脂肪干細(xì)胞源性外泌體對(duì)體外巨噬細(xì)胞遷移能力的影響

［摘 要］ 目的：探討脂肪干細(xì)胞源性外泌體 （ADSC-Exos） 對(duì)巨噬細(xì)胞 RAW264. 7 遷移能力的影響，闡明其促進(jìn)巨噬細(xì)胞功能的作用。方法：分離SD大鼠附睪旁脂肪組織，進(jìn)行脂肪源性干細(xì)胞（ADSCs） 原代培養(yǎng)，通過(guò)成脂和成骨分化誘導(dǎo)，結(jié)合油紅O 和茜素紅染色檢測(cè)ADSCs 的多向分化潛能。采用Western blotting 法和免疫熒光法檢測(cè)ADSCs 標(biāo)記物CD29 及CD44 陽(yáng)性表達(dá)情況，采用外泌體（Exos） 分離試劑盒提取ADSC-Exos，透射電子顯微鏡和納米顆粒跟蹤分析儀檢測(cè)ADSC-Exos 的形態(tài)大小和粒徑分布范圍，Western blotting 法檢測(cè)Exos 特異性標(biāo)記物CD9 和TSG101 蛋白表達(dá)情況，示蹤法觀察巨噬細(xì)胞攝取ADSC-Exos 情況。將巨噬細(xì)胞RAW264. 7 分為對(duì)照組、10 mg·L－1 ADSCExos組、20 mg·L－1 ADSC-Exos 組和40 mg·L－1 ADSC-Exos 組。5-乙基-2'-脫氧尿苷（EdU） 染色檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞活性，Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)，熒光顯微鏡觀察各組巨噬細(xì)胞黏附情況。結(jié)果：原代ADSCs培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈散在、長(zhǎng)梭形；培養(yǎng)7 d，貼壁細(xì)胞呈齒梳狀、旋渦狀有序排列，呈成纖維細(xì)胞樣外觀；培養(yǎng)10 代后ADSCs 形態(tài)不規(guī)則，增殖速度減慢。分離提取的ADSCs 具有成骨和成脂分化潛能， CD29 和CD44 蛋白表達(dá)陽(yáng)性。透射電子顯微鏡下ADSC-Exos 呈茶碟狀， ADSC-Exos 的粒徑主峰分布于132 nm 附近， ADSC-Exos 中CD9 和TSG101蛋白表達(dá)陽(yáng)性，即ADSC-Exos 提取成功。熒光顯微鏡下RAW264. 7 細(xì)胞核周圍可檢測(cè)到紅色熒光信號(hào)，即ADSC-Exos 可以被巨噬細(xì)胞攝取。與對(duì)照組比較，10、20 和40 mg·L－1 ADSC-Exos 組EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率均明顯升高（Plt;0. 05）；與10 mg·L－1 ADSC-Exos 組比較，20 mg·L－1 ADSC-Exos 組EdU陽(yáng)性細(xì)胞率均明顯升高（Plt;0. 05）。與對(duì)照組比較，10、20 和40 mg·L－1 ADSC-Exos 組巨噬細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)均明顯增加（Plt;0. 05）；與10 mg·L－1 ADSC-Exos 組比較，20 和40 mg·L－1 ADSC-Exos 組巨噬細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)均明顯增加（Plt;0. 05）。與對(duì)照組比較，10、20 和40 mg·L－1 ADSC-Exos 組巨噬細(xì)胞黏附細(xì)胞數(shù)均明顯增加（Plt;0. 05）； 與10 mg·L－1 ADSC-Exos 組比較， 20 mg·L－1 ADSCExos組巨噬細(xì)胞黏附細(xì)胞數(shù)明顯增加 （Plt;0. 05）。結(jié)論：ADSC-Exos可被巨噬細(xì)胞攝取，其通過(guò)影響細(xì)胞黏附提高巨噬細(xì)胞的遷移能力。

