叉角厲蝽不同發(fā)育階段腸道細(xì)菌群落組成、多樣性及功能預(yù)測(cè)

朱國(guó)淵（1989-），副研究員，云南省科技特派員，云南省天然橡膠產(chǎn)業(yè) 技術(shù)體系病蟲(chóng)害崗位核心成員，云南省天然橡膠可持續(xù)利用研究重點(diǎn)實(shí) 驗(yàn)室（籌）成員，主要從事熱帶作物害蟲(chóng)防控技術(shù)及天敵昆蟲(chóng)資源發(fā)掘利 用研究工作。主持省部級(jí)項(xiàng)目2項(xiàng)，作為主要成員參與國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì) 劃項(xiàng)目、省級(jí)科研項(xiàng)目10余項(xiàng)，在《Mitochondrial DNAPart B：Resources》 《Plant Disease》《南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》等國(guó)內(nèi)外核心期刊上發(fā)表學(xué)術(shù)論文20余 篇；作為主要發(fā)明人獲授權(quán)發(fā)明專利5項(xiàng)、實(shí)用新型專利2項(xiàng)；作為主要起 草人制定云南省地方標(biāo)準(zhǔn)2項(xiàng)、西雙版納州地方標(biāo)準(zhǔn)3項(xiàng)；作為完成人獲 得云南省科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)三等獎(jiǎng)1項(xiàng)，西雙版納州科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)三 等獎(jiǎng)1項(xiàng)；參編技術(shù)手冊(cè)1本。

摘要：【目的】分析天敵昆蟲(chóng)叉角厲蝽[Eocanthecona fircellata（Wolff）]不同發(fā)育階段腸道細(xì)菌群落組成及多樣 性，并預(yù)測(cè)其功能，為深入了解腸道細(xì)菌對(duì)叉角厲蝽生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)獲取方式的影響及開(kāi)發(fā)新的害蟲(chóng)生物防治策略 提供理論依據(jù)?！痉椒ā窟x取叉角厲蝽1齡、2齡、5齡若蟲(chóng)和7日齡雌、雄成蟲(chóng)，分別提取其腸道細(xì)菌基因組DNA。利 用 單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)對(duì)腸道細(xì)菌16S rRNA序列全長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)序，統(tǒng)計(jì)操作分類單元（OTU） 數(shù)量，分析腸道細(xì)菌群落組 成結(jié)構(gòu)與多樣性，并采用PICRUSt 預(yù)測(cè)腸道細(xì)菌功能?！窘Y(jié)果】從叉角厲蝽15個(gè)腸道樣品中共得到202401條有效序 列，聚類為222個(gè)OTUs，其中共有OTUs為5個(gè)。共注釋到19門(mén)32綱62目103科154屬188種細(xì)菌，優(yōu)勢(shì)門(mén)、綱、目、科、屬、種分別為變形菌門(mén)（Proteobacteria，72.22% ）、y-變形菌綱（Gammaproteobacteria，72.21%）、腸桿菌目（Enterobacterales， 72.11%）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae，49.39%）、西地西菌屬（Cedecea，49.24%） 和奈氏西地西菌（C.neteri，49.24%）。多樣性和差異分析結(jié)果顯示，腸道細(xì)菌菌群組成在叉角厲蝽不同發(fā)育階段存在顯著差異（Plt;0.05， 下同）。線性判 別分析結(jié)果顯示，1齡、2齡若蟲(chóng)和7日齡雌、雄成蟲(chóng)腸道具有顯著優(yōu)勢(shì)的菌群，而5齡若蟲(chóng)腸道不存在顯著優(yōu)勢(shì)菌群（Pgt;0.05）， 且不同發(fā)育階段腸道的優(yōu)勢(shì)菌群在科、屬、種3級(jí)分類階元水平上亦不同。KEGG代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)，叉角 厲蝽不同發(fā)育階段腸道菌群的功能相似，主要涉及新陳代謝（74.1 7%～75.59%）和環(huán)境信息處理（10.53%～11.03%），二級(jí)代謝功能通路主要為全局和概述圖譜、糖類代謝和氨基酸代謝等?！窘Y(jié)論】叉角厲蝽不同發(fā)育階段腸道細(xì)菌群落組 成和多樣性存在顯著差異，優(yōu)勢(shì)菌分布呈動(dòng)態(tài)變化。

關(guān)鍵詞：叉角厲蝽；腸道微生物；細(xì)菌多樣性；單分子實(shí)時(shí)測(cè)序

中圖分類號(hào)：S476.2;Q965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2024）01-0013-11

Composition，diversity and function prediction of the gut bacterial community in different developmental stages of Eocanthecona furcellata（Wolff）

ZHU Guo-yuan'2，LIU Bing-shun3，ZHANG Man' ，SHI Chun-lan'，TANG Yong-yu1，LAN Ming-xian'，WU Guo-xing'，Ci-na-you-ruo'，GAO Xil°

（'Plant Protection College，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201，China;2Yunnan Institute of Tropical Crops，Jinghong，Yunnan 666100，China;'Lufeng Agricultural Technical Extension Center， Chuxiong，Yunnan 651200，China）

