陜西省核桃黑斑病新病原的鑒定及室內(nèi)藥劑篩選

收稿日期：2024-02-21

基金項目：陜西林業(yè)科技創(chuàng)新重點專項（SXLK2022-02-10）；楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院院內(nèi)基金項目（ZK 22-48）；陜西省自然科學(xué)基金項目（2023-JC-YB-209）

作者簡介：雷 瓊（1977-），女，湖北京山人，副教授，碩士，主要從事植物病理學(xué)研究，（電話）13474052493（電子信箱）1148406220@qq.com。

雷 瓊，林 鑫，王文俊，等. 陜西省核桃黑斑病新病原的鑒定及室內(nèi)藥劑篩選［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，63（7）：67-71，238．

摘要：分離田間紅仁核桃（Juglans regia ‘Robert Livermore’）病葉上的黑斑病病原細菌，通過科赫氏試驗明確致病菌，并通過病原菌生化試驗以及分子生物學(xué)技術(shù)明確病原菌的分類學(xué)地位。結(jié)果表明，從紅仁核桃的田間核桃病葉中分離到23株菌落形態(tài)一致的細菌菌株，從中隨機選取菌株進行科赫氏回接試驗?zāi)芤鸺t仁核桃葉片發(fā)病，通過生理生化表型試驗，結(jié)合基于16S rDNA、gyrB、rpoD基因序列的多位點序列分析，將該病原鑒定為扁桃假單胞菌（Pseudomonas amygdali）。隨后對12種藥劑進行室內(nèi)毒力測定，篩選出的6種藥劑對該病原菌具有明顯抑制作用。其中，四霉素抑菌效果最好，EC50為50.353 4 μg/mL，其他藥劑抑菌效果表現(xiàn)為中生菌素>春雷霉素>噻菌酮>噻唑鋅>氫氧化銅。

關(guān)鍵詞：紅仁核桃（Juglans regia ‘Robert Livermore’）；核桃黑斑病；扁桃假單胞菌（Pseudomonas amygdali）；新病原；室內(nèi)藥劑篩選；陜西省

中圖分類號：S436.64 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）07-0067-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.07.010 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Identification of new pathogen of walnut black spot disease in Shaanxi Province and screening of laboratory agents

LEI Qiong1， LIN Xin2， WANG Wen-jun3， QU Jia-nan3， ZHANG Zhi-you3

（1.Yangling Vocational & Technical College， Yangling 712100，Shaanxi，China；2.Center for Returning Farmland to Forestry and Grassland， Shangluo 726000，Shaanxi，China；3.Shangluo Walnut Research Institute of China， Shangluo 726000， Shaanxi，China）

Abstract： The pathogenic bacteria of black spot disease on the diseased leaves of Juglans regia ‘Robert Livermore’ were isolated， and the pathogenic bacteria were identified by Koch’s test， and the status of the pathogenic bacteria in taxonomy was determined by pathogen biochemical tests and molecular biology techniques. The results showed that 23 bacterial strains with the consistent colony morphology were isolated from the diseased leaves of the red kernel walnut in the field， and Koch’s tieback test was performed on randomly selected strains to cause the disease of red kernel walnut leaves. Through physiological and biochemical phenotype tests， combined with multi-site sequence analysis based on 16S rDNA， gyrB and rpoD gene sequences， the pathogen was identified as Pseudomonas amygdali. Then 12 kinds of agents were tested for indoor toxicity， and 6 agents having an obvious inhibitory effect on the pathogen were screened out. Among them， tetramycin had the best bacteriostatic effect， with an EC50 of 50.353 4 μg/mL， and the bacteriostatic effect of other agents was zhongshengmycin > kasugamycin > thiodiazole-copper > thiazole zinc > copper hydroxide.