［關(guān)鍵詞］ 脂肪干細(xì)胞； 外泌體； 巨噬細(xì)胞； 細(xì)胞遷移； 細(xì)胞黏附

［中圖分類號(hào)］ Q25 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

脂肪源性干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs） 是一種能夠自我更新并具有多向分化潛能的干細(xì)胞，因其來(lái)源廣泛、易于獲取和安全性高受到研究者的廣泛關(guān)注［1］。研究［2-4］ 顯示：ADSCs在組織修復(fù)、自身免疫病和神經(jīng)再生等領(lǐng)域發(fā)揮的治療作用主要?dú)w因于其衍生的外泌體（exosomes，Exos）。脂肪干細(xì)胞源性外泌體（adipose-derivedstem cells-derived exosomes， ADSC-Exos） 作為一種無(wú)細(xì)胞治療策略，復(fù)制了ADSCs 的生物學(xué)活性，且具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性、易貯存和低免疫原性等優(yōu)勢(shì)，在細(xì)胞間的信息交流和物質(zhì)運(yùn)輸中充當(dāng)重要的媒介，具有廣闊的應(yīng)用前景［5］。巨噬細(xì)胞是人體重要的固有免疫細(xì)胞，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、免疫防御和組織修復(fù)中發(fā)揮著重要作用［6］。在機(jī)體組織受損或局部發(fā)生感染期間，生長(zhǎng)因子、促炎細(xì)胞因子和微生物代謝產(chǎn)物等多種物質(zhì)使局部微環(huán)境發(fā)生變化，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生遷移［7］。巨噬細(xì)胞遷移是炎癥性疾病和自身免疫性疾病等多種疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［6］。研究［8］ 顯示： 在動(dòng)脈粥樣硬化早期，巨噬細(xì)胞被募集到動(dòng)脈壁的內(nèi)皮下間隙，以吞噬碎片和低密度脂蛋白等有毒分子，巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)后遷移能力受損并聚集成斑塊，是動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的重要環(huán)節(jié)。ZOU 等［9］ 發(fā)現(xiàn)：巨噬細(xì)胞的遷移和吞噬等功能被沉默信息調(diào)節(jié)蛋白6（silent information regulator 6， SIRT6） 抑制后能夠延緩周圍神經(jīng)的修復(fù)。因此，明確影響巨噬細(xì)胞遷移能力的因素可能成為疾病治療的切入點(diǎn)。本研究提取ADSC-Exos， 并將其加入到巨噬細(xì)胞RAW264. 7 培養(yǎng)液中， 通過(guò)檢測(cè)RAW264. 7 細(xì)胞活性、細(xì)胞遷移和黏附能力的變化， 探討ADSCExos對(duì)巨噬細(xì)胞遷移能力的影響，以期為ADSCExos促進(jìn)巨噬細(xì)胞發(fā)揮功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞、主要試劑和儀器

6只4周齡SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量80～120 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK （京） 2019-0008。巨噬細(xì)胞系RAW264. 7由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部饋贈(zèng)。4'， 6-二脒基-2- 苯基吲哚（4'， 6-diamidino-2-phenylindole， DAPI） 染色液、抗熒光淬滅封片液和Ⅰ型膠原酶均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基和0. 25%胰酶-EDTA 購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，茜素紅染液、油紅O 染液、大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成脂和成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司，兔抗CD29 抗體、CD44 抗體、Cy3/FITC 標(biāo)記山羊抗兔IgG 熒光二抗和辣根過(guò)氧化物酶（horseradishperoxidase， HRP） 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 均購(gòu)自美國(guó) Abclonal 公 司， CD9 和 TSG101 購(gòu) 自 美 國(guó)Proteintech 公 司，胎 牛 血 清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司， Exos提取試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛技術(shù)有限公司，無(wú)外泌體FBS （exosome-depleted FBS，Exo-FBS） 購(gòu)自美國(guó) SBI 公司， PKH26 購(gòu)自上海宇玫博生物科技有限公司， 5- 乙基-2'- 脫氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU） 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。熒光顯微鏡（型號(hào)：BX43） 和倒置顯微鏡（型號(hào)：CKX53） 均購(gòu)自日本Olympus 公司。

