醛縮酶A對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖和侵襲的影響

【摘要】目的 探索醛縮酶A（ALDOA）過(guò)表達(dá)和基因敲減對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的影響，為探討泌尿系統(tǒng)腫瘤發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。方法 通過(guò)慢病毒感染構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的ALDOA過(guò)表達(dá)和基因敲減膀胱癌T24細(xì)胞重組細(xì)胞株，采用熒光定量PCR

（RT-PCR）法檢測(cè)重組細(xì)胞ALDOAmRNA的表達(dá)情況；采用CCK-8法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組T24細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。結(jié)果 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組重組T24細(xì)胞ALDOAmRNA的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組更高，基因敲減組較對(duì)照組更低，證實(shí)膀胱癌T24細(xì)胞重組細(xì)胞株構(gòu)建成功；CCK-8法檢測(cè)重組細(xì)胞增殖結(jié)果顯示：在培養(yǎng)72、96 h時(shí)，過(guò)表達(dá)組重組T24細(xì)胞生存率均較對(duì)照組更高；在培養(yǎng)96 h時(shí)，基因敲減組T24細(xì)胞生存率較對(duì)照組更低；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在培養(yǎng)24 h時(shí)，過(guò)表達(dá)組重組T24細(xì)胞劃痕愈合率較對(duì)照組更高；Transwell小室細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在培養(yǎng)48 h時(shí)，過(guò)表達(dá)組重組T24細(xì)胞遷移數(shù)較對(duì)照組更多，過(guò)表達(dá)組重組T24細(xì)胞侵襲數(shù)較對(duì)照組更多（均P<0.05）；培養(yǎng)24 h時(shí)，基因敲減組重組T24細(xì)胞劃痕愈合率較對(duì)照組更低；在培養(yǎng)48 h時(shí)，基因敲減組重組T24細(xì)胞遷移數(shù)較對(duì)照組更少，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。結(jié)論 ALDOA過(guò)表達(dá)可促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，ALDOA基因敲減可減少膀胱癌T24細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

【關(guān)鍵詞】醛縮酶A ; 基因敲減 ; 基因過(guò)表達(dá) ; 膀胱癌T24細(xì)胞

【中圖分類號(hào)】R737.14 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-3718.2024.14.0029.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.14.010

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病原因尚不明確，一般認(rèn)為與經(jīng)常接觸致癌物質(zhì)有關(guān)，高復(fù)發(fā)率和早期轉(zhuǎn)移是造成膀胱癌病死率高的主要原因[1-2]。目前尚無(wú)有效治療方法，因此，尋找新的治療靶標(biāo)和策略顯得尤為迫切。有氧糖酵解是大多數(shù)腫瘤細(xì)胞主要的能量獲取方式，糖酵解過(guò)程多種催化酶在腫瘤組織中表達(dá)增加，并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。醛縮酶A（ALDOA）是糖酵解過(guò)程中關(guān)鍵酶之一，可催化1， 6-二磷酸果糖裂解3磷酸甘油醛和磷酸二酰甘油。有研究顯示，ALDOA在多種腫瘤組織中高表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[4]，且ALDOA在膀胱癌組織中高表達(dá)，與患者腫瘤組織低分化和較差預(yù)后密切相關(guān)[5]。但有關(guān)ALDOA對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響尚不清楚?；诖?，本研究通過(guò)構(gòu)建ALDOA過(guò)表達(dá)和基因敲減膀胱癌T24重組細(xì)胞株，研究ALDOA差異性表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 膀胱癌細(xì)胞株T24（中國(guó)科學(xué)院上海生物所細(xì)胞庫(kù)）。

1.2 主要試劑與儀器 ALDOA過(guò)表達(dá)和shRNA干擾慢病毒顆粒（上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；CCK-8試劑盒、RIPA裂解液和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司）；Transwell小室和6孔板（美國(guó)Corning公司），Trizol RNA提取試劑（美國(guó)Invitrogen公司）。倒置顯微鏡（尼康公司，型號(hào)：ECLIPSE Ts2）；實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀（伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)有限公司，型號(hào)：CFX96 Deep Well）；酶標(biāo)儀[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司，型號(hào)：Multiskan FC]。