Abstract ：[Objective]The purpose of the study was to analyze the composition and diversity of gut bacterial commu- nities in different developmental stages of the natural enemy insect Eocanthecona furcellata（Wolff），and to predict their functions，in order to provide a theoretical basis for a deeper understanding of the influenceof gut bacteria on the growth， development and nutrient acquisition patterns of E.furcellata，as well as for the development of a novel biocontrol strate- gies for the pests.【Method]The gut bacterial genomic DNA was extracted from the first instar nymphs，second instar nymphs，fifth instar nymphs，7-day-old female and male adults of E.furcellata，respectively.The full-length of 16S rRNA sequence of E.fucellata gut bacteria was sequenced using the single-molecule real-time sequencing technique.The number of operational taxonomic unit（OTU）was counted，the composition and diversity of gut bacterial communities were analyzed，and the functions of gut bacteria were predicted by PICRUSt.【Result]Atotal of 202401 effective se- quences were obtained from 15 gut samples ofE.fiurcellata，and clustered into 222 OTUs，of which 5OTUs were shared by them.A total of 19 phyla，32 classes，62 orders，103 families，154 genera and 188 species bacteria were annotated.The dominant phylum，class，order，family，genus and species of the bacteria wereProteobacteria（72.22%），Gammaproteo- bacteria（72.21%），Enterobacterales（72.11%），Enterobacteriaceae（49.39%），Cedecea（49.24%），and C.neteri（49.24%）， respectively.The results of the diversity and variance analysis revealed significant differences in the composition of the gut bacterial flora in different developmental stages of E.fuacellata（Plt;0.05，thesame below）.The linear discriminant analysis results showed that significantly dominant flora existed in the guts of first instar nymphs，second instar nymphs and 7-day-old female and male adults，while no significantly dominant flora existed in the gut of fifth instar nymphs（P gt;0.05），and the dominant flora in the gut ofdifferent developmental stages varied at the level of 3 taxonomic catego- ries，namely，family，genus and species.KEGG metabolic pathway analysis revealed that the functions of the gut flora of E.fiurcellata were similar in different developmental stages，mainly involving metabolism（74. 17%-75.59%）and environ- mental information processing（10.53%-11.03%）.The secondary metabolic pathways were mainly global and overview mapping，sugar metabolism，and amino acid metabolism，etc.【Conclusion]Significant differences in the composition and diversity of gut bacterial community are observed in different developmental stages of E.fiucellata，and the distribu- tion of dominant bacteria shows dynamic changes.

Key words：Eocanthecona furcellata（Wolff）;gut microorganism;bacterial diversity;single-molecule real-time se-quencing

Foundation items：Yunnan Agricultural Basic Research Joint Special Project（202101BD070001-050，202301BD 070001-137）;Reserve Talents Project for Young and Middle-aged Academic and Technical Leaders of Yunnan（202205AC160077）;Science and Technology Plan Project of Yunnan Tobacco Company（2023530000241012）