1. 2 大鼠ADSCs分離和培養(yǎng)

無(wú)菌條件下提取雄性SD 大鼠附睪旁脂肪組織，采用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution， PBS）（pH=7. 4）充分清洗組織，剔除筋膜和血管并剪碎，用0. 1%的Ⅰ型膠原酶37 ℃震蕩消化45～60 min，200 目濾網(wǎng)過(guò)濾，加入含10% FBS 的DMEM/F12 完全培養(yǎng)基終止消化， 1 000 r·min－1 離心15 min 獲取沉淀，重新懸浮細(xì)胞，再次過(guò)濾離心重懸，接種于培養(yǎng)皿中并培養(yǎng)，48 h 后換液，每2～3 d 換液1 次。待細(xì)胞融合度為80% 時(shí)，采用0. 25% 胰酶-EDTA 消化并收集細(xì)胞，按1∶2 比例傳代培養(yǎng)。

1. 3 ADSCs 鑒定

取第 3 代 ADSCs，用 0. 25%胰酶-EDTA 消化成單細(xì)胞懸液，以5×104 mL－1 的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)到80% 時(shí)，更換為成脂和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，2～3 d 常規(guī)換液1 次，成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)10～14 d 行油紅O 染色，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)28～32 d 行茜素紅染色，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴和鈣結(jié)節(jié)形成情況。另取ADSCs 進(jìn)行細(xì)胞爬片培養(yǎng)， 48 h 后用4% 多聚甲醛固定細(xì)胞30 min， 用濃度為0. 2% 的Triton X-100 于冰上避光透膜10 min， 滴加5%BSA 封閉液在37 ℃水浴箱恒溫孵育1 h，分別加入兔抗CD29 （1∶100） 和CD44 （1∶200）， 4 ℃ 孵育過(guò)夜，室溫平衡1 h 后，再分別加入Cy3 標(biāo)記的山羊抗兔IgG （1∶800） 和FITC 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶400）， 37 ℃ 水浴箱恒溫避光孵育1 h， 最后DAPI 染核和封片， 熒光顯微鏡下觀察 CD29 和CD44 蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況并采集圖像。ADSCs 常規(guī)培養(yǎng)后采用Western blotting 法檢測(cè)CD29 和CD44蛋白表達(dá)水平。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%，加入RIPA裂解液，于冰上裂解30～45 min，4 ℃、12 000 r·min－1離心15 min， 獲取細(xì)胞總蛋白， 采用BCA 蛋白定量試劑盒定量蛋白；100 ℃水浴5 min 使蛋白變性，進(jìn)行 SDS-PAGE 分離、轉(zhuǎn)膜和封閉， 加入兔抗CD29 （1∶1 000）、CD44 （1∶1 000） 和小鼠抗β-actin（1∶5 000）， 4 ℃ 過(guò) 夜， 室 溫 平 衡 1 h 后 棄 液，TBST 緩沖液清洗3 次，每次10 min。加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG （1∶10 000） 室溫孵育1 h，TBST 緩沖液清洗3 次， 每次5 min， ECL 化學(xué)發(fā)光法顯影，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 4 ADSC-Exos分離提取

當(dāng)常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞融合度 為 60%～70% 時(shí)， 更 換 含 10% Exo-FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h， 至細(xì)胞融合度為80%～90%。收集細(xì)胞上清于無(wú)菌離心管內(nèi)， 4 ℃ 、3 000 g 離心15 min， 吸取上清， 加入Exos 分離試劑250 mL·L－1， 輕柔混勻， 4 ℃ 靜置2 h， 4 ℃ 、12 000 g 離心20 min， 所得沉淀即為ADSC-Exos，用100 μL 無(wú)菌PBS 緩沖液重懸，分裝備用。