1.3 研究方法

1.3.1 醛縮酶A過(guò)表達(dá)和shRNA病毒轉(zhuǎn)染人膀胱癌T24細(xì)胞株 T24細(xì)胞用含有10%胎牛血清的

RPMI-1640培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。感染前1 d取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將其鋪板到35 mm培養(yǎng)皿，使感染時(shí)細(xì)胞密度約達(dá)80%，24 h后加入病毒稀釋液：ALDOA過(guò)表達(dá)組加入pLV-ALDOA慢病毒的病毒稀釋液1.7 mL，病毒滴度為1×106 TU/mL，對(duì)照組加入空載質(zhì)粒的病毒稀釋液1.7 mL。 ALDOA基因敲減組加入含shRNA慢病毒的病毒稀釋液1.7 mL，病毒滴度為

1×106 TU/mL，對(duì)照組加入空載質(zhì)粒的病毒稀釋液1.7 mL。用病毒培養(yǎng)液替換原細(xì)胞培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。第2天換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，熒光顯微鏡觀察，估計(jì)慢病毒感染細(xì)胞的效率，同時(shí)，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)重組ALDOAmRNA的表達(dá) 收集感染慢病毒的重組細(xì)胞，按照說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞中總RNA，檢測(cè)濃度合格后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板，按照以下條件進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，目的基因引物：醛縮酶A-F：GTGGGCATCAAGGTAGACAAGGG；醛縮酶A-R：TGCTGGCAGATACTGGCATAACG。內(nèi)參引物：GAPDH-R：CAAGGGCATCCTGGGCTACACT；GAPDH-R：CTCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC。反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL，上游引物0.8 μL，2SYGR 10 μL，加水補(bǔ)足20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線：65 ℃到95 ℃，每

0.5 ℃保溫5 s。RT-PCR采用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量分析并計(jì)算ALDOA mRNA相對(duì)表達(dá)量。均進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 CCK-8法檢測(cè)重組細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的過(guò)表達(dá)和基因敲減重組T24細(xì)胞，胰酶消化，離心去上清，重懸后計(jì)數(shù)，稀釋至細(xì)胞密度2×107個(gè)/L，加入96孔板中，每孔100 μL，另設(shè)置只加培養(yǎng)液的對(duì)照孔。設(shè)置測(cè)定時(shí)間點(diǎn)為0、24、48、72和96 h，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后，測(cè)定前24 h加入CCK-8試劑，每孔10 μL，混勻后置于培養(yǎng)箱24 h，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處各組的吸光度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率=（OD實(shí)驗(yàn)組－OD對(duì)照組）/（OD對(duì)照組－OD空白組）×100%。均進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組細(xì)胞遷移 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的過(guò)表達(dá)和基因敲減重組T24細(xì)胞，將細(xì)胞以3×105個(gè)/孔的密度接種于六孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%～90%時(shí)，用10 μL槍頭垂直劃痕，PBS清洗劃下的細(xì)胞，重復(fù)2次，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育，分別在0、24 h用倒置顯微鏡觀察拍照，圖片用Image J軟件進(jìn)行處理，并計(jì)算劃痕愈合率，愈合率=（0 h劃痕寬度－24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。均進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組細(xì)胞遷移和侵襲 取生長(zhǎng)良好的過(guò)表達(dá)和基因敲減重組T24細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基24 h，取2×104個(gè)細(xì)胞與200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基加入上室，用于檢測(cè)細(xì)胞遷移；取5×104個(gè)細(xì)胞與基質(zhì)膠用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋到1 mg/L，取200 μL加入上室，檢測(cè)細(xì)胞侵襲。在下室加入500 μL含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，在37 ℃孵育48 h后，將小室上層未侵襲細(xì)胞除去，用4%多聚甲醛溶液固定15 min，后用0.1%結(jié)晶紫染色處理10 min，經(jīng)PBS洗滌并干燥后，顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)（×200）視野拍照，圖片用Image J軟件進(jìn)行處理；計(jì)算細(xì)胞數(shù)。均進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.4 觀察指標(biāo) ⑴通過(guò)RT-PCR檢測(cè)觀察ALDOA過(guò)表達(dá)組及基因敲減組重組細(xì)胞mRNA的表達(dá)水平。⑵通過(guò)CCK-8法檢測(cè)ALDOA過(guò)表達(dá)組及基因敲減組重組細(xì)胞的生存率。⑶通過(guò)劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ALDOA過(guò)表達(dá)組及基因敲減組重組細(xì)胞劃痕愈合率，通過(guò)Transwell小室細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ALDOA過(guò)表達(dá)組及基因敲減組重組細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次取平均值，計(jì)量數(shù)據(jù)均以（ x ±s）表示，組間比較采獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。 P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)和敲減重組細(xì)胞ALDOAmRNA的表達(dá)水平 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組重組細(xì)胞ALDOAmRNA的相對(duì)表達(dá)量為[（187.75±9.19）%]高于對(duì)照組重組細(xì)胞ALDOAmRNA的相對(duì)表達(dá)量[（105.05±5.00）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值=10.725，

