紅景天復(fù)合面膜的研制

為了研制具有多重皮膚生物活性的面膜，本研究將紅景天提取物、牛油果樹果脂、積雪草葉提取物、垂盆草提取物和透明質(zhì)酸進(jìn)行配伍，研制了紅景天復(fù)合面膜。試驗(yàn)采用單因素方法確定油相和乳化劑的主要輔料組成和用量；同時(shí)，采用酪氨酸酶活性抑制試驗(yàn)、DPPH自由基清除試驗(yàn)以及面膜對小鼠皮膚中水分和膠原蛋白的影響試驗(yàn)評估了紅景天面膜的生物活性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，所制備的面膜的各項(xiàng)檢測指標(biāo)均符合面膜的標(biāo)準(zhǔn)要求。此外，體外和小鼠試驗(yàn)也證實(shí)了面膜具有美白、抗氧化和抗皮膚衰老的三重生物活性。

關(guān)鍵詞：紅景天復(fù)合面膜；酪氨酸酶活性抑制；DPPH自由基清除；膠原蛋白

紅景天為景天科植物大花紅景天（Rhodiola crenulata （Hook. f. et Thoms.） H. Ohba）的干燥根和根莖，具有抗氧化和美白等護(hù)膚功效[1，2]。牛油果樹果脂是從牛油果果實(shí)中提取的天然植物油脂，在臨床上已經(jīng)證實(shí)對皮膚具有保濕和改善皮膚干燥的活性[3]。傘形科植物積雪草（Centella asiatica （L.） Urb）的干燥全草，具有極高藥用價(jià)值和較為廣泛的藥理活性，尤其在抗皮膚衰老、抗氧化，促進(jìn)膠原蛋白合成方面[4-6]。垂盆草為景天科植物垂盆草（Sedum sarmentosum）的干燥全草。垂盆草中黃酮和三萜類成分通過與過氧化物結(jié)合，具有較強(qiáng)的抗氧化功效[7]。透明質(zhì)酸具有良好的皮膚保濕效果，此外高分子透明質(zhì)酸還具有控油功效，低分子透明質(zhì)酸還具有促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞增殖作用[8，9]。

本研究以紅景天提取物、牛油果樹果脂、積雪草葉提取物、垂盆草提取物和透明質(zhì)酸（高、低分子量）作為活性原料，制備具有美白、抗氧化和抗皮膚衰老三重復(fù)合功效的面膜。具體研究如下：（1）單因素確定面膜最佳制備處方組成；（2）體外和小鼠實(shí)驗(yàn)評估面膜的美白（抑制酪氨酸酶活性）、抗氧化（DPPH自由基清除）和抗皮膚衰老（增加皮膚水分和膠原蛋白含量）；通過本研究，為化妝品中面膜制備提供參考。

Part 1

儀器與材料

BSA323S （精度0.001 g）電子天平（德國賽多利斯公司）；PR224ZHE型（精度0.0001g）電子天平（沙鷹科學(xué)儀器有限公司）；TS800 酶標(biāo)儀（美國安捷倫公司）；Ql-866型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；KQ5200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SiGmS高速冷凍離心機(jī)（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）；800D-1型離心機(jī)（常州天瑞儀器有限公司）；BIO-DL型移液槍（賽多利斯公司）；LHS-100F型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海精其儀器有限公司）；F6/10型電動(dòng)均漿機(jī)（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；高速剪切機(jī)J200-SH（上海精其儀器有限公司）；臺(tái)式面膜涂布機(jī)（蘇州愛可姆機(jī)械有限公司）； 96孔酶標(biāo)板（NEST biotechnology Co，Ltd.）。

