NDRG1 過表達(dá)對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌耐藥細(xì)胞株C4-2/ENZA耐藥性的影響及其機(jī)制

［摘 要］ 目的：探討N-myc下游調(diào)節(jié)基因1（NDRG1） 對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌 （CRPC） 恩雜魯胺 （ENZA） 耐藥的影響，并闡明其作用機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)人 CRPC C4-2細(xì)胞和 ENZA耐藥株C4-2/ENZA 細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測(cè)C4-2/ENZA 細(xì)胞及其親本C4-2 細(xì)胞中NDRG1 mRNA 表達(dá)水平，Western blotting 法檢測(cè)C4-2/ENZA 細(xì)胞及其親本C4-2 細(xì)胞中NDRG1、雄激素受體（AR） 和前列腺特異性抗原（PSA） 蛋白表達(dá)水平， 以驗(yàn)證細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。將C4-2/ENZA 細(xì)胞分為空白組（正常培養(yǎng)不進(jìn)行處理）、陰性對(duì)照慢病毒（Lv-NC） 組（轉(zhuǎn)染Lv-NC）、Lv-NDRG1 組（ 轉(zhuǎn)染Lv-NDRG1）、 Lv-NC+ENZA 組（ 轉(zhuǎn)染 Lv-NC 后加入 ENZA 處理）、Lv-NDRG1+ENZA 組（轉(zhuǎn)染Lv-NDRG1 后加入ENZA 處理）、Lv-NDRG1+表皮生長(zhǎng)因子（EGF） 組（轉(zhuǎn)染Lv-NDRG1 后加入EGF 處理） 和Lv-NDRG1+EGF+ENZA 組（轉(zhuǎn)染Lv-NDRG1 后加入EGF 和ENZA 處理）。采用噻唑藍(lán)（MTT） 法檢測(cè)各組細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（IC50）、耐藥指數(shù)（RI） 和細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，RT-qPCR 法檢測(cè)各組細(xì)胞中NDRG1 mRNA 表達(dá)水平，Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中NDRG1、AR、第213 位絲氨酸磷酸化雄激素受體（p-ARSer213）、第 81 位絲氨酸磷酸化雄激素受體 （p-ARSer81 ） 和PSA蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：與 C4-2 細(xì)胞比較，C4-2/ENZA 細(xì)胞中NDRG1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 01），AR 和PSA 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01）， 提示ENZA 耐藥株C4-2/ENZA 中NDRG1 低表達(dá)； 與Lv-NC 組比較， Lv-NDRG1 組細(xì)胞中NDRG1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01），提示成功構(gòu)建NDRG1 基因過表達(dá)C4-2/ENZA 耐藥細(xì)胞株。MTT 法，與C4-2 細(xì)胞比較，C4-2/ENZA 細(xì)胞IC50明顯升高（Plt;0. 01）， RI 為17. 78； 與Lv-NC 組比較， Lv-NDRG1 組C4-2/ENZA 細(xì)胞IC50 明顯降低（Plt;0. 01）。EGF 處理24 h， 與Lv-NC 組比較， Lv-NC+EGF 組C4-2/ENZA 細(xì)胞IC50 明顯升高（Plt;0. 01）；與Lv-NDRG1組比較，Lv-NDRG1+EGF 組C4-2/ENZA 細(xì)胞IC50明顯升高（Plt;0. 01）。與ENZA 處理前比較，不同濃度ENZA 處理24 h，C4-2 和C4-2/ENZA 細(xì)胞增殖活性均逐漸降低（F=223. 80，Plt;0. 01；F=81. 46，Plt;0. 01）。ENZA 處理24 h，與Lv-NC 組比較， Lv-NDRG1 組C4-2/ENZA 細(xì)胞增殖活性明顯降低（Plt;0. 01）。EGF 處理24 h， 與Lv-NC 組比較， Lv-NC+EGF 組C4-2/ENZA 細(xì)胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 01）， Lv-NDRG1+EGF 組C4-2/ENZA 細(xì)胞增殖活性明顯降低（Plt;0. 01）。選擇10. 000 μmol·L－1 ENZA 和干預(yù)24 h 作為后續(xù)檢測(cè)濃度及時(shí)間點(diǎn)。流式細(xì)胞術(shù)，ENZA 處理24 h，與Lv-NC 組比較， Lv-NDRG1 組細(xì)胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 01）； 與Lv-NC+ENZA 組比較，Lv-NDRG1+ENZA 組細(xì)胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 01）。EGF 處理24 h， 與Lv-NDRG1 組比較，Lv-NDRG1+EGF 組細(xì)胞凋亡率明顯降低（Plt;0. 01），Lv-NDRG1+ENZA 組細(xì)胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 01）；與Lv-NDRG1+ENZA 組比較，Lv-NDRG1+EGF+ENZA 組細(xì)胞凋亡率明顯降低（Plt;0. 01）。Western blotting 法，ENZA 處理24 h，與Lv-NC 組比較，Lv-NDRG1 組細(xì)胞中AR 和PSA 蛋白表達(dá)水平及p-ARSer213/AR 和p-ARSer81/AR 比值均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。EGF 處理24 h， 與Lv-NC 組比較， Lv-NC+EGF 組細(xì)胞中AR 和PSA 蛋白表達(dá)水平及p-ARSer213/AR 和p-ARSer81/AR 比值均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）；與Lv-NDRG1 組比較， Lv-NDRG1+EGF 組細(xì)胞中AR 和PSA 蛋白表達(dá)水平及p-ARSer213/AR 和p-ARSer81/AR 比值均明顯升高（Plt;0. 01）。結(jié)論：NDRG1過表達(dá)可降低CRPC對(duì)ENZA的耐藥性，其作用機(jī)制可能與抑制AR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 去勢(shì)抵抗性前列腺癌； N-myc 下游調(diào)節(jié)基因1； 恩雜魯胺； 耐藥性； 雄激素受體

