水中糞大腸菌群的四種監(jiān)測(cè)方法的對(duì)比分析

摘要：糞大腸菌群作為一項(xiàng)能夠反映水質(zhì)衛(wèi)生安全程度的因子，已成為水體污染評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。目前，國(guó)內(nèi)環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域主流的測(cè)定方法有多管發(fā)酵法、紙片快速法、酶底物法和濾膜法四種。從原理、陽(yáng)性判別方式、適用范圍、檢出限、方法特點(diǎn)和干擾因素等方面對(duì)上述4種方法進(jìn)行對(duì)比論述，表明了4種方法所具有的特性，總結(jié)了實(shí)際工作中應(yīng)當(dāng)因地制宜選擇合適的測(cè)定方法，有助于提升監(jiān)測(cè)質(zhì)量、提高工作效率。

關(guān)鍵詞：糞大腸菌群多管發(fā)酵法紙片快速法酶底物法濾膜法

中圖分類(lèi)號(hào)：X832

ComparativeAnalysisofFourMonitoringMethodsforFecalColiformsinWater

YUWeiSHILingxi

EcologicalEnvironmentMonitoringCenterofChangzhou，Changzhou，JiangsuProvince，213000China

Abstract：Fecalcoliform，asafactorthatcanreflectwaterqualityandhealthsafety，hasbecomeanimportantindexofwaterpollutionevaluation.Atpresent，therearefourmainmethodsindomesticenvironmentalmonitoringfield：Multi-TubeFermentation，RapidPaperStripMethod，EnzymeSubstrateTechniqueandMembraneFilterMethod.Theabovefourmethodswerecomparedanddiscussedfromtheaspectsofprinciple，positiveidentificationmethod，applicationscope，detectionlimit，methodcharacteristicsandinterferencefactors，indicatingthecharacteristicsofthefourmethods，andsummarizingthepracticalworkshouldbeselectedaccordingtolocalconditions，which?;ishelpfultoimprovethemonitoringqualityandimproveworkefficiency.

KeyWords：Fecalcoliform;Multi-TubeFermentation;RapidPaperStripMethod;EnzymeSubstrateTechnique;MembraneFilterMethod

糞大腸菌群是生長(zhǎng)于人和溫血?jiǎng)游锬c道中的一組腸道細(xì)菌，隨糞便排出體外，約占糞便干重的1/3以上，故稱(chēng)為糞大腸菌群，其中，除一般正常細(xì)菌外，同時(shí)也會(huì)有一些腸道致病菌存在（如沙門(mén)氏菌、志賀氏菌等），一旦其污染了水源，水中超標(biāo)的糞大腸菌群可引發(fā)人體腸道疾?。ㄈ绺篂a、腸胃感染等）風(fēng)險(xiǎn)[1]。因此，開(kāi)展水中糞大腸菌群的檢測(cè)顯得尤為重要，它能直接反映水質(zhì)衛(wèi)生安全性程度，關(guān)乎人體生命健康。目前，該參數(shù)已成為水體污染評(píng)價(jià)的重要的指標(biāo)[2]。

目前，國(guó)內(nèi)環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域測(cè)定水中糞大腸菌群的國(guó)標(biāo)方法有多管發(fā)酵法[3]、紙片快速法[4]、酶底物法[5]和濾膜法[6]。4種方法各有特點(diǎn)，在實(shí)際工作中根據(jù)不同的情況選用合適的測(cè)定方法很有必要，它有助于提高數(shù)據(jù)質(zhì)量、提升工作效率。因此，本文將從方法原理、陽(yáng)性判別方式、適用范圍、檢出限、方法特點(diǎn)和干擾因素等不同角度對(duì)上述四種分析方法進(jìn)行對(duì)比論述，以期為監(jiān)測(cè)人員因地制宜選用合適的分析方法提供參考。

1方法原理及陽(yáng)性判別方式對(duì)比

由表1可知，水中糞大腸菌群測(cè)定的四種國(guó)標(biāo)方法中，共同點(diǎn)是培養(yǎng)溫度均為44.5℃，陽(yáng)性結(jié)果均以樣品接種、培養(yǎng)后的變色現(xiàn)象和（或）產(chǎn)氣現(xiàn)象加以呈現(xiàn)并判別。但不同的測(cè)定方法對(duì)“糞大腸菌群”的定義卻不盡相同，這是由于在不同的測(cè)定原理下，糞大腸菌群與各自適配的培養(yǎng)基發(fā)生反應(yīng)所呈現(xiàn)的，且需要被捕捉并準(zhǔn)確記錄的特征不一致所致。因此，在實(shí)際水樣測(cè)定過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)根據(jù)所選用的具體方法，充分認(rèn)識(shí)其反應(yīng)原理，選用適配的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)仔細(xì)辨別糞大腸菌群在樣品中反應(yīng)前后不同的陽(yáng)性呈現(xiàn)方式，從而準(zhǔn)確判斷、計(jì)數(shù)以得出可靠結(jié)果。

