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    基于響應(yīng)面法的枇杷葉總黃酮提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

    2024-08-14 00:00:00王晶陳瑩瑩焦輝進周濃史虎軍張弦飛
    南方農(nóng)業(yè)·上旬 2024年6期
    關(guān)鍵詞:枇杷葉抗氧化活性總黃酮

    摘 要 為優(yōu)化枇杷葉中總黃酮提取工藝,探明總黃酮的抗氧化活性,以枇杷葉總黃酮提取量為考察指標(biāo),以提取方式、甲醇與乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間、提取溫度為考察因素,采用單因素和BoX-Behnken響應(yīng)設(shè)計試驗,同時檢測枇杷葉總黃酮對DPPH·清除能力和ABTS+清除能力。乙醇超聲提取效果最好,4個因素對枇杷葉總黃酮提取量的影響排序為提取時間>提取溫度>料液比>乙醇體積分數(shù),其中4個因素均有極顯著影響(p<0.01),料液比與提取時間的交互作用影響極顯著(p<0.01);乙醇體積分數(shù)與提取時間交互作用影響顯著(p<0.05)。枇杷葉總黃酮最佳提取工藝參數(shù):乙醇體積分數(shù)48%,料液比1∶26,提取時間66 min,提取溫度63 ℃,實際測得枇杷葉總黃酮提取量為69.389 mg·g-1,與理論值差異小。在該工藝下,枇杷葉總黃酮對DPPH·與ABTS+最大清除率分別為34.396%、27.680%,雖然比Trolox清除率低,但仍有一定的清除能力。

    關(guān)鍵詞 枇杷葉;總黃酮;響應(yīng)曲面法;抗氧化活性

    中圖分類號:TS201.1 文獻標(biāo)志碼:A DOI:10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.11.001

    枇杷葉為薔薇科植物枇杷[Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.]的干燥葉,具有清肺止咳、降逆止嘔的功效,用于治療肺熱咳嗽、氣逆喘急、胃熱嘔逆、煩熱口渴[1]?,F(xiàn)代研究表明,枇杷葉中含有黃酮成分[2],是其主要藥效成分。藥理研究表明,枇杷葉具有抗氧化、抗炎、降血脂、止咳、增強免疫[3-5]等作用,同時枇杷葉也是藥食同源植物,其保健功能越來越受到健康產(chǎn)業(yè)的關(guān)注[6-7]。目前,對于枇杷葉的研究多集中在三萜酸[8],文獻報道顯示,枇杷葉中總黃酮類化合物對減少自由基的產(chǎn)生和清除自由基都有良好的作用,具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血脂的功效[9-12]。因此,優(yōu)化枇杷葉總黃酮提取工藝,提高總黃酮提取量對枇杷葉有效成分開發(fā)利用具有重要意義[13]。目前提取枇杷葉總黃酮的方法主要為熱浸法,但提取時間過長、成本高且黃酮在提取過程中易分解[14]。超聲波提取中藥材中的黃酮,具有破碎時間短、提取率高、提取時間短的優(yōu)點[15-17]。

    本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取枇杷葉總黃酮工藝,并檢測枇杷葉總黃酮對DPPH清除能力和ABTS+清除能力,探討其抗氧化能力,為枇杷葉開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

    1" 材料與方法

    1.1" 試驗材料

    枇杷葉采于重慶市萬州區(qū)(經(jīng)度108.451 5°,緯度30.754 3°,海拔395 m),樣品鑒定為薔薇科植物枇杷的葉,洗凈,45 ℃恒溫干燥至恒重,粉碎過60目篩,備用。

    1.2" 試驗方法

    1.2.1" 總黃酮含量測定

    總黃酮含量測定采用硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色法[13]。吸取一定量的樣品溶液于試管中,加入0.3 mL5% NaNO2溶液,搖勻;6 min后加入0.3 mL10% A1(NO3)3溶液,靜置6 min,加入4.0 mL 4% NaOH溶液,用60%乙醇定容至10 mL,靜置10 min,于510 nm處測定吸光值。以吸光值A(chǔ)(x)和蘆丁含量C(y),繪制總黃酮含量標(biāo)準曲線y=13.916x-0.002 7(R2= 0.999 2)。

