剛等，2022）測定胃毒活性。將新鮮玉米葉片剪成大小合適的葉段，在配制好的溶液中浸漬5s后取出自然晾干，放入圓形帶蓋塑料盒中，每盒2片，接入饑餓4h、蟲態(tài)一致的粘蟲3齡幼蟲1頭。配制40.0、20.0、10.0、5.0和2.5mg/mL5個質(zhì)量濃度溶液，每個濃度處理10頭，5次重復。以除蟲菊酯溶液作陽性對照。分別于處理后第1、3、5和7d時檢查粘蟲的存活情況，用公式（1）和公式（2）計算死亡率及校正死亡率，根據(jù)校正死亡率計算LC50。

1.2.2.3觸殺活性測定采用浸蟲法（雷妍圓等，2021）測定觸殺活性。配制10.00、5.00、2.50、1.25和0.63mg/mL5個質(zhì)量濃度溶液，選取蟲態(tài)一致的粘蟲3齡幼蟲放入不同濃度的溶液中浸泡5s后吸取多余藥液，用毛筆挑入放有新鮮玉米葉片的帶蓋塑料盒中飼養(yǎng)。每盒1頭，每組10頭，5次重復。以除蟲菊酯溶液作陽性對照。分別于處理后第1、3、5和7d時觀察粘蟲的存活情況并記錄，用公式（1）和（2）計算死亡率及校正死亡率，根據(jù)校正死亡率計算LC50。

1.2.3叉枝蒿石油醚萃取物洗脫體系選擇采用薄層層析（TLC）法。選用石油醚、石油醚：氯仿（1：1）、氯仿、氯仿：乙酸乙酯（100：1、20：1、1：1）、乙酸乙酯、乙酸乙酯：甲醇（1：1）和甲醇洗脫體系。

1.2.4柱層析分離將叉枝蒿石油醚萃取物用有機溶劑溶解，按照1：1的比例加入硅膠拌勻，待溶劑揮干備用。采用濕法裝柱，根據(jù)樣品量選擇合適大小的玻璃柱，固定在鐵架臺上，柱底部墊上脫脂棉。稱取一定量硅膠于燒杯中，加入適量石油醚攪拌至無氣泡后加入玻璃柱，待液面達到一定高度時，打開柱子活塞，放出多余石油醚。采用干法上樣，將樣品加入色譜柱，依次用不同極性溶劑系進行洗脫。洗脫液經(jīng)TLC檢測，合并相同餾分，將各餾分減壓濃縮稱重。

1.2.5供試溶液配制叉枝蒿石油醚萃取物、各餾分及其主要化合物均用0.5%吐溫80水溶液配制成不同質(zhì)量濃度的溶液備用。

1.2.6叉枝蒿石油醚萃取物各餾分及主要化合物的觸殺活性測定采用浸蟲法（雷妍圓等，2021），餾分配制成質(zhì)量濃度為5mg/mL的溶液，化合物配制10.000、5.000、2.500、1.250和0.625mg/mL5個質(zhì)量濃度溶液，選取蟲態(tài)一致的粘蟲3齡幼蟲放入不同濃度的溶液中浸泡5s后吸取多余藥液，用毛筆挑入放有新鮮玉米葉的帶蓋塑料盒中飼養(yǎng)。每盒1只，每組10頭，5次重復。處理第1、3、5和7d時觀察粘蟲的存活情況并記錄，用公式（1）和（2）計算死亡率及校正死亡率。分別選取殺蟲活性最好的餾分及其化合物進行后續(xù)研究。

1.2.7餾分的氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析選取殺蟲活性最好的餾分進行GC-MS分析。氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm）;升溫程序，100℃保持2min，以4°C/min升至250℃，保持10min;載氣（He）流速1.2mL/min、進樣口溫度250℃、柱前壓100kPa、進樣量0.2μL;分流比100：1。質(zhì)譜條件：電離方式（EI）離子源；電子能量70eV;氣質(zhì)接口溫度280℃;離子源溫度230℃;四極桿溫度150℃。電子倍增器電壓：1894V。采用wiley7n.1標準譜庫檢索定性。通過面積歸一化法計算各化合物的相對含量。