P<0.05），見(jiàn)圖1；基因敲減組重組細(xì)胞ALDOAmRNA的相對(duì)表達(dá)量為[（2.73±0.14）%]較對(duì)照組更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值=13.812，P<0.05），見(jiàn)圖2。

2.2 ALDOA過(guò)表達(dá)和基因敲減重組細(xì)胞生存率檢測(cè)結(jié)果 培養(yǎng)72 h、96 h時(shí)，過(guò)表達(dá)組重組細(xì)胞生存率為

[（119.37±5.97）%]、[（154.71±7.74）%]，均高于對(duì)照組重組細(xì)胞生存率[（72.48±3.62）%]、[（94.52±4.73）%]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值=11.627、12.047，均P<0.05），見(jiàn)圖3；培養(yǎng)96 h時(shí)，基因敲減組細(xì)胞生存率為[（67.38±3.37）%]，低于對(duì)照組細(xì)胞生存率[（92.59±4.63）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值=5.738，P<0.05），見(jiàn)圖4。

2.3 ALDOA過(guò)表達(dá)和基因敲減對(duì)重組細(xì)胞遷移的影響 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h時(shí)，過(guò)表達(dá)組重組細(xì)胞劃痕愈合率為[（79.38±3.97）%]高于對(duì)照組重組細(xì)胞劃痕愈合率[（52.14±2.61）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（t值=5.831，P<0.05）；基因敲減組重組細(xì)胞劃痕愈合率為[（41.57±2.08）%]與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值=3.627，P>0.05），見(jiàn)圖5。

2.4 ALDOA過(guò)表達(dá)和基因敲減重組細(xì)胞遷移和侵襲的影響 Transwell小室細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)48 h時(shí)，過(guò)表達(dá)組重組細(xì)胞遷移數(shù)為[（120.51±6.07）個(gè)]多于對(duì)照組重組細(xì)胞遷移數(shù)[（85.36±4.32）個(gè)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值=8.325，P<0.05）；基因敲減組重組細(xì)胞遷移數(shù)為[（75.72±3.85）個(gè)]與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值=2.948，P>0.05），見(jiàn)圖6。在培養(yǎng)48 h時(shí)，過(guò)表達(dá)組重組細(xì)胞侵襲數(shù)為[（105.83±5.32）個(gè)]多于對(duì)照組重組細(xì)胞侵襲數(shù)[（72.43±3.64）個(gè)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值=5.927，P<0.05）；基因敲減組重組細(xì)胞侵襲數(shù)為[（61.75±3.16）個(gè)]與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值=3.529，P>0.05），見(jiàn)圖7。