44.5℃培養(yǎng)24h，能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細(xì)菌

熒光效應(yīng)：生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細(xì)菌，在紫外燈照射下產(chǎn)生熒光

濾膜法

44.5℃培養(yǎng)24h，能在MFC選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，并形成藍(lán)色或藍(lán)綠色菌落的腸桿菌科細(xì)菌

變色：產(chǎn)酸使指示劑變色，呈現(xiàn)藍(lán)色或藍(lán)綠色菌落

2方法適用范圍和結(jié)果表示對(duì)比

2.1測(cè)定方法及適用范圍

目前，國(guó)內(nèi)環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域主流測(cè)定水中糞大腸菌群的，4種國(guó)標(biāo)方法如表2所示。其中，多管發(fā)酵法、酶底物法和濾膜法的應(yīng)用范圍較廣，能夠應(yīng)用于地表水、地下水、生活污水、工業(yè)廢水檢測(cè)；而紙片快速法僅應(yīng)用于地表水和廢水，不能用于地下水的檢測(cè)。

2.2計(jì)數(shù)方式與結(jié)果表示

多管發(fā)酵法、紙片快速法和酶底物法采用MPN法計(jì)數(shù)，它是一種以生物學(xué)理論和數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)理論為基礎(chǔ)，通過(guò)正態(tài)分布的概率推斷法將微生物數(shù)目確定在一定范圍內(nèi)的方法。而濾膜法采用直接計(jì)數(shù)特征菌落的方式，采用CFU（菌落形成單位）計(jì)。兩者的區(qū)別為，CFU是直接計(jì)數(shù)得到的實(shí)際數(shù)值，用來(lái)衡量樣品中微生物的實(shí)際數(shù)量；而MPN是一個(gè)估計(jì)值，用于描述在一定概率水平下，一個(gè)樣本中被測(cè)定的微生物數(shù)量最可能是多少。

2.3方法檢出限

濾膜法檢出限最低，在實(shí)際操作過(guò)程中，理論上它可以不受取樣量限制（只要水樣不堵塞濾膜），因而可以測(cè)定較低濃度的水樣；多管發(fā)酵法和酶底物法檢出限稍高；紙片快速法檢出限最高，達(dá)到20MPN/L。

3方法特點(diǎn)對(duì)比

3.1結(jié)果準(zhǔn)確度

張會(huì)強(qiáng)等[7]、羅婭敏等[8]研究結(jié)果表明，分別用上述4種方法測(cè)定同一支糞大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)定量菌株，結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)。其中，多管發(fā)酵法和酶底物法的準(zhǔn)確度整體優(yōu)于紙片快速法和濾膜法。從結(jié)果的相關(guān)性上來(lái)看，多管發(fā)酵法、紙片快速法和酶底物法這3種方法的測(cè)定值經(jīng)兩兩配對(duì)cf61aefb95a2ae6b37d34629d9287e3b后的泊松相關(guān)系數(shù)均表示為強(qiáng)相關(guān)，配對(duì)t檢驗(yàn)后結(jié)果顯示無(wú)顯著差異。由于濾膜法采用的是直接菌落計(jì)數(shù)方式，其測(cè)定結(jié)果與其他3種方法測(cè)定值存在顯著性差異，采用該方法時(shí)需與其他3種方法的結(jié)果進(jìn)行可比性驗(yàn)證。

3.2操作復(fù)雜程度

多管發(fā)酵法操作最為繁瑣，實(shí)驗(yàn)前需配制培養(yǎng)基，后要分裝于大量試管中，初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)后還要進(jìn)行復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，且實(shí)驗(yàn)完成后需清洗大批試管，伴隨著惡臭氣味，工作強(qiáng)度最大，對(duì)分析人員的專(zhuān)業(yè)技能要求也最高；濾膜法同樣需要配制培養(yǎng)基，但后續(xù)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，僅需將待測(cè)水樣進(jìn)行過(guò)濾，后將濾膜放置于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，整體操作復(fù)雜程度相較多管發(fā)酵法有所降低；紙片快速法和酶底物法采用的是市售專(zhuān)用的試劑耗材，僅需簡(jiǎn)單地向其內(nèi)接種水樣，因此操作最簡(jiǎn)單，對(duì)分析人員的專(zhuān)業(yè)技能要求也最低[9]。