1.2.8殺蟲活性化合物處理粘蟲掃描電鏡樣品制備分別取對照和殺蟲活性化合物處理第7d的粘蟲，去其首尾，取中間約5mm2左右的粘蟲表皮，用2.5%戊二醛固定液固定樣品，4℃放置過夜，用0.1mol/L pH7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15min;分別用30%、50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液對樣品進行脫水處理，每種濃度處理15min，再用100%乙醇處理2次，每次20min。用乙醇與醋酸異戊酯的混合液（V/V=1/1）處理樣品30min，再用醋酸異戊酯處理樣品，放置過夜。臨界點干燥，噴金，置于掃描電鏡下觀察并拍照。

1.2.9殺蟲活性化合物處理粘蟲后4種酶活力測定

1.2.9.1試蟲處理及酶液制備用殺蟲活性化合物處理第7d的LCs?溶液處理粘蟲3齡幼蟲，處理方法同1.2.6。以0.5%吐溫80水溶液為對照，分別于處理第1、3、5和7d時取粘蟲，液氮研磨后準確稱取0.1g，加入1.0mL提取液，冰浴勻漿1min，4℃下12000r/min離心10min，取上清液，置冰上作為待測酶液。

1.2.9.2AChE活力測定參照AChE試劑盒說明書進行操作。取待測酶液37℃條件下反應30s，紫外可見分光光度計于412nm處讀取吸光值A?5min30s時讀取A?，△A=A?-A。酶活定義：每克樣品每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位。AChE活力按公式（4）計算。

1.2.9.3Na*-K*-ATP酶活力測定參照Na*-K+-ATP酶試劑盒說明書進行操作。取待測酶液室溫靜置3min后使用紫外分光光度計于700nm下讀取各管吸光值A對照和A測定?！鰽=A測定-A對照。酶活定義：每小時每克樣品分解ATP產(chǎn)生1μmol無機磷的量為1個酶活力單位，Na*-K*-ATP酶活力按公式（5）計算。

1.2.9.4CarE活力測定參照CarE試劑盒說明書進行操作。取待測酶液室溫準確反應3min后，紫外分光光度計于450nm處讀取吸光值A對m和A測定，△A=A測定-A對照。酶活定義：每克樣品每分鐘在反應體系中使450nm處吸光值增加1為1個酶活單位。CarE活力按公式（6）計算。

1.2.9.5CAT活力測定參照CAT試劑盒說明書進行操作。取待測酶液室溫25℃反應5min后，紫外分光光度計于510nm處讀取吸光值A空白和A測定，△A=A空泊-A測定。酶活定義：每克組織每分鐘催化分解1μmol H?O?定義為1個活力單位（U）。CAT活力按公式（7）計算。

以上公式中，ε為TNB摩爾消光系數(shù)，13.6×103L/（mol·cm）;d為光徑，1cm;V為提取液體積，1mL;V?為加入上清液體積；V?為反應體系總體積；T為反應時間；W為樣品取樣質(zhì)量（g）;D為稀釋倍數(shù)，若未稀釋則值為1。

1.3統(tǒng)計分析

采用SPSS23.0進行概率分析，計算叉枝蒿餾分及主要化學成分對粘蟲3齡幼蟲的LC?。、95%置信區(qū)間、毒力回歸方程、卡方（x2）及P值。采用SPSS23.0計算酶活力的平均值和標準誤差，采用ANOVA進行差異顯著性方差分析；Origin2021繪圖。