1. 5 ADSC-Exos鑒定

吸取20 μL ADSC-Exos懸液滴至銅網(wǎng)上，自然吸附5～10 min，再滴加20 μL2% 磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上，靜置3～5 min，用濾紙條吸除多余液滴，白熾燈下晾干，透射電子顯微鏡下觀察ADSC-Exos 形態(tài)表現(xiàn)并拍照。PBS 緩沖液稀釋ADSC-Exos，0. 22 μm 濾菌器過(guò)濾，使用注射器向納米顆粒跟蹤分析儀的樣品池緩慢注入1 mL樣品， 將激光模塊放回底座上， 并將溫度計(jì)探頭放入激光模塊面板的銅孔內(nèi)， 依照屏幕提示完成粒徑分析，檢測(cè)ADSC-Exos 大小。按照“1. 3”中Western blotting 法檢測(cè)ADSC-Exos 中Exos 標(biāo)記物CD9 和 TSG101 蛋白表達(dá)水平， 以鑒定分離的ADSC-Exos。

1. 6 示蹤法觀察巨噬細(xì)胞攝取 ADSC-Exos 情況

用通用膜標(biāo)記稀釋液Diluent C 10 倍稀釋PKH26，制成工作液，取ADSC-Exos 加入PKH26染色工作液混勻后靜置10 min，再加入10 mL 無(wú)菌PBS 緩沖液， 利用 Exos 分離試劑， 再次提取ADSC-Exos［10］。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264. 7 細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)， 待細(xì)胞融合度為60%～70%， 加入標(biāo)記好的ADSC-Exos， 使其終濃度為10 mg·L－1，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，4% 多聚甲醛室溫固定30 min，0. 2% Triton X-100 室溫透膜10 min，PBS緩沖液清洗3 次。5% BSA 封閉1 h，DAPI 復(fù)染細(xì)胞核，熒光防淬滅封片液封片，立即在熒光顯微鏡下觀察PKH26標(biāo)記的ADSC-Exos分布情況并采集圖像。

1. 7 實(shí)驗(yàn)分組和處理

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 RAW264. 7細(xì)胞， 分為對(duì)照組（每皿加入200 μL PBS 緩沖液）、 10 mg·L－1 ADSC-Exos 組 （加 入 200 μLADSC-Exos，使其終濃度為10 mg·L－1）、20 mg·L－1ADSC-Exos 組（加入200 μL ADSC-Exos，使其終濃度為20 mg·L－1） 和40 mg·L－1 ADSC-Exos 組（加入200 μL ADSC-Exos，使其終濃度為40 mg·L－1）。

1. 8 EdU染色檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞活性

RAW264. 7細(xì)胞爬片接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 培養(yǎng)24 h 后，分別用0、10、20 和40 mg·L－1 ADSC-Exos 作用RAW264. 7 細(xì)胞24 h。加入預(yù)熱的EdU 工作液半量換液，終濃度為10 μmol·L－1，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h。4% 多聚甲醛室溫固定30 min， 加入0. 2% Triton X-100， 室溫透膜10 min， 洗滌液清洗3 次，加入Click 反應(yīng)液，室溫避光孵育30 min，洗滌液清洗3 次，Hoechst33342 復(fù)染細(xì)胞核，熒光防淬滅封片液封片，隨機(jī)選擇5 個(gè)視野于熒光顯微鏡下觀察，采用Image J 軟件分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野下EdU 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（綠色熒光） 和細(xì)胞核總數(shù)（藍(lán)色熒光）， 并計(jì)算平均值，以EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率代表巨噬細(xì)胞活性。EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率=EdU 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞核總數(shù)×100%。

1. 9 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)

將Transwell小室放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于小室下層加入含20% 血清的DMEM 培養(yǎng)基及不同濃度的ADSC-Exos。上層加入預(yù)處理細(xì)胞200 μL，重新放回孵箱遷移24 h。取出24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，棄掉培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS 緩沖液浸洗3 次，4% 多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min。用棉簽擦去小室上層未遷移細(xì)胞，隨機(jī)選取5 個(gè)視野于顯微鏡下觀察，采用Image J 軟件計(jì)數(shù)每個(gè)視野中遷移細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1. 10 熒光顯微鏡觀察各組巨噬細(xì)胞黏附情況