紅景天苷對照品（純度：≥98%，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）；熊果苷（純度：≥98%，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）；維生素C （純度：≥98%，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）；海藻糖（Hayashibara Co.Ltd）；低聚果糖（山東白龍創(chuàng)園生物科技股份有限公司）；角鯊?fù)椋‥mpresa Figueirense de Pesca，Lda）；聚甘油-2油酸酯和聚甘油-10油酸酯（The Nisshin Oillio Group，Ltd）；霍霍巴籽油（Vantage Speciallty Chemicals，Inc）；液體石蠟（山東利爾康消毒科技有限公司）；羥乙基脲（Nouryon Surface Chemistry AB）；甘油（P&G Chemicals Asia）；吐溫-80 （南京威爾藥業(yè)股份有限公司）；司盤-60 （天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；紅景天提取物（云南英格生物技術(shù)有限公司）；牛油果樹果脂（VantageSpeciallty Chemicals，Inc）；積雪草葉提取物（奇華頓日用香精香料（上海）有限公司）；垂盆草提取物（百朗德（廣州）生物科技有限公司）；透明質(zhì)酸鈉（山東焦點(diǎn)福瑞達(dá)生物股份有限公司）、酪氨酸酶（美國Sigma公司）；L -酪氨酸上海麥克林生化科技有限公司）；DPPH （Shanghai Ruitai Biotechnology Co.， Ltd.）、D-半乳糖（美國Sigma公司）; 小鼠I型膠原蛋白ELISA kit （美國LSBio公司）;娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；PBS緩沖液、生理鹽水（天津市化工三廠有限公司）；乙醇為分析純（天津市化工三廠有限公司）。BALB/c Nude小鼠（SPF級，合格證號(hào)：2019-0010），并已通過倫理審批（倫理審批號(hào)BUCM-4-2019060515-1028）。

Part 2

試驗(yàn)方法

1.紅景天面膜制備

將海藻糖（1.0%）、低聚果糖（0.5%）和甘油（4.0%）3種水相輔料和5種活性原料混合，再加純凈水溶解之后，使用高速剪切機(jī)剪切，得到所需的溶液A。按處方量將角鯊?fù)椋?.2%）和霍霍巴籽油（0.5%）兩種油相輔料和三種表面活性劑聚甘油-2油酸酯（0.1%）、聚甘油-10油酸酯（0.2%）和羥乙基脲（1.0%）混合，得到溶液B。將溶液B加入到溶液A中，高速剪切機(jī)剪切，再按處方補(bǔ)足純凈水，攪拌均勻，得到所需的溶液C?？瞻啄げ伎焖偻ㄟ^低溫區(qū)（-30℃），進(jìn)行預(yù)凍。在預(yù)凍后的膜布上，涂布溶液C，涂布厚度為0.5 mm，上料質(zhì)量25g/片。涂布之后再次通過低溫冷凍，然后進(jìn)行裁切成大小合適的片材，裝入凍干機(jī)，真空度30 Pa，升華溫度40℃，升華時(shí)間2h，即得初始配方的紅景天復(fù)合面膜。

2.單因素試驗(yàn)

（1）油相霍霍巴籽油與液體石蠟對比

在多種油相配比中分別加入不同比例的霍霍巴籽油與液體石蠟，以此制備面膜樣品。以感官屬性、觸感和黏度作為主要評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，分析兩種油相添加劑對面膜性能的影響，并據(jù)此確定最終的油相配方成分。

（2）乳化劑配方組成

在不同乳化劑配方中分別加入不同用量的聚甘油-2油酸酯、聚甘油-10油酸酯、羥乙基脲組合與吐溫80或司盤80，制備面膜。本實(shí)驗(yàn)以乳液的穩(wěn)定性、面膜的黏度以及離心穩(wěn)定性作為關(guān)鍵評估指標(biāo)，分析不同乳化劑對面膜性能的影響。通過綜合評價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以確定最適宜的乳化劑組成與用量。

（3）單因素考查輔料用量

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)6個(gè)配方，分別考查不同油相和乳化劑用量對面膜的影響，最終確定配方最優(yōu)的輔料用量，不同配方設(shè)計(jì)見表1。