2結(jié)果與分析

2.110種蒿屬植物提取物對粘蟲的校正死亡率

10種蒿屬植物提取物在質(zhì)量濃度10mg/mL時對粘蟲的校正死亡率見表2。由表2可知，處理第1d時，叉枝蒿和豬毛蒿提取物對粘蟲的校正死亡率最高，且與其他8種蒿屬植物提取物處理存在顯著差異（Plt;0.05，下同），處理第3、5和7d時，叉枝蒿提取物對粘蟲的校正死亡率顯著高于其他蒿屬植物提取物，因此，選取叉枝蒿進行后續(xù)研究。

2.2叉枝蒿石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水萃取物對粘蟲的校正死亡率

叉枝蒿石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水萃取物在質(zhì)量濃度5mg/mL時對粘蟲的校正死亡率見表3。由表3可知，叉枝蒿石油醚萃取物處理第1、3、5和7d時對粘蟲的校正死亡率均顯著高于氯仿、乙酸乙酯和水萃取物處理。叉枝蒿石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水萃取物處理均隨著處理時間的延長，粘蟲的校正死亡率增大。

2.3叉枝蒿石油醚萃取物對粘蟲的拒食、胃毒和觸殺活性測定結(jié)果

叉枝蒿石油醚萃取物對粘蟲的拒食、胃毒和觸殺活性見表4。根據(jù)AFC?或LC??與陽性對照的比值可得出叉枝蒿石油醚萃取物的觸殺活性好于拒食活性和胃毒活性。觸殺活性的雙因素方差分析結(jié)果表明，處理濃度對粘蟲的死亡率影響極顯著（F=1207.16，Plt;0.001），處理時間對粘蟲死亡率的影響較小（F=6.59，Plt;0.001）。

2.4叉枝蒿石油醚萃取物各餾分對粘蟲的觸殺活性

叉枝蒿石油醚萃取物各餾分對粘蟲觸殺活性的校正死亡率見表5。由表5可知，在質(zhì)量濃度5mg/mL時21個餾分對粘蟲均有不同程度的觸殺活性，其中餾分8表現(xiàn)出最好的殺蟲活性，處理第1、3、5和7d時的校正死亡率均為100.00%，其余20個餾分的校正死亡率均低于50.00%，因此，選取餾分8進行GC-MS分析。

2.5餾分8的化學成分分析結(jié)果

餾分8的化學成分見表6。由表6可知，從叉枝蒿餾分8中共檢測出12種化合物，其中相對含量大于2.00%的有棕櫚酸乙酯（49.57%）、十三烷（14.55%）、硬脂酸乙酯（4.86%）和壬烷（4.74%），主要成分占總量的73.72%。

2.6餾分8中4種主要化合物的殺蟲活性測定結(jié)果

叉枝蒿餾分8中主要化合物壬烷、十三烷、棕櫚酸乙酯和硬脂酸乙酯對粘蟲的觸殺活性見表7。由表7可知，壬烷、十三烷、棕櫚酸乙酯和硬脂酸乙酯對粘蟲均具有觸殺活性。其中，棕櫚酸乙酯對粘蟲的殺蟲活性最好，雙因素方差分析結(jié)果表明，處理濃度（F=222.41，Plt;0.001）和處理時間（F=125.30，Plt;0.001）均對粘蟲的校正死亡率有較明顯的影響，隨著處理濃度的升高及處理時間的延長，殺蟲效果顯著提高。因此，選取棕櫚酸乙酯進行后續(xù)試驗。

2.7棕櫚酸乙酯LC?處理后粘蟲的掃描電鏡觀察結(jié)果

與空白對照（圖1-A）相比，棕櫚酸乙酯LC?處理后粘蟲表皮蠟質(zhì)層發(fā)生明顯變化，蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu)排列較疏松，蠟花間空隙增大（圖1-B）。

2.8棕櫚酸乙酯對粘蟲4種酶活力的影響

2.8.1棕櫚酸乙酯對粘蟲AChE活力的影響由圖2可知，棕櫚酸乙酯處理粘蟲后不同時間，粘蟲AChE活力均低于同期對照處理，表現(xiàn)為持續(xù)抑制作用。處理1、3、5和7d時對粘蟲的抑制率分別為68.91%、34.40%、41.34%和58.94%，其中處理第1d的AChE活力為最低值，抑制作用最強，隨著時間的延長，AChE活力呈上升趨勢。