Key words： Juglans regia ‘Robert Livermore’； walnut black spot disease； Pseudomonas amygdali； new pathogens； screening of laboratory agents； Shaanxi Province

核桃（Juglans regia L.）屬于核桃科核桃屬植物，富含各種不飽和脂肪酸、維生素和蛋白質(zhì)［1，2］，具有較高的營養(yǎng)價值，是中國重要的經(jīng)濟林木。商洛市位于陜西省東南部，獨特的氣候和地理條件使商洛市成為核桃最佳適生區(qū)之一，榮獲中國核桃之都、陜西省核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展強市等稱號［3］。為發(fā)展核桃產(chǎn)業(yè)，商洛市引進種植了紅仁核桃（Juglans regia ‘Robert Livermore’），與傳統(tǒng)核桃相比，紅仁核桃果仁皮色鮮紅，口感酥脆香甜，富含花色苷，具有較高的營養(yǎng)價值和醫(yī)療保健作用［4］。但是，近年來中國核桃黑斑病逐年嚴重，對核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展影響巨大。

核桃黑斑病是全球核桃產(chǎn)業(yè)中的重要病害，不僅為害核桃葉片，而且會侵染花、枝條、嫩梢等，嚴重時造成產(chǎn)量損失達80%［5，6］。核桃黑斑病的主要病原菌是革蘭氏陰性細菌樹生黃單胞菌致病變種（Xanthomonas arboricola pv. juglandis）［7，8］。有學(xué)者報道其他細菌也可以引起核桃黑斑病，例如Xanthomonas campestris，Pantoea agglomerans［9-13］。瞿佳等［14］研究發(fā)現(xiàn)陜西省核桃黑斑病是由Xanthomonas campestris和Pantoea agglomerans復(fù)合侵染引起。李亞等［15］研究發(fā)現(xiàn)在云南省不同地區(qū)引起核桃黑斑病的Pantoea agglomerans在進化上位于不同分支，對同種藥劑的抗性也存在差異。說明不同地區(qū)引起核桃黑斑病的病原菌存在差異，并且同種病原菌間也存在遺傳分化。因此，明確細菌性黑斑病的病原菌種類對核桃黑斑病的防治具有重要意義。本試驗通過病原菌分離、致病性測定以及病原細菌的表型特征和多基因聯(lián)合分析，鑒定了引起陜西省商洛市紅仁核桃黑斑病的病菌種類，并篩選獲得高效防治藥劑，為該病害的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

病害樣品采集于陜西省商洛市商州區(qū)板橋鎮(zhèn)袁河村，該村毗鄰G40滬陜高速，與省道相通。該基地種植7 hm2紅仁核桃，樹齡5年，株行距5 m×6 m，種植密度330棵/hm2。選取典型病害樣本并拍照記錄。

1.2 病原菌分離

選取田間核桃發(fā)病病葉，取發(fā)病-健康交界處約1 cm2，使用75%乙醇溶液對其進行表面消毒 1 min，使用無菌水清洗葉片3次后置于滅菌研缽內(nèi)研磨，加入1 mL滅菌0.9% NaCl溶液混勻后靜置 10 min。等待液體沉淀后取適量上清液稀釋，并在LB固體培養(yǎng)基上涂布，封口后在28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。待LB固體培養(yǎng)基長出單菌落后，根據(jù)不同的菌落形Dkg8eHMvaYmYkPwhw0uwoQ==態(tài)對不同的菌劃線純化后接種于試管斜面，置于4 ℃冰箱保存待用。

1.3 煙草過敏性壞死反應(yīng)

將上述保存的細菌在LB固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，待長出單菌落后挑取并接種于裝有3 mL LB液體培養(yǎng)基的10 mL無菌試管中，于28 ℃、180 r/min過夜搖培至對數(shù)期。用滅菌0.9% NaCl溶液進行重懸至濃度為OD600 nm=0.1的細菌懸浮液，通過無菌醫(yī)用1 mL注射器將細菌懸浮液注入到4～5周齡的本氏煙葉中，觀察試驗細菌是否引起煙草過敏性壞死反應(yīng)，設(shè)置3次重復(fù)。

1.4 致病性測定

病原菌致病性測定采用針刺法接種［14］。細菌懸浮液制備方法同“1.3”，利用無菌醫(yī)用1 mL注射器吸取少量懸浮液，直接穿刺健康紅仁核桃葉片，接種后的葉片覆蓋保鮮膜，置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，以接種滅菌0.9% NaCl溶液為對照，每個處理重復(fù)5次，每日對發(fā)病情況進行觀察統(tǒng)計。