［中圖分類號(hào)］ R737.25 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

前列腺癌（prostate cancer，PCa） 是全球范圍內(nèi)最常見的男性惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致男性癌癥死亡的主要因素［1］。研究［2］ 顯示： 2020 年P(guān)Ca 在男性癌癥中發(fā)病率位居第2 位， 占新發(fā)癌癥的14. 1%。雄激素剝奪療法是目前臨床治療PCa 的常規(guī)方法，通過藥物或手術(shù)去勢(shì)，并結(jié)合雄激素受體拮抗劑恩雜魯胺（enzalumide， ENZA） 降低體內(nèi)雄激素水平，從而抑制癌癥發(fā)展［3-4］。然而，大部分患者均會(huì)出現(xiàn)耐藥性， 雄激素受體（androgenreceptor， AR） 轉(zhuǎn)錄活性恢復(fù)甚至增強(qiáng)，導(dǎo)致 PCa發(fā)展為去勢(shì)抵抗性PCa （castration-resistantprostate cancer， CRPC）， 從而對(duì)化療藥物ENZA不敏感， 對(duì)患者的治療效果較差。因此， 探討CRPC 耐藥發(fā)生的分子機(jī)制并尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的靶點(diǎn)具有重要的意義，有助于開發(fā)新的治療方法延長(zhǎng)患者生存期。N-myc 下游調(diào)節(jié)基因1 （N-mycdownstream regulatory gene 1， NDRG1） 是NDRG家族成員之一，在大部分腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用， 調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲等進(jìn)程［5-7］。LIM 等［8］ 發(fā)現(xiàn)： NDRG1 能夠抑制PCa 細(xì)胞中AR信號(hào)通路激活從而抑制癌癥發(fā)展。郭曉波等［9］ 研究發(fā)現(xiàn)： NDRG1 在PCa 細(xì)胞PC-3 中低表達(dá)，NDRG1 表達(dá)上調(diào)可逆轉(zhuǎn)PCa 細(xì)胞多西他賽耐藥。但NDRG1 是否可調(diào)控AR 信號(hào)通路參與CRPC 耐藥目前尚未見報(bào)道。因此，本研究探討NDRG1 對(duì)CRPC 耐藥的影響， 并闡明其作用機(jī)制， 為尋找CRPC 新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞、病毒、主要試劑和儀器