3.3檢測(cè)周期

多管發(fā)酵法至少需培養(yǎng)48h，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期甚至?xí)哂?2h；其他3種方法僅需培養(yǎng)24h，實(shí)驗(yàn)周期大大縮短了。

3.4環(huán)境要求

多管發(fā)酵法和濾膜法均需提供滅菌環(huán)境，實(shí)驗(yàn)全程均應(yīng)處于無(wú)菌環(huán)境下操作，對(duì)環(huán)境要求最為嚴(yán)格；紙片快速法只需將移液、接種操作需置于無(wú)菌環(huán)境下；而酶底物法只需要取樣加試劑，再用封口機(jī)密封，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求最低。

3.5經(jīng)濟(jì)成本

多管發(fā)酵法和濾膜法所用的實(shí)驗(yàn)器皿可重復(fù)使用，試劑自配，成本低廉；紙片快速法需購(gòu)置專(zhuān)用一次性檢驗(yàn)紙片，成本略高；酶底物法采用市售獨(dú)特的培養(yǎng)基和專(zhuān)用試劑，屬于消耗品，總成本最高。方法特點(diǎn)詳情如表3所示。

4干擾因素分析

4種國(guó)標(biāo)方法均對(duì)水樣中的干擾因子進(jìn)行了說(shuō)明，表明了活性氯和重金屬離子對(duì)糞大腸菌群測(cè)定結(jié)果的影響。此外，由于紙片快速法和酶底物法是依靠糞大腸菌群的顯色現(xiàn)象特征來(lái)判別樣品是否陽(yáng)性，因此，鄺小林研究了水樣色度對(duì)上述兩種方法測(cè)定結(jié)果的影響。

研究表明：對(duì)紙片快速法而言，隨著水質(zhì)色度的增加，可判讀的陽(yáng)性紙片數(shù)會(huì)逐漸減少，當(dāng)樣品色度增加到32倍時(shí)，已對(duì)紙片陽(yáng)性的判讀產(chǎn)生明顯干擾[10]；對(duì)酶底物法而言，隨著水質(zhì)色度的增加，糞大腸菌群的可判讀陽(yáng)性孔數(shù)逐漸減少，其MPN檢測(cè)值也隨之變小。當(dāng)樣品色度達(dá)到64倍時(shí)，陽(yáng)性孔數(shù)無(wú)法判讀[11]。因此，針對(duì)顏色較深的水樣，不宜選用紙片快速法和酶底物法進(jìn)行測(cè)定。

5結(jié)語(yǔ)

綜上所述，4種測(cè)定糞大腸菌群的方法均能滿(mǎn)足環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域多種樣品類(lèi)型的分析測(cè)試需求（紙片快速法測(cè)定地下水除外），且均能得出相對(duì)可靠的、具有一定可比性的數(shù)據(jù)結(jié)果。在實(shí)際工作中，面對(duì)不同任務(wù)類(lèi)型的樣品時(shí)，應(yīng)當(dāng)結(jié)合樣品類(lèi)型、性狀、數(shù)量、客戶(hù)需求等因素選擇合適的分析方法以提升工作效率。多管發(fā)酵法適用于數(shù)量少，但準(zhǔn)確度要求高的樣品測(cè)定，如能力驗(yàn)證樣品，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外部質(zhì)量活動(dòng)等；紙片快速法和酶底物法適用于大批量樣品的測(cè)試，可結(jié)合二者的經(jīng)濟(jì)成本、結(jié)果準(zhǔn)確度、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件等因素再進(jìn)行細(xì)化選擇；濾膜法具有較低的檢出限且不受取樣量大小的限制，適用于低濃度樣品以及特定計(jì)數(shù)（CFU）需求的樣品測(cè)試。

在實(shí)際工作中，還需準(zhǔn)確把握每種方法的操作要點(diǎn)、做好質(zhì)量控制，同時(shí)關(guān)注干擾因子（如活性氯、重金屬和色度）的影響，方能使數(shù)據(jù)質(zhì)量、工作效率提升至更高水平。

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