1.5 菌株生理生化鑒定

測定分離細菌的生理生化性狀，具體方法參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第8版）［16］和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［17］。

1.6 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

采用細菌基因組DNA小量純化試劑盒（康為世紀CW0552）提取菌株基因組DNA。16S rDNA擴增引物（正向：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。gyrB擴增引物（正向：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′；反向：5′-AGCAGGG TACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGT?AT-3′）。rpoD擴增引物（正向：5′-ACGACTGACCCGGTACGCATGTAYATGMGNGARATGGGNACNGT-3′；反向：5′-ATAGAAATAACCAGACGTAAGTTNGCYTCNACCATYTCYTTYTT-3′）［18，19］。50 μL反應(yīng)體系：DNA模板1.0 μL（10 ng/μL），Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme P505）1 μL，2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix 1 μL，上下游引物各2 μL，ddH2O補足至50 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，55 ℃ 退火15 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃終延伸5 min；4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物與pMDTM 19-T載體（TAKARA 6013）連接，通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化將載體轉(zhuǎn)入至大腸桿菌感受態(tài)細胞（擎科生物TSC-C01），隔日通過PCR驗證后，將陽性克隆送至擎科生物科技有限公司測序。測序結(jié)果上傳至GeneBank核酸數(shù)據(jù)庫進行同源比對分析，通過多位點序列分析（Multilocus sequence analysis，MLSA），將16S rDNA、gyrB、rpoD 3個基因串聯(lián)后使用Mega7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹以明確病原菌的分類學(xué)地位［20］。

1.7 供試藥劑

0.3%四霉素，遼寧微科生物工程股份有限公司；12%中生菌素，中國儂易施生物科技有限公司；20%春雷霉素，四川海潤作物科學(xué)技術(shù)有限公司；20%噻菌銅，浙江龍灣化工有限公司；30%噻唑鋅，浙江新農(nóng)化工股份有限公司；46%氫氧化銅，美國杜邦公司；8%寧南霉素，佛山市盈輝作物科學(xué)有限公司；80%乙蒜素、12%松脂酸銅，海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司；20%乙酸銅，山東濰坊雙星農(nóng)藥有限公司；10%苯醚甲環(huán)唑，先正達南通作物保護有限公司；12.5%腈菌唑，深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司。

1.8 供試藥劑初篩

將測試菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h。通過濾紙片抑菌圈法對上述供試藥劑進行初篩：用打孔器將定性濾紙裁剪成6 mm的圓形紙片，將裁剪好的圓形濾紙片高壓滅菌后烘干備用。將供試藥劑利用丙酮溶解，并用含體積分數(shù)0.1%吐溫-80溶液的無菌水稀釋成100 μg/mL的藥液。將滅菌后的含2%瓊脂LB液體培養(yǎng)基冷卻至40 ℃，加入體積分數(shù)5%的菌液混勻后倒入平板。將制備好的無菌濾紙片（6 mm）分散平放在平板上，再在濾紙片上分別滴加8 μL供試藥劑，以丙酮為空白對照，每組重復(fù)3次。待藥劑晾干后，將培養(yǎng)皿于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，24 h后觀察是否出現(xiàn)明顯抑菌圈。

1.9 藥劑抑菌率測定

選取上述試驗結(jié)果中有抑制效果的藥劑粉劑，用丙酮溶解，每種藥劑制備5個不同的濃度梯度。吸取50 μL經(jīng)28 ℃過夜搖培的新鮮細菌菌液轉(zhuǎn)接于含3 mL LB液體培養(yǎng)基的10 mL滅菌試管中，并添加相應(yīng)濃度的藥劑，以溶劑丙酮為對照，每個濃度設(shè)置3次重復(fù)。于28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)2 d后，從各個試管中吸取2 mL菌懸液置于石英比色皿中，通過紫外分光光度計測定菌液在波長600 nm處的吸光度（OD600 nm），計算不同濃度藥劑處理下的細菌生長抑制率。抑制率Y=（OD1-OD2）/OD1，其中，OD1為丙酮對照的OD，OD2為藥劑處理的OD，并依據(jù)抑制率計算藥劑毒力回歸方程、半數(shù)有效濃度（EC50）［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離和致病性測定