制備單細(xì)胞懸液， 以1×105 mL－1 的濃度爬片接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，黏附4 h［11］。PBS 緩沖液洗去未黏附的細(xì)胞，4% 多聚甲醛室溫固定30 min，采用含1% Triton X-100 和3% BSA 的混合液室溫透膜封閉15 min，含DAPI 的封片劑封片。隨機(jī)選取5 個(gè)視野于熒光顯微鏡下觀察，采用Image J 軟件計(jì)數(shù)每個(gè)視野中黏附細(xì)胞數(shù)，對(duì)5 個(gè)視野取平均值。

1. 11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPad Prism 8 軟件繪制圖像。各組細(xì)胞EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率、遷移細(xì)胞數(shù)和黏附細(xì)胞數(shù)均符合正態(tài)分布， 以-x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析， 組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 培養(yǎng)不同時(shí)間ADSCs形態(tài)表現(xiàn)

原代ADSCs培養(yǎng)24 h 后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈散在、長(zhǎng)梭形。培養(yǎng)7 d， 貼壁細(xì)胞呈齒梳狀、旋渦狀有序排列， 呈成纖維細(xì)胞樣外觀。培養(yǎng)10 代后ADSCs 細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，增殖速度減慢。見(jiàn)圖1。

2. 2 ADSCs鑒定

ADSCs 成脂誘導(dǎo) 14 d 后，經(jīng)油紅 O 染色， 顯微鏡下可見(jiàn)大量紅色脂滴。ADSCs 經(jīng)成骨分化誘導(dǎo) 32 d 后，行茜素紅染色，顯微鏡下可見(jiàn)大量鈣化結(jié)節(jié)。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示： CD29 和CD44 蛋白表達(dá)陽(yáng)性， 陽(yáng)性蛋白產(chǎn)物主要位于細(xì)胞漿中。Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示： ADSCs 中 CD29 和CD44 蛋白表達(dá)陽(yáng)性。見(jiàn)圖2～5。

2. 3 ADSC-Exos鑒定和巨噬細(xì)胞攝取情況

透射電子顯微鏡下ADSC-Exos 呈茶碟狀。納米顆粒跟蹤分析儀測(cè)得ADSC-Exos 的粒徑主峰分布于132 nm 附近。Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示：ADSC-Exos 中Exos 標(biāo)記物CD9 和TSG101 蛋白表達(dá)陽(yáng)性， 即ADSC-Exos 提取成功。見(jiàn)圖6。熒光顯微鏡下RAW264. 7 細(xì)胞核周圍可檢測(cè)到紅色熒光信號(hào)， 表明ADSC-Exos 可以被巨噬細(xì)胞攝取。見(jiàn)圖7。

2. 4 各組EdU陽(yáng)性細(xì)胞率

與對(duì)照組（21. 05%±2. 98%） 比較，10、20 和40 mg·L－1 ADSC-Exos 組EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率（35. 29%±1. 72%、41. 89%±3. 67% 和38. 09%±0. 23%） 均明顯升高（Plt;0. 05）；與10 mg·L－1 ADSC-Exos 組比較，20 mg·L－1ADSC-Exos 組EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率均明顯升高（Plt;0. 05）， 40 mg·L－1 ADSC-Exos 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）； 與20 mg·L－1 ADSC-Exos 組比較，40 mg·L－1 ADSC-Exos 組EdU 陽(yáng)性細(xì)胞率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見(jiàn)圖8。

2. 5 各組巨噬細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)

與對(duì)照組（ 67. 33個(gè)±3. 01 個(gè)） 比較，10、20 和40 mg·L－1 ADSC-Exos 組巨噬細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)（165. 00 個(gè) ± 8. 19 個(gè)、267. 00 個(gè)±35. 03 個(gè)和232. 67 個(gè)±20. 50 個(gè)） 均明顯增加（Plt;0. 05）。與10 mg·L－1 ADSC-Exos 組比較， 20 和40 mg·L－1 ADSC-Exos 組巨噬細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)均明顯增加（Plt;0. 05）。與20 mg·L－1ADSC-Exos 組比較， 40 mg·L－1 ADSC-Exos 組巨噬細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見(jiàn)圖9。