0 引言

【研究意義】叉角厲蝽[Eocanthecona furcellata（Wolff）] 隸屬于半翅 目（Hemiptera） 蝽 科（Pentatomi- dae） 益蝽亞科（Asopinae） 厲蝽屬（Eocanthecona）， 可捕食草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）、斜紋夜蛾（S.litura） 和柑桔尺蛾（Hyposidra talaca）等40多種 農(nóng)林害蟲(chóng)的幼蟲(chóng)，是一種在生物防治方面具有重要作用和應(yīng)用潛力的天敵昆蟲(chóng)（范悅莉等，2019;宮靖 垚等，2019;Keerthi et al.，2020;Sarkar et al.，2021）。叉角厲蝽1齡若蟲(chóng)僅刺吸嫩枝梢、嫩葉汁液，2～5齡 若蟲(chóng)及成蟲(chóng)均能捕食害蟲(chóng)，若蟲(chóng)齡期越大捕食能力 越強(qiáng)（姚明勇，2019;張曼等，2022）。昆蟲(chóng)腸道作為 一種特殊生境，棲息于此的大量微生物對(duì)昆蟲(chóng)的物 種形成、營(yíng)養(yǎng)代謝、生殖代謝及免疫等具有重要意義（王四寶和曲爽，2017;張振宇等，2017;Song et al.，2022）。同時(shí)，昆蟲(chóng)腸道微生物物種多樣性和特異性 受宿主的系統(tǒng)發(fā)育、不同發(fā)育時(shí)期、食物和營(yíng)養(yǎng)等的 影響（Colman et al.，2012;Yun et al.，2014）。鑒 于 此，利用高通量測(cè)序技術(shù)研究昆蟲(chóng)腸道微生物的結(jié) 構(gòu)組成和多樣性，已成為研究熱點(diǎn)（Fernandes et al.， 2014）。然而截至目前，關(guān)于叉角厲蝽腸道細(xì)菌與其 不同發(fā)育階段間的關(guān)聯(lián)鮮有報(bào)道。因此，研究叉角 厲蝽不同發(fā)育階段腸道細(xì)菌的組成、多樣性 及顯著 差異菌群，并分析腸道細(xì)菌對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響，對(duì) 該天敵昆蟲(chóng)人工飼料中微生物添加劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用 以及大規(guī)模人工擴(kuò)繁和利用具有重要意義?！厩叭搜?究進(jìn)展】目前關(guān)于昆蟲(chóng)腸道微生物的研究主要涉 及鱗翅目（Lepidoptera）、雙翅目（Diptera）、膜翅目（Hymenoptera）、蜚蛾目（Blattaria）、鞘翅目（Coleop- tera）、直翅目（Orthoptera） 和半翅目等昆蟲(chóng)（鄭林宇 等，2022），其中對(duì)半翅目蝽類的大多數(shù)研究集中于 蝽次目（Infraorder Pentatomomorpha）的植食性 蝽及 與異翅亞目（Heteropteran） 昆蟲(chóng)譜系相關(guān)的腸道微 生物區(qū)系（Shan et al.，2021;Lietal.，2022），如斑腹刺益蝽（Podisus maculiventris）、中黑盲蝽（Adelphoco-ris suturalis）、荔枝蝽（Tessaratoma papillosa）和綠盲 蝽（Apolygus lucorum）等（Ahsaei et al.，2020;Hu et al.，2020;Xue et al.，2021;Liu et al.，2022;Xue et al.， 2023） 。Xue 等（2021）基于Illumina HiSeq高通量測(cè) 序平臺(tái)分析了中黑盲蝽1～5齡若蟲(chóng)和1、6、9日齡雌、雄成蟲(chóng)腸道細(xì)菌組成及多樣性，發(fā)現(xiàn)上述發(fā)育階段 中黑盲蝽腸道內(nèi)的葡萄球菌屬（Staphylococcus）、不 動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomo- nas）和棒桿菌屬（Corynebacterium）等微生物的相對(duì) 豐度呈顯著動(dòng)態(tài)變化。安哲等（2022）通過(guò)相似方法 研究了棉田綠盲蝽若蟲(chóng)和雌、雄成蟲(chóng)體內(nèi)共生菌的 群落組成與多樣性，結(jié)果顯示，綠盲蝽不同發(fā)育時(shí)期 體內(nèi)共生菌的相對(duì)豐度和多樣性指數(shù)不同，且成蟲(chóng) 期的物種豐富度與群落多樣性均大于若蟲(chóng)期。韓順 財(cái)?shù)龋?022）亦采用該方法分析了采自云南、福建、廣 東、廣西、海南和臺(tái)灣的荔枝蝽成蟲(chóng)和若蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)菌 組成及多樣性，發(fā)現(xiàn)6?。ㄗ灾螀^(qū)）荔枝蝽成蟲(chóng)間細(xì) 菌多樣性差異不顯著，但1齡若蟲(chóng)間細(xì)菌組成及其 占比差異顯著;成蟲(chóng)體內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌為腸桿菌，而多數(shù) 1齡若蟲(chóng)體內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌為鏈霉菌。Kuang 等（2022）利用高通量測(cè)序技術(shù)分析3種飼料飼養(yǎng)的叉角厲蝽雌 成蟲(chóng)中腸腸道細(xì)菌 16S rRNA 序列V3～V4區(qū)域，結(jié) 果發(fā)現(xiàn)變形菌門(mén)（Proteobacteria） 和厚壁菌門(mén)（Fir-micutes）為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，沙雷氏菌屬（Serratia）（人工飼料處理的相對(duì)豐度較低）、腸球菌屬（Enterococcus）和腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的一個(gè)未培養(yǎng)細(xì)菌 屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，且不同飼料飼養(yǎng)的叉角厲蝽雌成蟲(chóng) 中腸腸道微生物區(qū)系組成存在顯著差異。Liu 等 （2022）利用依賴培養(yǎng)（Culture-dependent）和第三代測(cè) 序技術(shù)評(píng)估了荔枝蝽腸道細(xì)菌群落多樣性和動(dòng)態(tài)變 化，結(jié)果表明，7個(gè)發(fā)育階段中存在5個(gè)細(xì)菌門(mén)類，變 形菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，泛菌屬（Pantoea）為優(yōu)勢(shì)菌屬； 卵階段的細(xì)菌群落最復(fù)雜；細(xì)菌群落在卵期、1～3齡 若蟲(chóng)期、4～5齡若蟲(chóng)期和成蟲(chóng)期發(fā)揮著不同的作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，有關(guān)叉角厲蝽的研究報(bào)道主 要集中在生物學(xué)特性、捕食功能反應(yīng)、控害能力、觸 角轉(zhuǎn)錄組及嗅覺(jué)相關(guān)基因分析、唾液腺轉(zhuǎn)錄組及差 異分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因篩選與驗(yàn)證、不同食物對(duì)雌成蟲(chóng)中腸細(xì)菌群落及多樣性影響等 方面（高平等，2021;張曼等，2022;趙航等，2022; Kuang et al.，2022;Pan et al.，2022），尚未涉及其不同 齡期若蟲(chóng)和成蟲(chóng)腸道細(xì)菌群落組成及多樣性。【擬解 決的關(guān)鍵問(wèn)題】基于PacBio測(cè)序平臺(tái)，使用單分子實(shí) 時(shí)（Single-molecule real-time，SMRT）測(cè)序技術(shù)對(duì)叉 角厲蝽1齡、2齡、5齡若蟲(chóng)和7日齡雌、雄成蟲(chóng)腸道 細(xì)菌16S rRNA序列全長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)序，并采用PICRUSt 預(yù)測(cè)其腸道細(xì)菌功能，旨在探明該蟲(chóng)不同發(fā)育階段 腸道細(xì)菌群落組成及多樣性差異，為深入了解腸道 細(xì)菌對(duì)叉角厲蝽生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)獲取方式的影響及 開(kāi)發(fā)新的害蟲(chóng)生物防治策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