采集發(fā)病葉片（圖1A）進行組織分離，分離細菌在LB固體培養(yǎng)基生長48 h時長出單菌落，菌落形態(tài)一致，乳白色，表面光滑，邊緣整齊，直徑約2 mm，經(jīng)過3次轉(zhuǎn)接純化培養(yǎng)后菌落形態(tài)未發(fā)生變化（圖1B）。將分離細菌制成細菌懸浮液，接種煙草后24 h，發(fā)現(xiàn)該細菌懸浮液可以引起本氏煙草的過敏性壞死反應(yīng)（圖1C）。隨后將上述細菌接種至原樹采摘的健康核桃離體葉片，接種3 d后健康核桃葉片的接種部位出現(xiàn)與田間癥狀一致的黑褐色多角形病斑（圖1D），而接種無菌生理鹽水對照葉片僅有針刺孔，無明顯病斑（圖1E）。結(jié)果表明，通過完整的科赫氏試驗分離出的病原細菌具有致病性，能夠使健康核桃葉片產(chǎn)生與自然狀態(tài)相似的病斑，對比發(fā)現(xiàn)該病斑為核桃黑斑病典型癥狀。證明接種用菌株是陜西省商洛市紅仁核桃黑斑病的致病菌。

2.2 病原菌的生理生化特征

隨機選取2株細菌HB7和HB9進行生理生化試驗，結(jié)果如表1所示。2株細菌革蘭氏染色呈陰性，在38 ℃不能生長，均不能使淀粉水解，但是產(chǎn)生果聚糖；都能夠使吐溫-80水解和利用檸檬酸鹽；精氨酸雙水解、氧化酶反應(yīng)、硝酸鹽還原等測定結(jié)果均為陰性，能液化明膠；碳源利用試驗發(fā)現(xiàn)2株細菌都能利用甘露糖、D-山梨醇、D-木糖作為碳源生長；2株細菌不能引起馬鈴薯軟腐，但是能誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生明顯的過敏性反應(yīng)。2株細菌的生理生化性狀測定完全一致，且與參考菌株扁桃假單胞菌（Pseudomonas amygdali）結(jié)果基本一致［21］。

2.3 病原菌分子鑒定

對選擇的2株代表性菌株HB7和HB9進行16S rDNA片段的PCR擴增，分別得到長度為1 502 bp和1 496 bp的目的片段（GeneBank登錄號分別為OR910534和OR910535），測序菌株間的序列相似性為100%。BLAST分析結(jié)果（圖2）表明，2株菌株與Pseudomonas amygdali pv. tabaci str. ATCC 11528 （CP042804.1）、Pseudomonas syringae pv. syringae strain B728a（MG722805.1）的序列同源性均為99.67%。為進一步鑒定病原菌在種水平上的分類，對2株菌株的gyrB和rpoD基因進行擴增和測序，分別得到長度為1 253 bp和1 259 bp的gyrB基因片段（GeneBank登錄號分別為OR992094 和OR992095），889 bp和888 bp的rpoD基因片段（GeneBank登錄號分別為OR992096和OR992097）。通過多位點序列分析技術(shù)，進一步將本研究的2株菌株與假單胞菌屬內(nèi)其他近緣參考菌株的16S rDNA、gyrB和rpoD基因序列進行聚類分析，以野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris pv. campestris CFBP 9145）為外緣參考菌株。2株菌株與Pseudomonas amygdali的參考菌株P(guān)seudomonas amygdali 35-1緊密地聚在同一分支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合生理生化特征試驗以及聚類分析，確定引起陜西省紅仁核桃黑斑病的病原菌為Pseudomonas amygdali。

