響應(yīng)面法優(yōu)化提取小米椒木犀草素的工藝

收稿日期：2023-07-18

基金項(xiàng)目：福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目（科技類）（JT180827）；福建省級(jí)一流本科專業(yè)建設(shè)項(xiàng)目（SJZY -2020-02）

作者簡(jiǎn)介：謝君銓（1988-），男，福建三明人，講師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物開發(fā)與研究工作，（電話）13506961820（電子信箱）xiejunquan@mku.edu.cn。

謝君銓，馮慶玲，謝勇武. 響應(yīng)面法優(yōu)化提取小米椒木犀草素的工藝［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，63（7）：141-146，249．

摘要：以小米椒為原材料，采用超聲輔助提取法，以木犀草素提取率為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)探究料液比、乙醇濃度、浸提時(shí)間和浸提溫度對(duì)木犀草素提取率的影響，并以響應(yīng)面分析方法進(jìn)行工藝優(yōu)化。結(jié)果表明，小米椒中木犀草素的最佳提取工藝條件為浸提溫度52.3 ℃、料液比1∶50、乙醇濃度97%、浸提時(shí)間20 min。在此提取條件下提取率為1.641%，與理論值對(duì)比，偏差-0.061%。利用牛津杯法測(cè)試木犀草素的抑菌活性，結(jié)果表明木犀草素提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有抑菌效果，對(duì)大腸桿菌無(wú)抑菌效果。

關(guān)鍵詞：小米椒；木犀草素；超聲提取法；響應(yīng)面法；抑菌

中圖分類號(hào)：TQ28 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）07-0141-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.07.023 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimization of extraction of luteolin from millet pepper by response surface methodology

XIE Jun-quan，F(xiàn)ENG Qing-ling，XIE Yong-wu

（School of Life Science and Chemistry， Minnan Science and Technology College， Quanzhou 362332，F(xiàn)ujian，China）

Abstract： With millet pepper as raw material， ultrasonic-assisted extraction was used to extract luteolin， and the extraction rate of luteolin was used as the index. The effects of material to liquid ratio， ethanol concentration， extraction time and extraction temperature on the extraction rate of luteolin were investigated through single factor experiment， and the process was optimized by the response surface analysis method. The results showed that the optimum extraction condition of luteolin from millet pepper was extraction temperature of 52.3 ℃， material to liquid ratio of 1∶50， ethanol concentration of 97%， and extraction time of 20 min. Under this extraction condition， the extraction rate was 1.641%， with a deviation of -0.061% compared with the theoretical value. The antibacterial activity of luteolin was tested by the Oxford cup method. The results showed that luteolin extract had a bacteriostatic effect on Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis， but had no bacteriostatic effect on Escherichia coli.

Key words：millet pepper；luteolin；ultrasonic extraction method；response surface methodology；antibacterial

木犀草素是一種存在于許多植物中的天然黃酮類化合物。隨著對(duì)木犀草素的研究，人們發(fā)現(xiàn)木犀草素具有抗氧化［1］、抗腫瘤［2，3］、抑菌性［4］、抗炎癥性脫髓鞘疾?。?］等功能，可應(yīng)用在保健品、制藥業(yè)等領(lǐng)域。因此，對(duì)木犀草素的提取工藝研究不僅具有社會(huì)意義，還具有經(jīng)濟(jì)效益。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)木犀草素的抗癌、抗氧化效果具有很高的關(guān)注度。研究表明，木犀草素通過(guò)抗氧化活性誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞死亡，因此成為一種可以對(duì)抗癌癥的抑癌藥劑［6］。

木犀草素廣泛存在于多種中藥植物如白毛夏枯草、金銀花以及一些蔬菜果實(shí)中，如芹菜、甜椒、辣椒和花生等［7］。王智儀等［8］采用連續(xù)萃取法從花生殼中提取木犀草素，含量可達(dá)0.32 mg/g。唐付杰等［9］采用響應(yīng)面法優(yōu)化水熱酸控提取紫蘇梗中木犀草素，提取率為（901.049±0.60）μg/g。趙丹等［10］采用HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地白毛夏枯草中木犀草素的含量，結(jié)果表明不同地區(qū)的白毛夏枯草中的木犀草素含量存在差異。