叉角厲蝽采自云南省玉溪市元江縣濱江大道小 燕村。在云南省昆明市北郊云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù) 學(xué)院養(yǎng)蟲(chóng)室內(nèi)用黃粉蟲(chóng)蛹飼養(yǎng)，建立穩(wěn)定種群。養(yǎng) 蟲(chóng)室內(nèi)溫度（26±1）℃、相對(duì)濕度（65±10）%、光周期 14L：10D。

1.2 叉角厲蝽腸道解剖

根據(jù)食性、捕食量及產(chǎn)卵前期，分別挑選健康、生長(zhǎng)發(fā)育一致且已饑餓處理24 h 的叉角厲蝽1齡、2齡、5齡若蟲(chóng)和7日齡雌、雄成蟲(chóng)，解剖腸道。每組 3次重復(fù)，每重復(fù)20頭。解剖前將試蟲(chóng)于-20℃冰 箱 中冷凍3～5 min， 使其麻痹后置于超凈工作臺(tái)中，先 用75%酒精進(jìn)行蟲(chóng)體體表消毒20 s， 再用無(wú)菌水清 洗3～5次，后轉(zhuǎn)至盛有無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS， pH 7.2～7.5）的培養(yǎng)皿中，置于體視顯微鏡下解剖。

為便于解剖叉角厲蝽腸道，可先剪去試蟲(chóng)胸足 和成蟲(chóng)雙翅。解剖時(shí)，將試蟲(chóng)正放，先用普通鑷子夾 住其頭、胸部，后用尖頭鑷子輕輕刺入背部，向后慢慢拉開(kāi)表皮層，露出內(nèi)容物，再用鑷子夾住嗦囊處， 向后拉出食道，剔除唾液腺、馬氏管、肛門(mén)等組織，取 出完整腸道。用無(wú)菌水沖洗后，置于1.5 mL離心管 中，蓋上蓋子并用封口膜包封，將其置于液氮中速凍 3 h后取出，轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 叉角厲蝽腸道細(xì)菌基因組DNA提取

采用磁珠法并按基因組DNA提取試劑盒 [DP812，天根生化科技（北京）有限公司]說(shuō)明書(shū)操 作步驟提取腸道細(xì)菌基因組DNA。用NanoDrop 2000型超微量分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技有限公 司）檢測(cè)基因組DNA濃度和純度。

1.416S rRNA序列PCR擴(kuò)增選取27F（5'-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3'） 和1492R（5'-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3'）引 物，用Veriti 96-Well型梯度基因擴(kuò)增儀（Applied Biosystems公司）擴(kuò)增16SrRNA 序列全長(zhǎng)，PCR反 應(yīng)體系30.0 μL：KOD OnePCR Master Mix 15.0μL， DNA模板1.5 μL，正、反向引物各1.5 μL， 無(wú)核酸酶 水10.5μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性2 min;98℃10s， 55℃30s，72℃1 min 30s，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；72℃延 伸2 min。

經(jīng)Qubit 4.0 Q33216型熒光定量?jī)x（賽默飛世爾 科技有限公司）和1.8%瓊脂糖凝膠電泳分別對(duì)擴(kuò)增 產(chǎn)物的濃度和條帶進(jìn)行檢測(cè)后，送至北京百邁客 生物科技有限公司使用三代測(cè)序平臺(tái)PacBic Sequel Ⅱ進(jìn)行測(cè)序。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì) PacBio原始下機(jī) subreads 進(jìn)行校正，得到 cCS（Circular consensus sequencing）序列；利用lima v1.7.0， 通過(guò)barcode對(duì)CCS序列進(jìn)行識(shí)別，得到原始 序列數(shù)（Raw CCS）;利用cutadapt v2.7識(shí)別正、反向 引物，丟棄不包含引物的CCS序列，對(duì)CCS長(zhǎng)度進(jìn) 行過(guò)濾，丟棄不滿足長(zhǎng)度閾值（1200～1650 bp） 的 序列，得到去除引物后序列（Clean CCS）;利用 UCHIME v8.1去除嵌合體序列，得到最終有效序 列數(shù)（Effective CCS）。使用USEARCH v10.0（http：// drive5.com/uparse/）（Edgar，2013） 在相似性97%的 水平上對(duì)序列進(jìn)行聚類并得到操作分類單元（Opera- tional taxonomic unit，OTU）。