2. 6 各組巨噬細(xì)胞黏附細(xì)胞數(shù)

與對(duì)照組（ 22. 00個(gè)±7. 21個(gè)） 比較，10、20 和40 mg·L－1 ADSC-Exos 組巨噬細(xì)胞黏附細(xì)胞數(shù)（49. 00個(gè)±3. 00個(gè)、64. 00個(gè)±7. 00 個(gè)和56. 33 個(gè)±1. 53 個(gè)） 均明顯增加（Plt;0. 05）；與10 mg·L－1 ADSC-Exos 組比較，20 mg·L－1ADSC-Exos 組巨噬細(xì)胞黏附細(xì)胞數(shù)均明顯增加（Plt;0. 05）， 40 mg·L－1 ADSC-Exos 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）；與20 mg·L－1 ADSC-Exos 組比較，40 mg·L－1 ADSC-Exos 組巨噬細(xì)胞黏附細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見(jiàn)圖10。

3 討 論

ADSCs 是一類來(lái)源廣泛、分離操作簡(jiǎn)單易行且體外培養(yǎng)周期短的間充質(zhì)干細(xì)胞［12］。研究［13-15］顯示： ADSCs 在皮膚傷口愈合、延緩面部皮膚老化和周圍神經(jīng)損傷后修復(fù)等多領(lǐng)域均發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示： 純化的ADSCs 形態(tài)均一，具有成脂和成骨分化特性， 陽(yáng)性表達(dá)CD29 和CD44 蛋白， 與CHEN 等［16］ 研究結(jié)果一致， 表明ADSCs 被成功分離。YIN 等［17］ 認(rèn)為： ADSCs 的治療作用是通過(guò)分泌Exos 等生物活性物質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)的， Exos 憑借其安全性和穩(wěn)定性等優(yōu)勢(shì)在機(jī)體的生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［18］。但Exos 體積微小，其高效快速地分離純化是實(shí)驗(yàn)研究和蛋白組學(xué)分析的關(guān)鍵［19］。本研究結(jié)果顯示：采用Exos 分離試劑盒由ADSCs 中提取ADSC-Exos，該方法獲取的ADSC-Exos 尺寸分布均一， 粒徑主峰分布于132 nm 附近， 呈茶碟狀外觀， CD9 和TSG101 蛋白表達(dá)陽(yáng)性，提示本研究成功獲取了ADSC-Exos，該方法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短及靈敏度高。巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的可塑性，其吞噬、極化和遷移等生理功能是體內(nèi)平衡、免疫防御和組織修復(fù)的重要部分。FENG 等［20］ 研究顯示：采用ADSC-Exos 處理的巨噬細(xì)胞中炎癥因子水平明顯降低， ADSC-Exos 通過(guò)抑制核因子κB （nuclear factor- κB， NF- κB） 和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinase，MAPK） 通路抑制巨噬細(xì)胞的活化以緩解神經(jīng)炎癥。ZOU 等［9］ 研究發(fā)現(xiàn)：SIRT6 通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞的吞噬和遷移等功能延緩神經(jīng)再生。提示ADSC-Exos 可以影響巨噬細(xì)胞的生理功能， 當(dāng)巨噬細(xì)胞功能改變時(shí)，會(huì)不同程度地影響機(jī)體的病理生理進(jìn)程。遷移能力是巨噬細(xì)胞的重要生理功能之一，細(xì)胞遷移是活細(xì)胞發(fā)揮生理功能的基礎(chǔ)，當(dāng)機(jī)體的微環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，巨噬細(xì)胞由血液中被募集到炎癥部位的過(guò)程被稱為巨噬細(xì)胞遷移［7，21］。巨噬細(xì)胞遷移被認(rèn)為是炎癥性疾病、神經(jīng)損傷后修復(fù)和動(dòng)脈粥樣硬化等病理進(jìn)程的潛在治療靶點(diǎn)［22-24］。本研究結(jié)果顯示： ADSC-Exos 可以被巨噬細(xì)胞特異性攝取至細(xì)胞核周圍，且ADSC-Exos 處理后巨噬細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)，遷移細(xì)胞數(shù)明顯增加，提示ADSC-Exos 提高了巨噬細(xì)胞的遷移能力。既往研究［25］ 顯示：巨噬細(xì)胞遷移是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，包括伸出偽足、細(xì)胞黏附、胞體收縮和黏附解離并向前移動(dòng)，其中細(xì)胞黏附是由整合素與細(xì)胞外基質(zhì)相應(yīng)配體之間形成的牽引點(diǎn)， 是細(xì)胞遷移的基礎(chǔ)［26］。本研究結(jié)果顯示：ADSC-Exos 處理后黏附的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加，表明 ADSC-Exos 能夠提高 RAW264. 7 細(xì)胞的黏附能力，且作用趨勢(shì)與Transwell 小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示ADSC-Exos 可通過(guò)影響巨噬細(xì)胞的黏附環(huán)節(jié)促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移。