小米椒易種植，出苗率很高，生長(zhǎng)周期短，且產(chǎn)率高。關(guān)于小米椒中木犀草素的提取還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，選用小米椒來(lái)提取木犀草素原材料易得。目前，常用提取木犀草素的方法為醇提熱回流法，該方法雖然能提高提取效率，但同時(shí)存在高耗時(shí)、高生產(chǎn)成本的特點(diǎn)［11，12］。超聲輔助提取技術(shù)能很好地改進(jìn)醇提熱回流法的弊端。利用超聲波的高頻震動(dòng)促使溶質(zhì)中的有效成分快速溶解在溶劑中，從而提高提取率，并有效防止高溫對(duì)有效成分的破壞，且提取時(shí)間短、成本也較低［13，14］。本研究采用超聲輔助提取結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化不同提取條件對(duì)木犀草素提取率的影響，為后續(xù)小米椒的應(yīng)用研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米椒：產(chǎn)自于福建省三明市，洗凈后于60 ℃干燥箱中烘干，機(jī)械粉碎后過(guò)60目篩備用；木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品（98%），上海麥克林生化科技有限公司；無(wú)水乙醇、氯化鋁（六水）、乙酸鉀、氯化鈉（AR），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛肉膏（BR），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨（BR），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

試驗(yàn)菌株：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）取自閩南科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ-400E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TDL-40B型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；PL203型電子精密天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；V-1100D型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；LRH-150型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備參考高山等［15］關(guān)于萬(wàn)壽菊木犀草素提取工藝優(yōu)化的研究，測(cè)定波長(zhǎng)選擇405 nm，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，橫坐標(biāo)為木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度，縱坐標(biāo)為木犀草素的吸光度，得到木犀草素的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.090 1x-0.003 5。相關(guān)性系數(shù)R2=0.999 3，因此曲線有良好的線性關(guān)系。

1.3.2 木犀草素待測(cè)液制備 精確稱取一定量的小米椒粉末，按一定比例加入相應(yīng)濃度的乙醇溶液，超聲10 min后，放入提前準(zhǔn)備好的一定溫度的恒溫水浴鍋中進(jìn)行浸提，過(guò)程中適當(dāng)攪拌，以提高提取液與物料的接觸，提高浸出率，浸提結(jié)束后采用高速離心的方法分離浸提液，定容后測(cè)定其吸光度。

1.3.3 木犀草素的測(cè)定方法 在25 mL容量瓶中加入上清液定容至刻度，備用。并于50 mL容量瓶中加入上述溶液2 mL，定容后測(cè)定吸光度，利用回歸方程計(jì)算木犀草素的濃度。

木犀草素的提取率計(jì)算公式參考鐘方麗等［16］的計(jì)算方法。

R=（n×C×[V106][M]）×100% （1）

式中，R為木犀草素的提取率（%）；n為稀釋倍數(shù)；C為測(cè)得的木犀草素濃度（μg/mL）；V為樣液體積（mL）；M為樣品總質(zhì)量（g）。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 精確稱取烘干后粉碎的小米椒粉末5份，設(shè)置不同乙醇濃度（70%、80%、90%、95%、100%）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、浸提溫度（20、40、60、70、80 ℃）、浸提時(shí)間（10、20、30、40、50 min），研究各單因素對(duì)木犀草素提取率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇濃度、料液比、浸提時(shí)間、浸提溫度4個(gè)因素為自變量，選取單因素提取率較高的3個(gè)水平，以木犀草素提取率作為響應(yīng)值，分析各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平見(jiàn)表1。

1.3.6 木犀草素的抑菌試驗(yàn) 1）木犀草素的提取、濃縮方法。采用響應(yīng)面分析得到的最佳條件進(jìn)行木犀草素提取，得到的粗提液于4 000 r/min離心15 min，取上清液。將提取好的樣液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，打開冷凝水，設(shè)定溫度為43 ℃，轉(zhuǎn)速為65 r/min進(jìn)行濃縮。濃縮結(jié)束后將濃縮液放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2）試驗(yàn)用培養(yǎng)基。所用培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

3）菌種的活化及母種制備。將供試菌（枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌）的斜面進(jìn)行畫線分離，并培養(yǎng)24 h。取250 mL三角錐瓶裝50 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，再用接種環(huán)分別取1環(huán)或2環(huán)供試菌到液體培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)24 h備用。