使用Ribosomal Database Project Classifier的樸 素貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU 代表序列進(jìn) 行分類學(xué)分析（Wanget al.，2007），與Silva v138數(shù)據(jù) 庫(kù)（https：//www.arb-silva.de/）進(jìn)行比對(duì)，在各分類階 元上統(tǒng)計(jì)物種組成。使用QIIME 2分析菌群豐富度（ACE 、Chao指數(shù)）和多樣性（Simpson、Shannon指數(shù) ）（Bolyen et al.，2019）。利 用Metastats（White et al.，2009） 分析組間豐度差異顯著的菌群?；贐ray- Curtis距離算法，用非度量多維標(biāo)度（Non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析比較不同組 間群落組成的相似性，并用置換多元方差分析（Permutational multivariate analysis of variance， PERMANOVA）檢驗(yàn)差異顯著性。

通過(guò)PICRUSt2 v2.3.0（Langille et al.，2013）預(yù) 測(cè)叉角厲蝽不同發(fā)育階段腸道菌群KEGG代謝通 路，使用STAMP v2.0.8（Parks et al.，2014）分析樣品 間腸道菌群功能的差異。利用R 語(yǔ)言vegan v2.3 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 叉角厲蝽不同發(fā)育階段腸道細(xì)菌測(cè)序結(jié)果

基于PacBio 測(cè)序平臺(tái)，采用SMRT測(cè)序技術(shù)分 析叉角厲蝽1齡、2齡、5齡若蟲(chóng)和7日齡雌、雄成蟲(chóng) 腸道細(xì)菌16S rRNA序列全長(zhǎng)，結(jié)果從15個(gè)樣品中 共獲得203678條Raw CCS，平均每樣品13579條 CCS; 經(jīng)質(zhì)量過(guò)濾、嵌合體去除，得到202401條 Effective CCS，平均長(zhǎng)度為1469.2 bp（表1）?；?Effective CCS進(jìn)行聚類分析，15個(gè)樣品共得到222個(gè) OTUs， 其中共有OTUs為5個(gè)，說(shuō)明各樣品細(xì)菌群 落組成存在差異。Shannon指數(shù)曲線顯示，隨著測(cè) 序數(shù)量的增加，曲線趨于平緩（圖1），說(shuō)明本研究測(cè)序數(shù)據(jù)量充足。此外，所有樣品的覆蓋度指數(shù)均在 0.9970以上，表明具備足夠的測(cè)序深度和可靠的數(shù) 據(jù)質(zhì)量。

2.2 叉角厲蝽腸道主要細(xì)菌群落組成

對(duì)特征序列進(jìn)行分類學(xué)注釋，共得到19門(mén)32綱 62目103科154屬188種細(xì)菌。在門(mén)分類水平上，主 要菌群有變形菌門(mén)（72.22%）、厚壁菌門(mén)（27.52%）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes，0.13%）、疣微菌門(mén)（Verruco- microbiota，0.04%） 和放線菌門(mén)（Actinobacteriota， 0.02%）;在綱分類水平上，主要有γ-變形菌綱（Gam- maproteobacteria，72.21%）、芽孢桿菌綱（Bacilli， 27.41%）、擬桿菌綱（Bacteroidia，0.13%）、梭菌綱（Clostridia，0.11%）、疣微菌綱（Verrucomicrobiae， 0.04%）、阿爾法變形菌綱（Alphaproteobacteria，0.02%） 和放線桿菌綱（Actinobacteria，0.02%）等；在目分類 水平上，主要有腸桿菌目（Enterobacterales，72.11%）、乳桿菌目（Lactobacillales，27.32%）、擬桿菌目（Bacte- roidales，0.11%）、伯克氏菌目（Burkholderiales，0.06%）、梭菌目（Clostridiales，0.05%）、蟲(chóng)原體目（Entomo- plasmatales，0.05%）、假單胞菌目（Pseudomonadales， 0.04%）和疣微菌目（Verrucomicrobiales，0.04%）等； 在科分類水平上，主要有腸桿菌科（49.39%）、腸球菌 科（Enterococcaceae，26.60%）、耶爾森菌科（Yersi- niaceae，19.20%） 、摩根菌科（Morganellaceae，3.49%）、乳桿菌科（Lactobacillaceae，0.40%）、鏈球菌科（Strep- tococcaceae，0.31%）、鼠桿狀菌科（Muribaculaceae， 0.06%）、螺原體科（Spiroplasmataceae，0.05%）、梭菌 科（Clostridiaceae，0.05%）和阿克曼氏菌科（Akker- mansiaceae，0.03%） 等；在屬分類水平上，主要有西地 西菌屬（Cedecea，49.24%） 、腸球菌屬（26.60%）、沙雷氏菌屬（19.20%）、變形桿菌屬（Proteus，2.24%）、摩根氏菌屬（Morganella，1.24%）、乳球菌屬（Lacto-coccus，0.19%）、慢生乳桿菌屬（Lentilactobacillus， 0.17%）、埃希氏一志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella， 0.15%）、鏈球菌屬（Streptococcus，0.12%）和乳植桿菌屬（Lactiplantibacillus，0.10%）等；在種分類水平上，主要有奈氏西地西菌（Cedecea neteri，49.24%）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis，25.03%） 、Serratia endosymbiont of Nilaparvata lugens（19.20%） 、奇 異 變形桿菌（Proteus mirabilis，2.24%）、蒼黃腸球菌（Enterococcus gilvus，1.56%）、摩氏摩根氏菌（Mor-ganella morganii，1.24%）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，0. 18%）、布赫納氏慢生乳桿菌（Lentilactobacil- lus buchneri，0.17%）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli，0.15%）和植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum，0.10%）等（圖2）。