人CRPC C4-2細(xì)胞（雄激素非依賴性PCa 細(xì)胞系） 購(gòu)自美國(guó)ATCC 公司。NDRG1 過表達(dá)慢病毒（Lv-NDRG1）及其陰性對(duì)照慢病毒（Lv-NC） 購(gòu)自上海漢恒生物科技有限公司。 ENZA 購(gòu)自美國(guó)Selleck 公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司， 噻唑藍(lán)［3- （4，5-dimethyl-2-thiazolyl） -2， 5-diphenyl tetrazoliumbromide， MTT］ 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、Annexin Ⅴ-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time florescence quantitative PCR，RT-qPCR） 試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，兔抗人NDRG1 抗體、AR 抗體、第213 位絲氨酸磷酸化雄激素受體（phosphorylated AR atserine 213，p-ARSer213） 抗體、第81 位絲氨酸磷酸化雄激素受體（phosphorylated AR at serine 81，p-ARSer81） 抗體、 前列腺特異性抗原（prostatespecific antigen， PSA） 抗體和GAPDH 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司， 辣根過氧化物酶（horse radishperoxidase， HRP） 標(biāo)記的山羊抗兔抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity 公司。二氧化碳培養(yǎng)箱（型號(hào)： MCO-18AC） 購(gòu)自日本松下公司， 流式細(xì)胞儀（型號(hào)：Accuri C6） 購(gòu)自美國(guó)BD 公司， 酶標(biāo)分析儀（型號(hào)： AMR-100） 購(gòu)自杭州奧盛儀器有限公司， 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（型號(hào)：Tanon-5200） 購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1. 2 細(xì)胞培養(yǎng)及耐藥細(xì)胞株構(gòu)建

采用 ENZA梯度遞增法逐步誘導(dǎo)獲得耐藥株C4-2/ENZA 細(xì)胞。將親本C4-2 細(xì)胞置于0、0. 500、1. 000、3. 125、6. 250、12. 500、25. 000、50. 000 和100. 000 μmol·L－1ENZA 的完全培養(yǎng)液中逐步誘導(dǎo)篩選，整個(gè)過程持續(xù)時(shí)間約7 個(gè)月。C4-2 細(xì)胞及耐藥株C4-2/ENZA細(xì)胞使用含10% FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C4-2和C4-2/ENZA 細(xì)胞，以每孔2 500 個(gè)細(xì)胞的密度接種至 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 過夜。分別加入 0、0. 500、1. 000、3. 125、6. 250、12. 500、25. 000、50. 000 和100. 000 μmol·L－1 ENZA 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1. 3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 C4-2/ENZA 細(xì)胞， 按每孔5×106 個(gè)細(xì)胞的密度接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜。次日，按病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection， MOI） =100 加入Lv-NDRG1 （慢病毒滴度為5. 21×108 TU·mL－1） 和Lv-NC （慢病毒滴度為3. 15×108 TU·mL－1），24 h后更換新配制的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，感染72 h 后采用RT-qPCR 法和Western blotting 法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)處理方式不同，將C4-2/ENZA 細(xì)胞分為空白組（正常培養(yǎng)不進(jìn)行處理）、Lv-NC 組（轉(zhuǎn)染Lv-NC）、Lv-NDRG1 組（轉(zhuǎn)染Lv-NDRG1）、Lv-NC+ENZA 組（轉(zhuǎn)染Lv-NC 后加入ENZA 處理）、Lv-NDRG1+ENZA 組（轉(zhuǎn)染Lv-NDRG1 后加入ENZA 處理）、Lv-NDRG1+ 表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor， EGF） 組（ 轉(zhuǎn)染Lv-NDRG1 后加入EGF 處理） 和Lv-NDRG1+EGF+ENZA 組（轉(zhuǎn)染Lv-NDRG1 后加入EGF 和ENZA處理）。Lv-NC+ENZA 組和Lv-NDRG1+ENZA 組細(xì)胞 NDRG1 基因過表達(dá)后聯(lián)合 ENZA 處理，ENZA 干預(yù)濃度為10 μmol·L－1，干預(yù)時(shí)間為24 h。Lv-NDRG1+EGF組和Lv-NDRG1+EGF+ENZA組細(xì)胞 NDRG1 基因過表達(dá)后聯(lián)合 ENZA 及100 mg·L－1 雄激素非依賴性受體激動(dòng)劑EGF處理［10］。