綜上所述， ADSC-Exos 能夠被巨噬細(xì)胞特異性攝取，并可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性。通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞黏附提高 ADSC-Exos 的遷移能力， 可為其治療受損神經(jīng)和相關(guān)炎癥性疾病提供新的思路。本課題組未來(lái)將進(jìn)一步從體外實(shí)驗(yàn)水平探討ADSC-Exos促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移的作用機(jī)制。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：袁博參與論文選題、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和論文撰寫， 謝佳憶、江思瑜、孟亞軍、朱清華和李曉飛參與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲取及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，付秀美和謝利德參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)指導(dǎo)及論文審校。

[參考文獻(xiàn)]

［1］ BELLEI B， MIGLIANO E， PICARDO M. Researchupdate of adipose tissue-based therapies in regenerativedermatology［J］. Stem Cell Rev Rep， 2022， 18（6）：1956-1973.

［2］ ZHAO H B， CHEN W， CHEN J L， et al. ADSCspromote tenocyte proliferation by reducing themethylation level of lncRNA Morf4l1 in tendoninjury［J］. Front Chem， 2022， 10： 908312.

［3］ LIU C Y， YIN G， SUN Y D， et al. Effect of exosomesfrom adipose-derived stem cells on the apoptosis ofSchwann cells in peripheral nerve injury ［J］. CNSNeurosci Ther， 2020， 26（2）： 189-196.

［4］ ZHU H F， WU X Y， LIU R， et al. ECM-inspiredhydrogels with ADSCs encapsulation for rheumatoidarthritis treatment［J］. Adv Sci， 2023， 10（9）： e2206253.

［5］ RAU C S， KUO P J， WU S C， et al. Enhanced nerveregeneration by exosomes secreted by adipose-derivedstem cells with or without FK506 stimulation［J］. Int JMol Sci， 2021， 22（16）： 8545.

［6］ SHAPOURI-MOGHADDAM A， MOHAMMADIANS， VAZINI H， et al. Macrophage plasticity，polarization， and function in health and disease［J］. J CellPhysiol， 2018， 233（9）： 6425-6440.

［7］ GAO W J， LIU J X， LIU M N， et al. Macrophage 3Dmigration： a potential therapeutic target for inflammationand deleterious progression in diseases［J］. PharmacolRes， 2021， 167： 105563.

［8］ LEY K， MILLER Y I， HEDRICK C C. Monocyte andmacrophage dynamics during atherogenesis ［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2011， 31（7）： 1506-1516.

［9］ ZOU Y， ZHANG J Q， XU J W， et al. SIRT6 inhibitiondelays peripheral nerve recovery by suppressingmigration， phagocytosis and M2-polarization ofmacrophages［J］. Cell Biosci， 2021， 11（1）： 210.

［10］ZHANG L， JIAO G J， REN S W， et al. Exosomesfrom bone marrow mesenchymal stem cells enhancefracture healing through the promotion of osteogenesisand angiogenesis in a rat model of nonunion［J］. StemCell Res Ther， 2020， 11（1）： 38.