    P=n×ρ×v/m (1)

    式中,P為總黃酮含量,mg·g-1;ρ為蘆丁質(zhì)量濃度,mg·mL-1;v為提取液的體積,mL;n為稀釋倍數(shù)。

    1.2.2" 提取方式試驗

    超聲供試品溶液制備,稱取枇杷葉粉末10 g,置于150 mL錐形瓶中,與60%乙醇50 mL混勻(盡量潤濕粉末),60 ℃下超聲提取60 min(超聲功率300 W,工作頻率40 kHz),搖勻,紗布過濾后用布氏漏斗濾紙抽濾,濃縮液以60%定容至5 mL量瓶中,即得。

    回流供試品溶液制備,稱取枇杷葉粉末10 g,置于150 mL燒瓶中,與60%乙醇50 mL混勻(盡量潤濕粉末),60 ℃水浴鍋中回流提取1 h,搖勻,紗布過濾后用布氏漏斗濾紙抽濾,濃縮液以60%定容至5 mL量瓶中,即得。

    索式回流供試品溶液制備,稱取枇杷葉粉末10 g,用濾紙包裹置于索氏提取器中,精確加60%乙醇50 mL,50 ℃下提取4 h,紗布過濾后用布氏漏斗濾紙抽濾,濃縮液以60%定容至25 mL量瓶中,即得。

    1.2.3" 單因素試驗

    在乙醇體積60%、料液比1∶15(g·mL-1)、超聲溫度60 ℃、超聲時間60 min的基本工藝條件下,考察這4個因素對枇杷葉總黃酮提取量的影響。

    1.2.4" 響應(yīng)面設(shè)計

    根據(jù)單因素試驗結(jié)果,采取4因素3水平設(shè)計Box-Behnken Design試驗(見表1)。

    1.2.5" 抗氧化活性試驗

    1.2.5.1" " DPPH自由基的清除能力

    參考Yu等[18]的方法并加以改進,取DPPH 2.0 mg用無水乙醇定容至50 mL,低溫避光反應(yīng)30 min,得到0.04 mg·mL-1的DPPH溶液。用40%乙醇稀釋配制濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL-1樣品。精確吸取樣品溶液0.1 mL與2.0 mL的DPPH溶液,避光反應(yīng)30 min。在517 nm下測定吸光值,同時以相同質(zhì)量濃度Trolox做對照試驗。每個樣品做3個平行,取均值。

    清除率=1-A1-A2/A0 (2)

    式中,A0為溶劑與DPPH·混合液吸光值;A1為樣品/標(biāo)準品與DPPH·混合液吸光值;A2為樣品/標(biāo)準品與乙醇混合液吸光值。

    1.2.5.2" " ABTS+自由基的清除能力

    參考Liu等[19]的方法并加以改進,ABTS儲備液的制備:取7.0 mmol·L-1的ABTS和2.4 mmol·mL-1過硫酸鉀等體積避光混合12 h后,即得ABTS溶液,使用前蒸餾水稀釋,使得734 nm處吸光值為0.70±0.02。用40%乙醇稀釋配制濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL-1樣品。吸取樣品溶液0.05 mL與2.0 mL ABTS溶液,搖勻反應(yīng)10 min,在734 nm下測定吸光值,同時以相同質(zhì)量濃度Trolox做對照試驗。

    清除率=1-A1/A0 (3)

    式中,A0為乙醇與ABTS+混合液吸光值;A1為樣品/標(biāo)準品與ABTS+混合液吸光值。

    1.3" 數(shù)據(jù)處理

    采用Design-Expert 12進行響應(yīng)面設(shè)計,Excel 16與Origin 2018對試驗數(shù)據(jù)進行處理分析及繪圖。