2.8.2棕櫚酸乙酯對粘蟲Na*-K*-ATP酶活力的影響由圖3可知，棕櫚酸乙酯處理粘蟲后不同時間，粘蟲Na*-K*-ATP酶活力均顯著低于同期對照，表現(xiàn)為持續(xù)抑制作用；處理1、3、5和7d時對粘蟲的抑制率分別為43.80%、11.33%、74.04%和74.35%，其中處理第5d的Na+-K*-ATP酶活力達最低值；與同期對照相比，處理第7d時對粘蟲的抑制作用最強。隨著時間的延長，Na*-K*-ATP酶活力呈先上升后下降再上升的變化趨勢。棕櫚酸乙酯對粘蟲體內(nèi)的Nat-K+-ATP酶活力主要表現(xiàn)為抑制作用。

2.8.3棕櫚酸乙酯對粘蟲CarE活力的影響由圖4可知，棕櫚酸乙酯處理粘蟲第1和3d時，CarE活力均顯著高于同期對照，表現(xiàn)為激活作用，激活率分別為179.57%和175.00%;處理第3d時CarE活力為對照的2.80倍；處理第5和7d時，CarE活力顯著低于同期對照，表現(xiàn)為抑制作用，抑制率分別為41.89%和36.15%;處理第5d時抑制作用最強。棕櫚酸乙酯對粘蟲體內(nèi)CarE活力主要表現(xiàn)為先激活后抑制趨勢。

2.8.4棕櫚酸乙酯對粘蟲CAT活力的影響由圖5可知，棕櫚酸乙酯處理第1d時粘蟲體內(nèi)CAT活力被抑制，抑制率為18.31%，與對照相比差異顯著;處理第3、5和7d時粘蟲體內(nèi)CAT活力均顯著高于同期對照，表現(xiàn)為激活作用，激活率分別為9.80%、56.93%和178.45%;處理第7d時，CAT活力為同期對照的4.95倍。棕櫚酸乙酯處理粘蟲后，粘蟲體內(nèi)CAT呈先抑制后激活的趨勢。

3討論

蒿屬（Artemisia）是菊科植物中最大的一個屬，許多蒿屬植物具有殺蟲活性。如豬毛蒿乙醇提取物對舞毒蛾（Lymantria dispar）3齡幼蟲具有觸殺活性（Wang et al.，2012）;豬毛蒿精油對小菜蛾（Plutella xylostella）3齡幼蟲具有觸殺活性（鐘劍章等，2020），對綠豆象（Callosobruchus chinensis）具有熏蒸與觸殺活性（袁海濱等，2007）;毛蓮蒿（A.vestita）揮發(fā)油對赤擬谷盜（Tribolium castaneum）成蟲具有觸殺、熏蒸和驅(qū)避活性（周峰等，2022）。本研究對叉枝蒿、細裂葉白苞蒿、怒江蒿、粗莖蒿、豬毛蒿、陰地蒿、藏腺毛蒿、黃毛蒿、南艾蒿和毛蓮蒿10種蒿屬植物進行了殺粘蟲活性篩選，發(fā)現(xiàn)叉枝蒿殺蟲活性最好，因此，對叉枝蒿石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水萃取物進行殺蟲活性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其石油醚萃取物對粘蟲的殺蟲活性最好，進而用浸蟲法、浸葉法和小葉碟添加法測定叉枝蒿石油醚萃取物對粘蟲的觸殺、胃毒和拒食活性，發(fā)現(xiàn)叉枝蒿石油醚萃取物對粘蟲表現(xiàn)出較強的觸殺活性。