1. 4 MTT 法檢測(cè)各組細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（50%inhibitory concentration， IC50）、 耐 藥 指 數(shù)（resistance index， RI）和細(xì)胞增殖活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C4-2/ENZA 細(xì)胞，以每孔2 500 個(gè)細(xì)胞的密度接種至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜， 慢病毒感染后分別加入不同濃度（0、3. 125、6. 250、12. 500、25. 000、50. 000 和100. 000 μmol·L－1） ENZA 或聯(lián)合加入10 μmol·L－1 ENZA 或100 mg·L－1 EGF，另設(shè)調(diào)零孔（培養(yǎng)基對(duì)照）。培養(yǎng)24 h 后提前4 h 取出培養(yǎng)板， 每孔加入10 μL 0. 5% MTT 溶液， 置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h， 棄培養(yǎng)液， 每孔加入100 μL 二甲基亞砜，置于搖床上避光震蕩15 min，采用酶標(biāo)分析儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm處吸光度（ A） 值，計(jì)算ENZA 對(duì)C4-2和C4-2/ENZA 細(xì)胞的IC50、RI 和各組細(xì)胞增殖活性。RI=C4-2/ENZA細(xì)胞IC50/C4-2細(xì)胞IC50；細(xì)胞增殖活性= ［（實(shí)驗(yàn)孔A 值－空白孔A 值） / （對(duì)照孔A 值－空白孔A 值）］。

1. 5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

取病毒感染后的C4-2/ENZA 細(xì)胞，以每孔5×106 個(gè)細(xì)胞的密度接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，分組處理24 h， 收集各組細(xì)胞， 加入500 μL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS） 重懸， 調(diào)整細(xì)胞密度至1×106 mL－1， 加入5 μL Annexin Ⅴ -FITC輕輕混勻，后加入10 μL 碘化丙啶染液輕輕混勻，室溫避光20 min 后， 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率= 凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1. 6 RT-qPCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中NDRG1 mRNA表達(dá)水平

分組干預(yù)后收集各組細(xì)胞，加入預(yù)冷PBS 緩沖液清洗2 次，加入TRIzol 溶液于冰上提取總RNA， 采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用RT-qPCR 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中NDRG1mRNA 表達(dá)水平。引物序列：GAPDH 上游引物，5'-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'，下游引物，5'-GCCCAATACGACCAAATCAGAG-3'； NDRG1上游引物，5'-AGGGTCCCATTCATCTCCCC-3'，下游引物，5'-GCTGTCACCTGCCTAGTCC-3'。反 應(yīng) 條 件： 95 ℃ 預(yù)變性 5 min， 95 ℃ 、 10 s，60 ℃、25 s，共40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2—△△Ct法計(jì)算NDRG1 mRNA 表達(dá)水平。

1. 7 Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中NDRG1、AR、PSA、p-ARSer213 和 p-ARSer81 蛋白表達(dá)水平

分組處理后收集各組細(xì)胞， 加入預(yù)冷PBS 緩沖液清洗2 次，加入裂解液于冰上裂解提取總蛋白，采用BCA 蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品置于金屬浴上煮沸10 min，每孔取40 μg 蛋白上樣，電泳分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上， 室溫封閉1 h， 加入一抗NDRG1 抗體（1∶1 000）、AR 抗體（1∶1 000）、p-ARSer213抗體（1∶ 1 000）、p-ARSer81 抗體（1∶ 1 000）、PSA 抗體（1∶1 000） 和GAPDH 抗體（1∶5 000），4 ℃孵育過夜，TBST 溶液清洗3 次，加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶5 000）， 室溫孵育 1 h， TBST 溶液清洗3 次，滴加顯影液，曝光，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 或AR 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 或AR 蛋白條帶灰度值。

1. 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 26. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞凋亡率，各組細(xì)胞中NDRG1 mRNA 表達(dá)水平及各組細(xì)胞中NDRG1、PSA 和AR 蛋白表達(dá)水平以及p-ARSer213/AR 和p-ARSer81/AR 比值均符合正態(tài)分布，以- x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