    2" 結(jié)果與分析

    2.1" 單因素試驗結(jié)果

    2.1.1" 提取方式對總黃酮提取量的影響

    由圖1可知,超聲提取、索氏提取、回流提取等3種方式提取的總黃酮含量具有顯著差異(p<0.05,下同),其中超聲提取效果最好(26.284 5 mg·g-1),可能是因為超聲提取強震動,增大物質(zhì)分子運動頻率與速度,增加溶劑穿透力,從而其總黃酮提取量高于索式提取和回流提取,后期試驗均采用超聲提取。

    2.1.2" 溶劑體積分數(shù)對總黃酮提取量的影響

    由圖2可知,甲醇提取的總黃酮含量低于乙醇提取的總黃酮含量。乙醇體積分數(shù)過低,枇杷葉總黃酮的提取量低;乙醇體積分數(shù)在0~40%時,總黃酮提取量隨著乙醇體積分數(shù)升高而升高;當(dāng)乙醇體積分數(shù)達到40%時,枇杷葉總黃酮提取量接近最高值(51.023 4 mg·g-1);乙醇體積分數(shù)超過40%后,枇杷葉總黃酮提取量呈顯著下降趨勢。說明乙醇體積分數(shù)低時,樣品溶出能力較弱,提取效果較差,總黃酮提取量較低;乙醇體積分數(shù)過高,由于總黃酮與乙醇極性相差較大,總黃酮不能溶解充分,或是乙醇體積分數(shù)過大,溶出更多雜質(zhì),導(dǎo)致總黃酮提取量低。因此,選取乙醇體積分數(shù)30%、40%、50%作為后續(xù)試驗水平。

    2.1.3" 料液比對總黃酮提取量的影響

    由圖3可知,在料液比1∶5至1∶25之間,隨著料液比的升高,總黃酮提取量呈升高趨勢,整體呈山峰狀,其中料液比為1∶25時,枇杷葉總黃酮提取量接近最高值(50.394 3 mg·g-1)。可能是由于溶劑過少,枇杷葉總黃酮無法完全溶解,從而影響提取量;當(dāng)溶劑過多時,多余的溶劑阻礙了枇杷葉與溶劑的溶解,導(dǎo)致提取量降低。因此,選取料液比1∶20、1∶25、1∶30作為后續(xù)試驗水平。

    2.1.4" 提取時間對總黃酮提取量的影響

    由圖4可知,提取時間在45~60 min時,隨著提取時間延長,總黃酮提取量增大;當(dāng)提取時間為60 min時,枇杷葉總黃酮提取量接近最高值(55.484 6 mg·g-1);時間超過60 min后,枇杷葉總黃酮提取量呈顯著下降趨勢??赡苁怯捎诳傸S酮溶出后容易被空氣氧化,或者超聲對溶出的總黃酮產(chǎn)生了破壞,導(dǎo)致總黃酮提取量降低。因此,提取時間45、60、75 min作為后續(xù)響應(yīng)試驗水平。

    2.1.5" 提取溫度對總黃酮提取量的影響

    由圖5可知,溫度在40~60 ℃時,總黃酮提取量隨溫度增高而增加;當(dāng)溫度達到60 ℃時,枇杷葉總黃酮提取量接近最高值(61.922 1 mg·g-1);溫度超過60 ℃后,枇杷葉總黃酮提取量呈顯著下降趨勢??赡苁怯捎跍囟壬?,物質(zhì)分子活躍度不斷增加,與枇杷葉得到充分接觸,促進總黃酮的溶解;溫度過高時,乙醇揮發(fā),分子結(jié)構(gòu)被破壞或揮發(fā),導(dǎo)致總黃酮提取量降低。因此,選取溫度50、60、70 ℃作為后續(xù)試驗水平。

    2.2" 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果分析

    2.2.1" 響應(yīng)面回歸模型建立

    根據(jù)單因素試驗結(jié)果,采用4因素3水平的響應(yīng)面中心試驗(見表2),運用Design-Expert 12分析,得到二次回歸方程模型:

    Y=66.11+6.34×A+5.44×B+4.99×C+5.02×D+2.37×AB+3.93×AB+3.93×AC+2.49×AD+2.88×BC-0.46×BD-0.35×CD-12.24×A2-13.93×B2-9.78×C2-12.36×D2

    由表3可知,模型F=51.365,p<0.001,模型極顯著,故對枇杷葉總黃銅提取量的影響較為顯著;失擬項F=4.67,p=0.075 3,失擬項不顯著,表明模型擬合程度良好。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.980 9,表明回歸方程相關(guān)性良好,校正決定系數(shù)R2Adj為0.961 8,說明模型可以解釋96.18%的總黃酮提取量變化,表明模型方程能夠較好地反映真實的試驗值。影響枇杷葉總黃酮提取的因素中,A、B、C、D、AC、A2、B2、C2和D2影響極顯著,BC交互作用影響顯著,都達到了統(tǒng)計學(xué)意義水平。由F值可以判斷出,四因素影響排序為:C>D>B>A。

    2.2.2" 交互作用分析

    交互作用分析如圖6,響應(yīng)曲面坡度及響應(yīng)面投影的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱,響應(yīng)曲面越陡及響應(yīng)面投影為橢圓形表示兩因素交互作用顯著,響應(yīng)曲面越平緩及響應(yīng)面投影為圓形則與之相反。

    從圖6中看出,料液比與提取時間的交互作用響應(yīng)曲面圖陡峭,響應(yīng)曲面投影為橢圓形,交互作用極顯著;乙醇體積分數(shù)與料液比響應(yīng)曲面圖較陡,投影為橢圓形,兩因素交互作用顯著;乙醇體積分數(shù)與料液比、提取溫度的響應(yīng)曲面投影中橢圓程度明顯,但交互作用較弱,未達到顯著水平,這與方差分析結(jié)果一致。

    2.2.3" 最佳提取工藝的驗證

    本試驗以總黃酮提取量為指標(biāo),得出枇杷葉總黃酮的最佳提取工藝為:乙醇濃度為47.323%,料液比為1∶26.3,提取時間為65.445 min,提取溫度為62.297 ℃,此條件下的提取量預(yù)測值為69.465 mg·g-1。結(jié)合實際情況,提取參數(shù)乙醇體積分數(shù)47%,料液比1∶26,提取時間66 min,提取溫度62 ℃,重復(fù)3次,實際測得枇杷葉總黃酮提取量為69.459 mg·g-1,這與理論預(yù)測值結(jié)果差異小。因此,該方法準確可靠。

    2.3" 枇杷葉總黃酮抗氧化活性分析

    2.3.1" DPPH清除能力

    由圖7可知,在0.1~0.8 mg·mL-1范圍內(nèi),枇杷葉總黃酮提取液有清除DPPH能力,隨著提取液濃度增加,清除能力提升,且上升趨勢緩慢,DPPH清除率為29.272%~34.396%,Trolox對DPPH的清除率隨著濃度增大而提升。Trolox的DPPH清除能力高于枇杷葉總黃酮的清除能力。通過分析可知,枇杷葉總黃酮對DPPH有清除能力,說明枇杷葉總黃酮成分有較好的抗氧化活性。

    2.3.2" ABTS+清除能力

    由圖8可知,在0.1~0.8 mg·mL-1濃度范圍內(nèi),枇杷葉總黃酮提取液有一定的ABTS+清除能力,清除能力隨著提取液濃度增加而提升,ABTS+清除率為11.545%~27.680%,Trolox對ABTS+的清除率隨著Trolox的濃度增大而提升,在相同濃度下,Trolox的ABTS+清除能力高于枇杷葉總黃酮的清除能力。通過分析可知,枇杷葉總黃酮對ABTS+有一定的清除能力,說明枇杷葉總黃酮成分有較好的抗氧化活性。