4）抑菌試驗(yàn)。木犀草素粗提液的抑菌效果測(cè)試操作步驟參考孫長(zhǎng)花等［17］的牛津杯法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 木犀草素提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)木犀草素提取率的影響 由圖2可知，料液比在1∶10至1∶40時(shí)，隨著溶劑體積的增加，木犀草素的提取率也在不斷提高，料液比在1∶40時(shí)提取率達(dá)1.14%，之后再提高溶劑比例提取率有所下降。這是因?yàn)樘岣呷軇┍壤黾恿斯桃旱臄U(kuò)散面積，在提取時(shí)就能增加固液相的相對(duì)運(yùn)動(dòng)速率，從而提高浸出速率，繼續(xù)提高溶劑比例，會(huì)使木犀草素提取率下降，這與傳質(zhì)理論相吻合［18］。結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果和考慮經(jīng)濟(jì)效益選用1∶40作為提取料液比。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)木犀草素提取率的影響 由圖3可知，小米椒木犀草素提取率隨乙醇溶度的提高，提取率不斷提高，乙醇濃度在95%和100%下提取率分別為1.36%和1.39%。當(dāng)乙醇濃度為100%時(shí)，相較于乙醇濃度在70%～95%時(shí)木犀草素提取率的增幅有所下降。這可能是因?yàn)槟鞠菟氐姆肿咏Y(jié)構(gòu)中有2個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)通過(guò)1個(gè)成環(huán)的C3相互連接而成，屬于弱極性化合物，同時(shí)木犀草素還是一種平面性較強(qiáng)的分子，各分子間排列緊密，引力較大，故難溶于水［12］。根據(jù)有機(jī)物相似相溶的原理，木犀草素隨著乙醇濃度的升高，其提取率增大。當(dāng)乙醇濃度達(dá)95%時(shí)，浸提液中有許多其他成分如辣椒紅素、胡蘿卜素、蛋白質(zhì)等也被提取出來(lái)，影響了木犀草素的溶出，使得木犀草素提取率增幅減弱［19］。結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果選用95%作為乙醇提取濃度。

2.1.3 浸提時(shí)間對(duì)木犀草素提取率的影響 由圖4可知，浸提時(shí)間為30 min時(shí)，小米椒粉末中木犀草素提取量達(dá)到最大，為1.32%。在浸提時(shí)間為10～30 min時(shí)，由于木犀草素溶出需要一定時(shí)間，溶液中溶質(zhì)的濃度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，濃度不斷提高，當(dāng)?shù)竭_(dá)臨界值時(shí)溶質(zhì)濃度不再升高。在30～50 min時(shí)，由于木犀草素在長(zhǎng)時(shí)間的加熱過(guò)程中部分氧化，導(dǎo)致提取率下降。結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果選用30 min作為提取時(shí)間。

2.1.4 浸提溫度對(duì)木犀草素提取率的影響 由圖5可知，溫度在20～60 ℃時(shí)，由于溫度的升高分子間的作用力會(huì)在熱運(yùn)動(dòng)下增加固液兩相的相對(duì)運(yùn)動(dòng)速率，溶液湍動(dòng)越劇烈，提取速率越快，在60 ℃時(shí)提取率達(dá)1.58%。繼續(xù)升高溫度，木犀草素分子由于熱不穩(wěn)定性發(fā)生降解，提取率快速下降［20］。結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果選用60 ℃作為提取溫度。

2.2 木犀草素提取的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素（乙醇濃度、料液比、浸提時(shí)間、浸提溫度）試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇4個(gè)因素及3個(gè)適合的水平進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果采用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析木犀草素提取的最優(yōu)工藝條件。響應(yīng)曲面優(yōu)化見(jiàn)表2。

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn) 利用Desgin-Expert8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析，得到木犀草素提取的二次回歸擬合方程：Y=1.540 - 0.013A + 0.053B + 0.260C + 6.917 × 10-3D + 0.028AB - 0.012AC + 0.040AD - 0.073BC - 0.026BD - 3.500 × 10-3CD - 0.039A2 - 0.017B2 - 0.220C2 + 6.333 ×10-4D2，（R2=0.958 5，P<0.000 18rribUKsABgnAAQRQRIKLQ==）。采用響應(yīng)面的ANOVN進(jìn)行方差分析見(jiàn)表3。

由表3可知，該模型F為22.82>0.05，表明該模型意義重大。Adeq Precision是測(cè)量信噪比，Adeq Precision的值為15.378>4，說(shuō)明其比例是理想的，表明這個(gè)模型可以用來(lái)導(dǎo)航設(shè)計(jì)。各因素的均方值可以體現(xiàn)出各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值木犀草素提取率的重要性，均方值越大，表明對(duì)響應(yīng)值的影響程度越大。各因素對(duì)小米椒粉末中木犀草素的影響程度表現(xiàn)為C>B>A>D，即乙醇濃度>料液比>浸提溫度>浸提時(shí)間。