RT-qPCR法檢測(cè)結(jié)果顯示：與C4-2 細(xì)胞（1. 00±0. 03） 比較，C4-2/ENZA細(xì)胞中NDRG1 mRNA 表達(dá)水平（0. 11±0. 03） 明顯降低（Plt;0. 01）。Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示： 與 C4-2 細(xì) 胞 比 較， C4-2/ENZA 細(xì) 胞 中NDRG1 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01），AR 和PSA 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01）。提示ENZA 耐藥株C4-2/ENZA 中NDRG1 低表達(dá)。見圖1。

與空白組比較，Lv-NC 組C4-2/ENZA 細(xì)胞中NDRG1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。與Lv-NC 組比較， Lv-NDRG1 組細(xì)胞中NDRG1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01）。提示成功構(gòu)建NDRG1 基因過表達(dá)C4-2/ENZA 耐藥細(xì)胞株。見圖2 和3。

2. 2 各組細(xì)胞 IC50、RI和細(xì)胞增殖活性

與 C4-2細(xì)胞（2. 16 μmol·L－1±0. 37 μmol·L－1） 比較，C4-2/ENZA 細(xì)胞IC50 （38. 40 μmol·L－1±6. 31 μmo·l L－1）明顯升高（Plt;0. 01）， RI=17. 78。與空白組（39. 73 μmol·L－1±5. 70 μmol·L－1） 比較， Lv-NC組 C4-2/ENZA 細(xì) 胞 IC50 （36. 14 μmol·L－1 ±6. 04 μmol·L－1） 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）；與Lv-NC 組比較，Lv-NDRG1 組C4-2/ENZA 細(xì)胞IC50 （11. 13 μmol·L－1±0. 42 μmol·L－1） 明顯降低（Plt;0. 01）。 EGF 處 理 24 h， 與 Lv-NC 組（37. 76 μmol·L－1±3. 66 μmol·L－1） 比較，Lv-NC+EGF 組 C4-2/ENZA 細(xì)胞 IC50 （49. 81 μmol·L－1±4. 07 μmo·l L－1） 明顯升高（ Plt;0. 01）；與Lv-NDRG1組（10. 57 μ mol·L － 1 ± 0. 33 μ mol·L － 1） 比 較，Lv-NDRG1+EGF 組C4-2/ENZA 細(xì)胞IC50（20. 16 μmol·L－1 ± 3. 24 μmol·L－1） 明 顯 升 高（Plt;0. 01）。

與 ENZA 處理前比較，不同濃度 ENZA 處理24 h，C4-2 和C4-2/ENZA 細(xì)胞增殖活性均逐漸降低（F=223. 80， Plt;0. 01； F=81. 46， Plt;0. 01）。ENZA 處理24 h， 與空白組比較， Lv-NC 組C4-2/ENZA 細(xì)胞增殖活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）；與Lv-NC 組比較，Lv-NDRG1 組C4-2/ENZA 細(xì)胞增殖活性明顯降低（Plt;0. 01）。EGF 處理24 h，與Lv-NC 組比較，Lv-NC+EGF 組C4-2/ENZA 細(xì)胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 01）， Lv-NDRG+EGF 組C4-2/ENZA 細(xì)胞增殖活性明顯降低（Plt;0. 01）。根據(jù)Lv-NDRG1 組C4-2/ENZA 細(xì)胞的IC50， 選擇10. 000 μmol·L－1 ENZA 和干預(yù)24 h 作為后續(xù)檢測(cè)濃度及時(shí)間點(diǎn)。見圖4。

2. 3 各組細(xì)胞凋亡率

ENZA 處理 24 h，與 Lv-NC 組比較， Lv-NDRG1 組和Lv-NC+ENZA 組細(xì)胞凋亡率均明顯升高（Plt;0. 01）； 與Lv-NC+ENZA 組比較，Lv-NDRG1+ENZA 組細(xì)胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 01）。見圖5 和6。EGF 處理24 h，與Lv-NDRG1 組比較， Lv-NDRG1+EGF 組細(xì)胞凋亡率明顯降低（Plt;0. 01），Lv-NDRG1+ENZA組細(xì)胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 01）； 與Lv-NDRG1 + ENZA 組 比 較， Lv-NDRG1+EGF+ENZA 組細(xì)胞凋亡率明顯降低（Plt;0. 01）。見圖7 和8。