本研究從叉枝蒿石油醚萃取物餾分8中檢測出的棕櫚酸乙酯對粘蟲具有較好的觸殺活性。丁建海等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，篇蓄（Polygonumaviculare）石油醚萃取物餾分A對小菜蛾3齡幼蟲的胃毒活性最好，72h時的校正死亡率為88.30%，經(jīng)GC-MS分析，餾分A中棕櫚酸乙酯含量為61.51%，油酸乙酯含量為26.93%，認為可能是棕櫚酸乙酯對小菜蛾表現(xiàn)出殺蟲活性。Toro等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，單花決明（Cas-sia uniflora）對埃及伊蚊（Aedes aegypti）殺蟲活性的主要成分為棕櫚酸乙酯和棕櫚酸。Sugauara等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，變色茉莉（Brunfelsia uniflora）葉片提取物對埃及伊蚊具有觸殺活性，LC50為4.89mg/mL，經(jīng)GC-MS分析，提取物中棕櫚酸乙酯含量較高，為12.80%?？梢姡貦八嵋阴π〔硕旰桶＜耙廖靡脖憩F(xiàn)出殺蟲活性。

用棕櫚酸乙酯LC??處理粘蟲，掃描碼電鏡結(jié)果顯示，粘蟲蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu)排列較疏松，蠟花間空隙增大。胡兆農(nóng)等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，粘蟲表皮經(jīng)氮酮處理后蠟質(zhì)層片層結(jié)構(gòu)間空隙變大，排列較疏松，不同濃度處理后差異不明顯。陳嬌等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）經(jīng)1.5%氮酮和噻酮處理后表皮蠟層上的蠟片無變化，護蠟層明顯消失，3%N-甲基-2-吡咯烷酮處理后其上表皮蠟片無明顯變化，護蠟層部分消失。棕櫚酸乙酯可能不僅影響粘蟲表皮蠟質(zhì)層，還可能對表皮細胞有一定影響。