2.3 叉角厲蝽不同發(fā)育階段腸道細(xì)菌多樣性分析結(jié)果

2.3.1 腸道細(xì)菌Alpha 多樣性分析 由圖3可知，叉 角厲蝽從低齡若蟲(chóng)到高齡若蟲(chóng)及成蟲(chóng)的發(fā)育過(guò)程 中，其腸道細(xì)菌豐富度指數(shù)（ACE指數(shù)和Chaol指 數(shù)）減小，多樣性指數(shù)（Simpson指數(shù)和 Shannon指 數(shù)）逐漸增大。ACE 指數(shù)在1齡若蟲(chóng)與雌成蟲(chóng)之間 存在顯著差異（Plt;0.05， 下同）。Chaol 指數(shù)在1齡 若蟲(chóng)和其他發(fā)育階段之間均存在顯著差異，即1齡 若蟲(chóng)的Chaol 指數(shù)顯著高于2齡和成蟲(chóng)，極顯著高于5齡若蟲(chóng)（Plt;0.01， 下同）。1齡若蟲(chóng)的Simpson 指 數(shù) 顯著低于2齡和雌成蟲(chóng)，極顯著低于5齡若蟲(chóng)；5齡 若蟲(chóng)的Simpson指數(shù)顯著高于雄成蟲(chóng)；雌、雄成蟲(chóng)間 Simpson 指數(shù)差異顯著。雌成蟲(chóng)的Shannon 指數(shù)顯著高于1齡和2齡若蟲(chóng)，極顯著高于雄成蟲(chóng)；5齡若蟲(chóng)的 Shannon指數(shù)顯著高于2齡若蟲(chóng)和雄成蟲(chóng)。

2.3.2 腸道細(xì)菌Beta多樣性分析 NMDS分析結(jié) 果（圖4）顯示，不同樣品按照不同發(fā)育階段聚集，且 1齡若蟲(chóng)與2齡、5齡若蟲(chóng)及雌、雄成蟲(chóng)距離存在明顯 分離，Stress=0.0448（lt;0.05），說(shuō)明NMDS分析具有 很好的代表性。PERMANOVA分析結(jié)果（圖5）顯 示，叉角厲蝽不同發(fā)育階段腸道細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異 極 顯 著（F=16.627，R2=0.869，P=0.001）。

2.4 叉角厲蝽不同發(fā)育階段腸道顯著差異菌群 分析結(jié)果

采 用LEFSe（Linear discriminant analysis effect size）分析叉角厲蝽不同發(fā)育階段腸道菌群差異（LDAgt;4.0），結(jié)果（圖6）顯示，1齡、2齡若蟲(chóng)和雌、雄 成蟲(chóng)腸道存在顯著優(yōu)勢(shì)的菌群，而5齡若蟲(chóng)腸道不 存在顯著優(yōu)勢(shì)的菌群（Pgt;0.05，下同），且不同發(fā)育 階段腸道的優(yōu)勢(shì)菌群在科、屬、種3級(jí)分類水平上亦 不 同 。在 科 分 類 水 平 ， 腸桿 菌 科 顯 著 存 在 于 1 齡若蟲(chóng)階段，耶爾森菌科顯著存在于2齡若蟲(chóng)階段，摩 根菌科顯著存在于雌成蟲(chóng)階段。在屬分類水平，西 地西菌屬顯著存在于1齡若蟲(chóng)階段，沙雷氏菌屬顯 著存在于2齡若蟲(chóng)階段，摩根菌屬顯著存在于雄成 蟲(chóng)階段，變形桿菌屬顯著存在于雌成蟲(chóng)階段。在種 分類水平，糞腸球菌、奈氏西地西菌、奇異變形桿 菌 、蒼黃腸球菌、Serratia endosymbiont of Nilaparvata lugens 5個(gè)菌為所有發(fā)育階段腸道共有菌；奈氏西地 西菌顯著存在于1齡若蟲(chóng)階段，糞腸球菌和Serratia endosymbiont of Nilaparvatalugens顯著存在2齡若蟲(chóng)階段，蒼黃腸球菌和奇異變形桿菌顯著存在于雌 成蟲(chóng)階段，摩氏摩根氏菌顯著存在于雄成蟲(chóng)階段。