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病原因包括內(nèi)在遺傳因素和外在的環(huán)境因素，為研究ALDOA對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，本研究首先構(gòu)建了針對(duì)ALDOA的過(guò)表達(dá)和基因敲減（shRNA干擾）的慢病毒載體，并篩選出能夠穩(wěn)定表達(dá)的ALDOA過(guò)表達(dá)和基因敲減膀胱癌T24重組細(xì)胞株。本研究結(jié)果中，

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組重組細(xì)胞ALDOAmRNA的相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，基因敲減組較對(duì)照組更低，提示ALDOA過(guò)表達(dá)和基因敲減膀胱癌T24重組細(xì)胞株構(gòu)建

成功。

本研究結(jié)果顯示，在培養(yǎng)72、96 h時(shí)，過(guò)表達(dá)組重組細(xì)胞生存率均較對(duì)照組更高；在培養(yǎng)96 h時(shí)，基因敲減組細(xì)胞生存率較對(duì)照組更低；這提示過(guò)表達(dá)ALDOA可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞生存率更高，基因敲減ALDOA可延緩腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞生存率更低，這與既往的研究[6]結(jié)果相近。過(guò)表達(dá)ALDOA可以促進(jìn)纖維肌動(dòng)蛋白組裝成微管，微管的增長(zhǎng)在細(xì)胞周期胞質(zhì)分裂過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，隨著微管的增長(zhǎng)，完成復(fù)制的染色體被牽拉分離進(jìn)入子細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖[7]。

本研究結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24 h后，過(guò)表達(dá)組重組細(xì)胞劃痕愈合率較對(duì)照組更高；在培養(yǎng)48 h后，過(guò)表達(dá)組重組細(xì)胞遷移數(shù)較對(duì)照組更多，過(guò)表達(dá)組重組細(xì)胞侵襲數(shù)較對(duì)照組更多；在培養(yǎng)24 h后，基因敲減組重組細(xì)胞劃痕愈合率較對(duì)照組更低。這提示ALDOA過(guò)表達(dá)重組細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯增強(qiáng)，ALDOA在腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力的過(guò)程中起重要作用，這與SAITO等[8]的研究結(jié)果相近。ALDOA過(guò)表達(dá)可以明顯降低腫瘤細(xì)胞上皮性標(biāo)志物N-cadherin的表達(dá)，增加間質(zhì)性標(biāo)志物N-cadherin和vimetin的表達(dá)，增加胞質(zhì)內(nèi)β-caterin 表達(dá)量，ALDOA可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化。上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)的關(guān)鍵啟動(dòng)步驟之一[9]；

Wnt/β-caterin信號(hào)通路是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要信號(hào)通路，β-caterin是該信號(hào)通路激活的關(guān)鍵信使分子[10]。有研究認(rèn)為ALDOA通過(guò)與胞質(zhì)中破壞復(fù)合物中GSK3結(jié)合，使β-caterin無(wú)法磷酸化而避免被泛素化降解，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積累并移至細(xì)胞核，激活相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。但在膀胱癌中ALDOA是否參與此過(guò)程尚不清楚，需進(jìn)一步研究證實(shí)。此外，ALDOA基因敲減重組細(xì)胞的增殖會(huì)受到顯著抑制，但對(duì)其侵襲和遷移無(wú)明顯影響，這為利用ALDOA抑劑靶向治療膀胱癌提供了

依據(jù)。

綜上，本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ALDOA和基因敲減膀胱癌T24重組細(xì)胞株，ALDOA過(guò)表達(dá)可顯著增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，為膀胱癌的靶向治療提供了新的策略。

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1 基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：2020J01206）

作者簡(jiǎn)介：李建偉，博士研究生，主任醫(yī)師，研究方向：泌尿腫瘤發(fā)病機(jī)制。