    3" 小結(jié)與討論

    黃酮成分多采用有機溶劑進行提取,本試驗對比了3種提取方式,發(fā)現(xiàn)超聲提取效果好、操作簡單,最終選用超聲提取。徐久婷等研究表明乙醇對枇杷葉主要功能成分提取效果良好,與本試驗結(jié)果一致[16]。本試驗結(jié)果得出枇杷葉總黃酮提取工藝條件為:參數(shù)設(shè)置為溶劑乙醇體積分數(shù)47%,料液比1∶26,提取時間66 min,提取溫度62 ℃,在此條件下,枇杷葉總黃酮提取量為69.459 mg·g-1。吳媛琳等對枇杷葉、枝條進行研究,所得枇杷葉提取率為枇杷枝條總黃酮提取率(3.21%)的2倍[20];高偉城等研究表明,不同產(chǎn)地的枇杷葉總黃酮提取量在6.21~14.23 mg·g-1[21]。本研究采用超聲提取法對枇杷葉總黃酮的提取量高于熱回流法[2],可能因為超聲輔助提取對樣品的破碎能力強,能夠讓物質(zhì)間充分接觸,使得黃酮類成分能更好地溶出。孫運奇等在水浴加熱條件下提取牡丹籽粕的總黃酮成分,所得總黃酮提取率為1.45%,結(jié)果乙醇體積分數(shù)為50%左右時,對牡丹籽粕的總黃酮提取效果最優(yōu)[22],本研究結(jié)果與其類似,進而說明并非乙醇體積分數(shù)越高,總黃酮有效成分溶出效果越好,這可能與乙醇和總黃酮的極性有關(guān)。

    有學(xué)者研究枇杷葉的多糖、多酚、總?cè)扑岬然钚猿煞郑⒕哂锌寡趸钚訹11,23-25]。張敏杰等對響應(yīng)曲面試驗后的石韋總黃酮提取物的抗氧化活性進行了比較,在石韋總黃酮最大質(zhì)量濃度下測得DPPH清除率為30%[26],本試驗枇杷葉在最大質(zhì)量濃度下測得的DPPH清除率為34.396%,表明不同物種不同質(zhì)量濃度下的抗氧化活性具有相似性?;粲詈降葘y得不同品種枇杷葉的ABTS+清除率最高達23.90%[11],本試驗枇杷葉總黃酮的ABTS+清除率為27.68%,說明重慶萬州的枇杷葉抗氧化活性可能更好,并且枇杷葉不同活性成分的抗氧化活性能力有相似性。余菲等[27]、陳海娟等[28]研究不同濃度下總黃酮對DPPH的清除能力優(yōu)于ABTS+清除能力,本試驗通過對DPPH和ABTS+清除自由基體外抗氧化活性進行測定,同樣發(fā)現(xiàn)枇杷葉總黃酮清除DPPH效果優(yōu)于清除ABTS+,這可能與兩者測定抗氧化能力的原理有關(guān),可能是枇杷葉中總黃酮的含量較低,后期也可進一步做純化試驗。本研究表明枇杷葉總黃酮提取物具有一定的抗氧化活性,但未進行不同月份、不同地區(qū)及不同品種的總黃酮含量及抗氧化活性比較,后續(xù)有必要進一步研究。

    基于響應(yīng)面法優(yōu)化提取枇杷葉總黃酮方法可靠,測得枇杷葉總黃酮提取量為69.459 mg·g-1,通過研究DPPH清除能力、ABTS+清除能力,表明枇杷葉總黃酮具有抗氧化活性,可開發(fā)枇杷葉在食品、中藥及化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用。

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    [27] 余菲,趙曉燕,周昌艷,等.不同品種生菜的多酚、黃酮差異比較與抗氧化活性[J].食品科學(xué), 2024,45(13):17-25.

    [28] 陳海娟,曾陽,張國燕,等.翁布總黃酮提取工藝的優(yōu)化及體外抗氧化研究[J].中國野生植物資源,2023,42(10):57-62.

    (責(zé)任編輯:易" 婧)

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