3.酪氨酸酶活性抑制試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)方法[10]，反應(yīng)體系為pH6.5的PBS緩沖液。配制2.5kU·L-1 酪氨酸酶和45.0g·L-1 L -酪氨酸溶液。陽性對照為熊果苷溶液（1mg·mL-1）。將面膜中活性原料用PBS緩沖液超聲溶解，按活性原料質(zhì)量計(jì)算，母液濃度為2mg·mL-1。在96孔酶標(biāo)板中加入供試樣品溶液（供試品溶液+4 μL，酪氨酸酶+80μL，L-酪氨酸溶液）、陰性溶液（酪氨酸酶-L-酪氨酸溶液）和空白溶液（供試品溶液+ L-酪氨酸溶液）。整個(gè)反應(yīng)體系為200μL，供試樣品終濃度分別為1600μg·mL-1、800μg·mL-1、400μg·mL-1、200μg·mL-1、100μg·mL-1、50μg·mL-1，溶液不足200μL加PBS緩沖液補(bǔ)充。試驗(yàn)于37℃震搖3min，溫孵20min，在492nm測吸光度（A）。以酪氨酸酶和L -酪氨酸生成黑色素量表示酪氨酸酶的活性。

以抑制率（%） = [（A陰性-A空白） - （A供試樣品-A空白）/（A陰性-A空白）×100%計(jì)算供試樣品對酪氨酸酶的抑制率。

4.抗氧化試驗(yàn)

抗氧化實(shí)驗(yàn)（DPPH自由基清除試驗(yàn)）主要參考相關(guān)的文獻(xiàn)研究[11，12]。先精密稱取DPPH，用無水乙醇溶解配置成50μg·mL-1溶液。陽性對照為維生素C溶液（濃度100μg·mL-1）。將面膜中活性原料用PBS緩沖液超聲溶解，按活性原料質(zhì)量計(jì)算，母液濃度為2mg·mL-1。在96孔酶標(biāo)板中加入200μL供試品溶液（供試品溶液+ 100μL DPPH）、陰性溶液（100μL DPPH+100μL無水乙醇）和空白溶液（供試品溶液+100μL無水乙醇/純凈水）。整個(gè)反應(yīng)體系為200μL，供試樣品終濃度分別為1000μg·mL-1、500μg·mL-1、250μg·mL-1、125μg·mL-1、62.5μg·mL-1、31.3μg·mL-1，溶液不足200μL加純凈水補(bǔ)充。渦旋使樣品混合均勻，再避光反應(yīng)30min，517nm下吸光度（A），平行三次試驗(yàn)，按照如下公式計(jì)算供試品對DPPH自由基的清除率。

自由基清除率（%） = [1- （A供試樣品- A空白）]/（A陰性- A空白）×100%。

5.對小鼠皮膚中水分和膠原蛋白的影響

參考文獻(xiàn)方法[13，14]，動(dòng)物分組與造模，雄性小鼠30只， 隨機(jī)分成5組，每組6只，分別為正常對照組，模型組，陽性對照組，給藥組。正常對照組小鼠背部每日貼敷空白面膜（不含活性原料的面膜基質(zhì)成分，面積3×2cm2）20min。模型組，陽性對照組和給藥組的小鼠在背頸部每日給予皮下注射10% D-半乳糖溶液1g·kg-1， 同時(shí)每天小鼠背部皮膚在波長400nm紫外光下照射40min，持續(xù)60天。從第10天開始，陽性對照組小鼠背部皮膚（面積3×2cm2）涂抹5%維生素E （VE）軟膏，給藥組小鼠背部每日分別貼敷面膜（面積3×2cm2）各20min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠。取小鼠背部面膜貼敷的皮膚組織，剪碎后置于組織勻漿器中，加入10倍量生理鹽勻漿，使組織充分破碎。勻漿液5000r·min-1離心10min，離心后的上清液備用，按試劑盒說明書操作測定皮膚I型膠原蛋白含量。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取適量背部貼敷面膜的皮膚采用干燥法檢測皮膚中含水量，參考文獻(xiàn)方法[13]，按如下公式計(jì)算。