［11］WANG Y， SU J， FU D H， et al. The role of YB1 inrenal cell carcinoma cell adhesion［J］. Int J Med Sci，2018， 15（12）： 1304-1311.

［12］李大偉， 張析哲， 周 琪. 雪旺細(xì)胞對(duì)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)作用的研究進(jìn)展［J］. 臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志， 2019，6（5）： 197-198.

［13］LI Y M， LI D Y， YOU L， et al. dCas9-based PDGFR-βactivation ADSCs accelerate wound healing in diabeticmice through angiogenesis and ECM remodeling［J］. IntJ Mol Sci， 2023， 24（6）： 5949.

［14］ZAREI F， ABBASZADEH A. Application of celltherapy for anti-aging facial skin［J］. Curr Stem Cell ResTher， 2019， 14（3）： 244-248.

［15］張雅群， 付 麗， 任譯延， 等. 大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及其向少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的誘導(dǎo)分化［J］.解剖學(xué)報(bào)， 2022， 53（5）： 557-562.

［16］CHEN J， REN S， DUSCHER D， et al. Exosomesfrom human adipose-derived stem cells promote sciaticnerve regeneration via optimizing Schwann cellfunction［J］. J Cell Physiol， 2019， 234（12）： 23097-23110.

［17］YIN G， YU B， LIU C Y， et al. Exosomes produced byadipose-derived stem cells inhibit schwann cellsautophagy and promote the regeneration of the myelinsheath［J］. Int J Biochem Cell Biol， 2021， 132： 105921.

［18］汪文濤， 米旭光， 周 陽(yáng)， 等. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體誘導(dǎo)自噬對(duì)MPP+抑制SH-SY5Y細(xì)胞存活的影響及其機(jī)制［J］. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2022， 48（3）：606-614.

［19］袁 博， 謝利德， 付秀美. 許旺細(xì)胞源性外泌體促進(jìn)損傷周圍神經(jīng)的修復(fù)與再生［J］. 中國(guó)組織工程研究，2023， 27（6）： 935-940.

［20］FENG N H， JIA Y J， HUANG X X. Exosomes fromadipose-derived stem cells alleviate neural injury causedby microglia activation via suppressing NF- κB andMAPK pathway ［J］. J Neuroimmunol， 2019， 334：576996.

［21］SENGUPTA S， PARENT C A， BEAR J E. Theprinciples of directed cell migration［J］. Nat Rev MolCell Biol， 2021， 22（8）： 529-547.

［22］ZHANG H， WANG Y F， ZHAO Y H， et al. PTX3mediates the infiltration， migration， and inflammationresolving-polarization of macrophages inglioblastoma［J］. CNS Neurosci Ther， 2022， 28（11）：1748-1766.

［23］XU J W， FU L Y， DENG J Y， et al. MiR-301adeficiency attenuates the macrophage migration andphagocytosis through YY1/CXCR4 pathway［J］. Cells，2022， 11（24）： 3952.

［24］CANFRáN-DUQUE A， ROTLLAN N， ZHANG X B，et al. Macrophage-derived 25-hydroxycholesterolpromotes vascular inflammation， atherogenesis， andlesion remodeling［J］. Circulation， 2023， 147（5）：388-408.

［25］汪 鵬， 仇建南， 王忠夏， 等. 肝癌微環(huán)境中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的研究進(jìn)展［J］. 臨床肝膽病雜志， 2023，39（5）： 1212-1218.

［26］STAHNKE S， D?RING H， KUSCH C， et al. Loss ofHem1 disrupts macrophage function and impactsmigration， phagocytosis， and integrin-mediatedadhesion［J］. Curr Biol， 2021， 31（10）： 2051-2064.

[基金項(xiàng)目] 河北省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（H2021406056）；河北省高等學(xué)校科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（ZD2020178）；承德醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)優(yōu)勢(shì)學(xué)科資助項(xiàng)目（〔2023〕22 號(hào)）；河北省神經(jīng)損傷與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放項(xiàng)目（NJKF-202403）