2.5 叉角厲蝽不同發(fā)育階段腸道菌群功能基因 預(yù)測(cè)結(jié)果

KEGG代謝途徑分析結(jié)果顯示，叉角厲蝽不同 發(fā)育階段腸道菌群的功能相似，主要涉及新陳代謝（74.17%～75.59%）、環(huán)境信息處理（10.53%～11.03%）、遺傳信息處理（5.71%～6.11%）、細(xì)胞過(guò)程（3.78%～4. 3 2 % ） 、人 類 疾 ?。? . 0 7 % ～ 3 . 3 5 % ） 和 有 機(jī) 體 系 統(tǒng)（1.32%～1.39%）（圖7-A） 。進(jìn) 一 步利用單因素方差 分析發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育階段腸道新陳代謝通路在功能 豐度上存在顯著差異，即2齡若蟲(chóng)的代謝功能顯著 高于5齡若蟲(chóng)和雌成蟲(chóng)，極顯著高于雄成蟲(chóng)和1齡若 蟲(chóng)（圖7-B）。

二級(jí)水平上功能通路預(yù)測(cè)結(jié)果有43種，其中二""""" 級(jí)代謝功能通路12種，依次為全局和概述圖譜（38.87%～39.29%）、糖類代謝（9.82%～10.86%）、氨基 酸代謝（6.29%～6.76%）、能量代謝（3.57%～3.86%）、輔助因子和維生素代謝（3.69%～3.81%）、核苷酸代 謝（3.13%～3.57%）、脂質(zhì)代謝（1.85%～2.37%）、其他氨基酸代謝（1.71%～1.88%）、外源化學(xué)物質(zhì)生物 降解與代謝（1.50%～1.63%）、聚糖生物合成與代謝（1.26%～1.34%）、萜類和聚酮類化合物代謝（0.87%～ 1 . 0 2 % ） 及 其 他 次 生 代 謝 產(chǎn) 物 生 物 合 成（0.70%～ 0.74%）。

3 討論

叉角厲蝽具有繁殖力強(qiáng)、捕食范圍廣和捕食能 力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，已成為生物防治領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊的 一種天敵昆蟲(chóng)。本研究基于PacBio測(cè)序平臺(tái)，利用 SMRT 測(cè)序技術(shù)分析了叉角厲蝽不同發(fā)育階段的腸 道細(xì)菌多樣性及其組成，并探索了該蟲(chóng)與其腸道細(xì) 菌的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果共獲得222個(gè)用于物種分 類的OTUs，涵蓋了19門(mén)32綱62目103科154屬188種，其中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，優(yōu)勢(shì)菌屬 為西地西菌屬、腸球菌屬和沙雷氏菌屬。本研究結(jié) 果與Kuang等（2022）對(duì)叉角厲蝽雌成蟲(chóng)中腸細(xì)菌組 成的研究結(jié)論相似，但優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度和優(yōu)勢(shì) 種有一定差異，可能與飼養(yǎng)代數(shù)、雌成蟲(chóng)日齡、取樣 部位以及取樣方式等有關(guān)。Xue 等（2023）報(bào)道綠盲 蝽6和9日齡雌成蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)屬為乳球菌屬，而雌成蟲(chóng) 的變形菌門(mén)相對(duì)豐度從1日齡開(kāi)始顯著下降且9日 齡最低。本研究中叉角厲蝽雌成蟲(chóng)腸道細(xì)菌的樣本 取自7日齡已交配且饑餓處理24 h的整個(gè)腸道，而 交配及饑餓處理對(duì)其腸道細(xì)菌組成及豐富度的影響 機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

Xue等（2021）報(bào)道中黑盲蝽1齡和2齡若蟲(chóng)腸 道細(xì)菌群落多樣性指數(shù)最高，而從3齡若蟲(chóng)開(kāi)始下降。綠盲蝽1齡和2齡若蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)菌群落多樣性和 豐富度亦最高，且顯著高于其他發(fā)育階段（Xue et al.，2023）; 但安哲等（2022）發(fā)現(xiàn)綠盲蝽若蟲(chóng)期體內(nèi) 微生物的物種豐富度和群落多樣性小于成蟲(chóng)期。本 研究發(fā)現(xiàn)叉角厲蝽從1齡若蟲(chóng)到成蟲(chóng)性成熟的生長(zhǎng) 發(fā)育過(guò)程中，其腸道細(xì)菌豐富度指數(shù)逐漸降低，而其 多樣性指數(shù)逐漸升高，與前人研究結(jié)果（Luo et al.， 2021;Li et al.，2022）存在一定差異，可能與天敵昆蟲(chóng) 體內(nèi)微生物群落受其取食習(xí)性和食物類型的影響有 關(guān)。中黑盲蝽和綠盲蝽具有相近的習(xí)性和生態(tài)功 能，不僅具有植食性，還兼具肉食性（Liet al.，2020）， 但相比于捕食獵物，它們更偏愛(ài)取食植物（李文靜等，2015），而叉角厲蝽除1齡若蟲(chóng)僅刺吸植物汁液， 2齡若蟲(chóng)處于植食和捕食的過(guò)渡期，其他齡期的若蟲(chóng) 和成蟲(chóng)均為捕食性。據(jù)報(bào)道，腸道微生物菌群對(duì)食 物變化引起的腸道環(huán)境變化需要代謝適應(yīng)過(guò)程（Tilocca et al.，2017）。因此，本研究中叉角厲蝽腸 道菌群的變化亦可能是為了逐步適應(yīng)新的腸道 環(huán)境。