皮膚含水率/ % = （干燥前皮膚質(zhì)量-干燥后皮膚質(zhì)量） /干燥前皮膚質(zhì)量×100計(jì)算皮膚含水率。

6.數(shù)據(jù)分析

單因素方差分析（Tukey-Kramer HSD檢驗(yàn)）比較均值，以p＜0.05（*）或p＜0.01（**）表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對酪氨酸酶的抑制和DPPH清除能力采用IC50評估，計(jì)算各個(gè)濃度供試樣品的抑制活性和清除率，采用四參數(shù)Logistic擬合計(jì)算。

E=Emax+（Emin-Emax）/（1+EXP（a×（LogC-LogIC50）， Emax和Emin分別代表擬合最大和最小效應(yīng)；C代表供試樣品最終濃度；a代表擬合斜率），通過JMP軟件（版本16.0.0）求解IC50。本研究中數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均由JMP 11.0.0平臺(tái)實(shí)現(xiàn)（SAS Institute Inc.）。

Part 3

結(jié)果

1.單因素試驗(yàn)

配方單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示面膜的最佳配方組成為角鯊?fù)?0.2%、霍霍巴籽油2.0%、聚甘油-2油酸酯0.1%、聚甘油-10油酸酯0.2%、羥乙基脲5.0%和甘油2.0%，按此配方制備面膜檢測結(jié)果如表2所示。

因此，可確定紅景天復(fù)合面膜最終配方如表3所示。

2.體外功效試驗(yàn)

（1）酪氨酸酶抑制活性研究

由表4可知，在所測試的濃度范圍之內(nèi)，紅景天面膜提取液對酪氨酸酶抑制率隨濃度的增加而增加，在濃度為1600μg·mL-1時(shí)達(dá)到最大， 與對照組熊果苷相比無顯著性差異（p>0.05），表明在此濃度下二者對酪氨酸酶抑制率基本相當(dāng)。計(jì)算紅景天面膜提取液對酪氨酸酶抑制的IC50值為218.8μg·mL-1。

（2） DPPH自由基清除研究

由表5可知，在所測試的濃度范圍之內(nèi)，紅景天面膜提取液對DPPH的清除率隨濃度的增加而增加，在濃度為500μg·mL-1時(shí)達(dá)到最大， 與對照組維生素C相比無顯著性差異（p>0.05），表明二者對DPPH清除能力基本相當(dāng)。計(jì)算紅景天面膜提取液對DPPH的清除能力的IC50值為199.5μg·mL-1。

3.對小鼠皮膚的含水量和I型膠原蛋白含量影響

表6顯示了紅景天復(fù)合面膜對小鼠皮膚中含水量和膠原蛋白含量的影響。與正常對照組相比，模型組小鼠皮膚的含水量和膠原蛋白含量均顯著下降（P<0.01）；與模型組相比較，VE組的皮膚含水量和膠原蛋白含量均顯著升高（P<0.01），這說明模型建立成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅景天復(fù)合面膜能顯著增加小鼠皮膚含水量（P<0.01）和膠原蛋白含量（P<0.05），面膜對衰老皮膚的改善效果與VE組類似。

Part 4

結(jié)論

本研究首次將多種對皮膚具有生物活性的可用于化妝品的原料進(jìn)行配伍，研制了紅景天復(fù)合面膜，并通過體外和小鼠實(shí)驗(yàn)對面膜的四種主要生物活性進(jìn)行了評價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紅景天復(fù)合面膜表現(xiàn)出良好的美白效果（抑制酪氨酸酶活性）、抗氧化能力（DPPH自由基清除）以及抗皮膚衰老特性（增加皮膚水分和膠原蛋白含量）。此外，紅景天復(fù)合面膜各項(xiàng)檢測指標(biāo)均符合QB/T2872—2007《中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》。本研究為其他面膜配方的研制和活性評價(jià)提供了可借鑒的思路和方法。

作者介紹

李和偉：博士，高級工程師，主要研究方向：化妝品和生物醫(yī)藥研究，供職于常州偉博海泰化妝品有限公司

代 穎，魏國志：供職于常州偉博海泰化妝品有限公司

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