2.4 供試藥劑毒力測定

以菌株HB9為測試菌株，對12種藥劑進行室內(nèi)抑菌試驗。抑菌圈法試驗結(jié)果表明，供試藥劑中只有四霉素、中生菌素、春雷霉素、噻菌酮、噻唑鋅、46%氫氧化銅在質(zhì)量濃度為100 μg/mL條件下對測試菌株有明顯抑制作用，可作為田間防治候選藥劑；寧南霉素、乙蒜素、乙酸銅、苯醚甲環(huán)唑、松脂酸銅、腈菌唑?qū)y試菌株均無明顯抑制作用。

在抑菌圈法初篩的基礎(chǔ)上，通過含毒介質(zhì)法測定不同供試藥劑對分離菌株的室內(nèi)毒力。以供試藥劑的濃度為橫坐標，各藥劑對應(yīng)的抑菌率為縱坐標，計算出6種藥劑對Pseudomonas amygdali的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)（R2）以及EC50。如表2所示，四霉素對測試菌株的抑菌效果最好，對Pseudomonas amygdali的EC50為50.353 4 μg/mL，其次是中生菌素，對Pseudomonas amygdali的EC50為205.957 8 μg/mL，春雷霉素對Pseudomonas amygdali的EC50為251.403 5 μg/mL。

3 討論與小結(jié)

本研究對陜西省商洛市核桃發(fā)病葉片病原菌進行了分離，對經(jīng)過分離純化的病原細菌接種本氏煙草，發(fā)現(xiàn)病原菌能使煙草發(fā)生過敏性壞死反應(yīng)，接種同果園同樹健康核桃葉片也能引起核桃葉片發(fā)病并且癥狀與田間采集的發(fā)病葉片癥狀相同，再分離發(fā)病部位獲得的病原菌與接種病原菌一致。通過生理生化特性測定，分析分離細菌的16S rDNA、gyrB和rpoD基因，使用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定病原細菌為扁桃假單胞菌（Pseudomonas amygdali）。據(jù)報道，Pseudomonas amygdali包括27種致病變種，是一種宿主廣泛的病原體，對李屬物種（杏、櫻桃、李子等）、板栗、榆樹、煙草和所有葫蘆科植物造成嚴重損害［22-24］。例如Pseudomonas amygdali侵染煙草植物引起的煙草野火病是煙草生產(chǎn)上主要的細菌性病害［25］。Pseudomonas amygdali侵染核桃引起核桃黑斑病的報道較為鮮見，這種細菌病原體傳入陜西省商洛市的原因仍有待闡明。

由于扁桃假單胞菌（Pseudomonas amygdali）OIjEaEEtImc35AX+G+SI/2Qa4n3Z29G/623fPozPn1k=引起的核桃黑斑病在商洛市尚屬首次報道，先前篩選的針對Xanthomonas arboricola pv. juglandis或Pseudomonas agglomerans的防治藥劑是否適用于Pseudomonas amygdali的防治尚不清楚［10，14，15］。因此，亟需篩選出針對性的有效防治藥劑。本研究選取了細菌性病害防控常用的四霉素、中生菌素等12種藥劑，采用抑菌圈法和含毒介質(zhì)法，篩選出6種對Pseudomonas amygdali具有較好防治效果的農(nóng)藥，結(jié)果表明，四霉素對Pseudomonas amygdali的抑菌效果最好，其次是中生菌素和春雷霉素。田間防治時可以考慮四霉素、中生菌素、春雷霉素輪換交替使用，或者使用相關(guān)藥劑的復(fù)配制劑，以避免單一藥劑長期使用導(dǎo)致病原細菌抗藥性的產(chǎn)生。

本研究明確了Pseudomonas amygdali是引起陜西省商洛市核桃黑斑病的新型病原菌，并通過室內(nèi)試驗篩選出6種對該病原菌有較好防治效果的殺菌劑，本研究結(jié)果可為商洛市核桃黑斑病病原的識別和病害的科學(xué)防治提供理論依據(jù)。在接下來的研究中，還需進一步明確Pseudomonas amygdali的侵染和傳播規(guī)律，以及在不同核桃品種上的發(fā)生情況，為病害的預(yù)測預(yù)報和抗病品種選育提供指導(dǎo)。

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