AChE位于神經(jīng)中樞系統(tǒng)突觸前膜，能快速水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，從而阻斷神經(jīng)沖動的傳遞。短穩(wěn)桿菌（Empedobacterbrevi）亞致死濃度對草地貪夜蛾（S.frugiperda）體內(nèi)AChE活力呈抑制作用（武懷恒等，2022）。黃花蒿（A.annua）中4種萜烯類化合物對黃粉蟲（Tenebrio molitor）體內(nèi)AChE活力呈抑制作用（王慧，2012）。本研究結(jié)果顯示，棕櫚酸乙酯對粘蟲體內(nèi)AChE活力與同期對照相比抑制效果明顯，AChE被棕櫚酸乙酯抑制后，粘蟲正常的神經(jīng)傳導被阻斷，其生理生化過程失調(diào)，最終導致粘蟲死亡。Na*-K*-ATP酶能維持細胞膜正常電位，在神經(jīng)沖動傳導方面具有重要作用?；惫麎A、苦參堿和野靛堿3種生物堿對豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）體內(nèi)Na*-K*-ATP酶活性具有較強的抑制作用，酶比活力均小于同期對照（史曉玲，2018）。瑞香狼毒（Stellera chamaejasme）石油醚萃取物可顯著抑制亞洲小車蝗（Oedaleus decorus asiaticus）、寬翅曲背蝗（Pararcyptera microptera meridionalis）和寬須蟻蝗（Myrmeleotetix palpalis）體內(nèi)Nat-K*-ATP酶活性（王貽卉，2021）。本研究結(jié)果顯示，棕櫚酸乙酯對粘蟲Na*-K*-ATP酶具有較強的抑制作用，酶被抑制時，影響細胞膜上離子通道的開放或關(guān)閉，導致細胞膜兩側(cè)的離子平衡和滲透壓平衡被打破，粘蟲神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，最終導致試蟲死亡（慕榮娟，2014）。CarE主要分布于昆蟲的頭部、中腸、馬氏管和脂肪體等部位，能催化內(nèi)源性和外源性物質(zhì)中的酯鍵、酰胺鍵和硫酯鍵水解進而增加有毒物質(zhì)的水溶性。CarE基因的過表達或酯酶基因的氨基酸突變會引起昆蟲產(chǎn)生抗性（宋維虎，2020）。不同濃度的辣椒堿（劉國強，2020）及藥西瓜（Cirulus colocynthis）正丁醇提取物（韓溶溶，2020）分別處理白粉虱（Tria-leurodes vaporariorum）及甘藍蚜（Brevicoryne bras-sicae）后，昆蟲體內(nèi)CarE活性均呈先激活后抑制的趨勢。本研究結(jié)果顯示，棕櫚酸乙酯對粘蟲3齡幼蟲CarE活性呈先激活后抑制的趨勢。當粘蟲受到棕櫚酸乙酯脅迫后，通過增加體內(nèi)的CarE活性對有毒物質(zhì)進行分解代謝，但隨著處理時間的延長，蟲體機能下降，解毒活性下降，昆蟲中毒死亡（武懷恒等，2022）。自由基（O2、-OH和H?O?）會導致膜脂過氧化、堿基突變、DNA鏈斷裂和蛋白質(zhì)損傷，對許多生物功能分子具有破壞作用。CAT是昆蟲體內(nèi)的保護酶之一，主要作用是防御氧化損傷，當過氧化氫（H?O?）濃度較高時，CAT會被激活，將H?O?轉(zhuǎn)化為H?O和O?，維持蟲體的動態(tài)平衡（陳佳杰，2020;程作慧等，2020）。蟲螨腈對甜菜夜蛾（S.exigua）幼蟲體內(nèi)CAT活性呈先抑制后激活作用（張文成等，2009）。高效氯氰菊酯對朱紅毛斑蛾（Phauda flam-mans）幼蟲體內(nèi)CAT活性呈激活作用（孟令昱，2017）。本研究結(jié)果顯示，棕櫚酸乙酯對粘蟲CAT活性呈先抑制后激活的趨勢，可能是由于棕櫚酸乙酯處理粘蟲過程中破壞了粘蟲細胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除平衡，引起其體內(nèi)活性氧含量增多，前期粘蟲體內(nèi)H?O?濃度較低，CAT在發(fā)揮作用；隨著時間的推移，H?O?濃度升高，CAT被激活，清除大量活性氧自由基以抵御棕櫚酸乙酯對蟲體的傷害（張郁泉，2022）。有關(guān)棕櫚酸乙酯對粘蟲的殺蟲機理還有待進一步研究。

叉枝蒿石油醚萃取物餾分8的主要成分壬烷、十三烷、棕櫚酸乙酯和硬脂酸乙酯對粘蟲的觸殺活性弱于餾分8，可能是由于化合物之間具有協(xié)同作用，也可能是微量甚至是痕量化學成分在發(fā)揮作用。解子儀等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，絲裂亞菊（Ajania nema-toloba）揮發(fā)油主要成分桉葉油醇與光苞亞菊（Aja-nia nitida）揮發(fā)油主要成分馬鞭草烯醇按2：6、4：4和3：5的體積比混配，對馬鈴薯腐爛莖線蟲（Dity-lenchus destructor）的觸殺活性明顯好于2種化合物單獨處理時的活性，說明2種主要化合物具有協(xié)同作用。Zhou等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿對埃及吹綿蚧（Icerya aegyptiaca）觸殺活性的LC50為60.72mg/L，與玫瑰果油的主要成分桉樹腦和樟腦混配后，觸殺活性的LC50分別為17.42和14.42mg/L，說明苦參堿與桉樹腦和樟腦具有協(xié)同作用。叉枝蒿石油醚萃取物餾分8主要化合物的協(xié)同作用及微量甚至痕量成分的觸殺活性還有待進一步研究。

4結(jié)論

叉枝蒿對粘蟲具有良好的殺蟲活性。叉枝蒿石油醚萃取物中的棕櫚酸乙酯對粘蟲的觸殺活性最好，可作為粘蟲生物防治的潛力化合物進行開發(fā)利用。

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（責任編輯 麻小燕）