本研究發(fā)現(xiàn)叉角厲蝽不同發(fā)育階段腸道優(yōu)勢(shì)菌 群不同，而某些菌僅存在于特定的發(fā)育時(shí)期，如奈氏 西地西菌主要存在于1齡若蟲(chóng)階段、摩氏摩根氏菌 存在于5齡若蟲(chóng)和雌、雄成蟲(chóng)中。這些細(xì)菌的存在 和顯著變化可能與叉角厲蝽的生理代謝有關(guān)，從而 幫助不同發(fā)育階段的叉角厲蝽適應(yīng)不同的食物源和 生態(tài)環(huán)境（Engel and Moran，2013）。已有研究表明， 變形菌門(mén)細(xì)菌與宿主的捕食、生長(zhǎng)發(fā)育和適合度等 有關(guān)（Nishiwaki et al.，2007;Kuang et al.，2022）。沙 雷氏菌屬能為宿主提供維生素和氨基酸，幫助其降 解纖維素、單萜或雙萜等物質(zhì)（Boone et al.，2013;胡霞等，2018），摩氏摩根氏菌在一定程度上能促進(jìn)獵 物死亡（Nishiwaki et al.，2007），變形桿菌屬有助于 吸引雌成蟲(chóng)產(chǎn)卵（Chaudhury et al.，2010），而西地西 菌屬可分泌有機(jī)酸、降低環(huán)境pH 。在其他昆蟲(chóng)的研 究中也有類似發(fā)現(xiàn)，如雜食或肉食中黑盲蝽的腸道 菌群中沙雷氏菌 屬、西地西菌屬和泛菌屬的豐度 較高，而植食中黑盲蝽中其他屬的豐度則較高（成 艷霞，2022）。與 植食性蝽相比，獵蝽科有一個(gè)特 有的腸道微生物區(qū)系，主要由腸球菌屬和不同種 類的變形桿菌組成（Li et al.，2022）。中華通草蛉（Chrysoperla sinica）卵、初孵幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)都有相似 的微生物，其中假單胞菌屬在1齡幼蟲(chóng)（初孵和1日 齡）、2齡幼蟲(chóng)、3齡幼蟲(chóng)和蛹期出現(xiàn)，在成蟲(chóng)期未出 現(xiàn)；檸檬酸桿菌屬（Citrobacter） 、醋酸桿菌屬（Aceto-bacter）、朝井桿菌（Asaia sp.）和Rosenbergiella sp.僅見(jiàn)于雄蟲(chóng)，而Cosenzaea myxofaciens僅見(jiàn)于雌蟲(chóng)（趙 輝，2018;Zhao et al.，2019）。

腸道細(xì)菌對(duì)宿主代謝和健康具有重要的調(diào)節(jié)作 用（李青晏等，2020）。本研究通過(guò)對(duì)叉角厲蝽不同 發(fā)育階段腸道菌群功能注釋，發(fā)現(xiàn)新陳代謝為主要 功能且在不同發(fā)育階段存在顯著差異，其中2齡 若蟲(chóng)的代謝功能豐度最高，5齡若蟲(chóng)次之，可能歸因 于叉角厲蝽2齡若蟲(chóng)處于食性轉(zhuǎn)換期且2齡和5齡 若蟲(chóng)均處于不斷進(jìn)食的生長(zhǎng)期，新陳代謝功能發(fā)揮 主要作用，則有助于該蟲(chóng)利用食物營(yíng)養(yǎng)并促進(jìn)其生 長(zhǎng)發(fā)育。然而，基因功能預(yù)測(cè)并不能完全反映叉角 厲蝽腸道菌群的實(shí)際功能，預(yù)測(cè)到的這些功能有待 進(jìn)一步解析和驗(yàn)證。

本研究雖然明確了叉角厲蝽不同發(fā)育階段腸道 細(xì)菌組成和多樣性，但不同細(xì)菌譜系在宿主間的傳 播方式和對(duì)宿主食物差異的響應(yīng)機(jī)制及其對(duì)宿主適 合度的影響等方面均有待深入研究。

4 結(jié)論

叉角厲蝽腸道菌群組成和多樣性在其不同發(fā)育 階段均存在顯著差異，優(yōu)勢(shì)菌分布呈動(dòng)態(tài)變化。腸 道菌群中新陳代謝功能的豐度最高，二級(jí)代謝功能 通路主要為全局和概述圖譜、糖類代謝和氨基酸代 謝等。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）