2.2.3 響應(yīng)面相互作用分析 通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)結(jié)合軟件分析得到各因素相互作用的響應(yīng)面和等高線。通過(guò)響應(yīng)面和等高線可知該因素對(duì)木犀草素提取率的影響變化。在響應(yīng)面中，因素之間的相互作用越顯著，則響應(yīng)面的坡度越陡峭；響應(yīng)面的坡度越平穩(wěn)，則因素之間的相互作用影響越小。在等高線中，等高線呈橢圓形，說(shuō)明因素之間的相互作用顯著；若呈圓形，則說(shuō)明因素之間的相互作用不顯著。也可通過(guò)顏色變化反映出交互作用的顯著性。響應(yīng)面或等高線的顏色變化越快，說(shuō)明因素之間的相互作用影響越大，即對(duì)提取率影響更為顯著［21］。根據(jù)上述等高線的性質(zhì)分析所有等高線，得到料液比與乙醇濃度存在明顯的交互效應(yīng)，其他因素交互效應(yīng)不明顯。試驗(yàn)具有代表性的響應(yīng)面和等高線如圖5至圖7所示。

由圖5和圖6響應(yīng)面可以看出，圖5響應(yīng)面中浸提溫度的坡度對(duì)于料液比的坡度而言相對(duì)緩和，說(shuō)明浸提溫度的二次項(xiàng)對(duì)提取率的影響小于料液比；圖6響應(yīng)面中乙醇濃度的坡度對(duì)于浸提溫度的坡度而言相對(duì)陡峭，說(shuō)明乙醇濃度的二次項(xiàng)對(duì)提取率有明顯的影響，浸提溫度相對(duì)來(lái)說(shuō)影響較小。從圖5和圖6等高線可以看出，圖5等高線呈橢圓形，圖6等高線趨于圓形，說(shuō)明料液比與浸提溫度相互作用對(duì)木犀草素提取率的影響大于乙醇濃度與浸提溫度相互作用對(duì)木犀草素提取率的影響，這與方差分析結(jié)果一致。其他響應(yīng)面和等高線也可作類似分析。

圖7的響應(yīng)面坡度陡峭、顏色變化速度快且等高線呈橢圓形，說(shuō)明因素間的交互作用顯著。當(dāng)溶劑體積較小時(shí)，等高線排列比較密集，說(shuō)明溶劑體積較小時(shí)，提高乙醇濃度能明顯提高木犀草素的提取率，乙醇濃度對(duì)木犀草素的提取率影響顯著。而當(dāng)溶劑體積較大時(shí)，等高線排列比較疏松，說(shuō)明在溶劑體積較大時(shí)，即使提高乙醇濃度，木犀草素的提取率也得不到明顯提高。說(shuō)明這2個(gè)因素互相抑制，與回歸方程中 BC項(xiàng)系數(shù)為負(fù)號(hào)相符。

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)，得到的最佳理論提取工藝條件為浸提溫度52.31 ℃、料液比1∶50、乙醇濃度97.15%、浸提時(shí)間20 min。在此工藝條件下提取率為1.642%。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 為了檢驗(yàn)該回歸模型是否準(zhǔn)確，結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)條件將響應(yīng)面得出的最佳工藝條件調(diào)整為浸提溫度52.3 ℃、料液比1∶50、乙醇濃度97%、浸提時(shí)間20 min，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。木犀草素的平均提取率為1.641%，與預(yù)測(cè)的值擬合，證明該模型設(shè)計(jì)合理。

2.3 木犀草素抑菌性試驗(yàn)結(jié)果

從表5可以看出，木犀草素粗提液對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均具有一定的抑菌效果，而對(duì)大腸桿菌沒(méi)有抑菌效果，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器對(duì)粗提液適當(dāng)濃縮后金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌的抑菌效果明顯提高。這與楊洋等［22］研究的花生殼木犀草素的提取及其抑菌性能研究結(jié)果一致，木犀草素對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有抑菌效果，其抑菌機(jī)制主要是通過(guò)抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，進(jìn)而影響菌體核酸及蛋白質(zhì)的合成來(lái)實(shí)現(xiàn)的［23］。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)以小米椒為研究對(duì)象，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法確定小米椒中木犀草素的最優(yōu)提取工藝為浸提溫度52.3 ℃、料液比1∶50、乙醇濃度97%、浸提時(shí)間20 min。在此工藝條件下提取率為1.641%。木犀草素粗提液對(duì)金黃色葡萄球菌、 枯草芽孢桿菌有抑菌效果，對(duì)大腸桿菌沒(méi)有抑菌效果。

利用木犀草素的生物活性制備藥物的研究相對(duì)較少?；诒驹囼?yàn)的結(jié)果，后續(xù)研究還可以用超聲輔助提取、酶試劑法二者聯(lián)合起來(lái)對(duì)木犀草素提取工藝進(jìn)行研究，如能找到最優(yōu)的提取結(jié)果，并使其工藝流程條件能應(yīng)用于大批生產(chǎn)制造，不僅可以有效利用小米椒，增加其作為食品的附加值，還可以促進(jìn)醫(yī)療行業(yè)的發(fā)展。

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