2. 4 各組細(xì)胞中AR、PSA、p-ARSer213和p-ARSer81蛋白表達(dá)水平

ENZA 處理 24 h，與空白組比較，Lv-NC 組細(xì)胞中 AR 和 PSA 蛋白表達(dá)水平及p-ARSer213/AR 和p-ARSer81/AR 比值差異均無統(tǒng)計(jì) 學(xué) 意 義（Pgt;0. 05）； 與 Lv-NC 組 比 較，Lv-NDRG1 組細(xì)胞中 AR 和 PSA 蛋白表達(dá)水平及p-ARSer213/AR 和p-ARSer81/AR 比值均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。提示NDRG1 過表達(dá)可抑制 C4-2/ENZA 細(xì)胞中 AR 通路的活化。見圖9。EGF 處理24 h，與Lv-NC 組比較，Lv-NC+EGF 組細(xì)胞中AR 和PSA 蛋白表達(dá)水平及p-ARSer213/AR 和p-ARSer81/AR 比值均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）；與Lv-NDRG1 組比較，Lv-NDRG1+EGF 組細(xì)胞中AR 和PSA 蛋白表達(dá)水平及p-ARSer213/AR 和p-ARSer81/AR 比值均明顯升高（ Plt;0. 01 ）。見圖10。

3 討 論

腫瘤耐藥機(jī)制是腫瘤細(xì)胞通過調(diào)控基因表達(dá)或改變藥物在腫瘤細(xì)胞中的分布和利用度而發(fā)生的一系列病理變化［11］。識(shí)別ENZA 影響的基因并評(píng)價(jià)其作為治療CRPC 靶點(diǎn)的作用具有重要的臨床意義。研究［12-13］ 報(bào)道： 基因的異常表達(dá)與 CRPC 的發(fā)展及ENZA 耐藥有密切關(guān)聯(lián)。番茄紅素通過蛋白激酶B （protein kinase B， AKT） /Zeste 增強(qiáng)子同源物2 （enhancer of Zeste homolog 2，EZH2） /AR信號(hào)通路增強(qiáng)CRPC 細(xì)胞對(duì)ENZA 的敏感性［14］。研究［15］ 發(fā)現(xiàn)： 敲低SOX8 通過靶向抑制Notch 信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)CRPC 細(xì)胞的ENZA 耐藥。但目前關(guān)于NDRG1 是否參與了CRPC ENZA 耐藥機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。

NDRG1 是NDRG 家族成員之一，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和耐藥等進(jìn)程，并在多種腫瘤中發(fā)揮抗癌作用。王蓓等［16］ 發(fā)現(xiàn)： NDRG1 在人卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)NDRG1 可抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤發(fā)展。崔喆等［17］ 研究發(fā)現(xiàn)：在結(jié)腸癌細(xì)胞中，NDRG1 通過上調(diào)抑癌基因p53 表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，進(jìn)而提高化療敏感性并抑制腫瘤進(jìn)展。YANG 等［18］發(fā)現(xiàn)：NDRG1 可以增強(qiáng)西妥昔單抗在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的敏感性。本研究結(jié)果顯示：與CRPC 親本C4-2 細(xì)胞比較， 耐藥株C4-2/ENZA 細(xì)胞IC50 明顯升高， 細(xì)胞中NDRG1、AR 和PSA 蛋白表達(dá)水平明顯降低； 過表達(dá)NDRG1 可抑制C4-2/ENZA 細(xì)胞中AR 信號(hào)通路活化，降低細(xì)胞IC50，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并提高細(xì)胞對(duì)ENZA 的敏感性， 提示NDRG1 參與了C4-2/ENZA 細(xì)胞耐藥過程，與上述其他腫瘤中有關(guān)NDRG1 的研究結(jié)果一致。但 NDRG1 是否通過調(diào)控 AR 信號(hào)通路影響C4-2/ENZA 耐藥性尚未完全闡明。

AR 是屬于核受體超家族中的類固醇受體，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、死亡和蛋白質(zhì)合成等進(jìn)程［19］。 AR 是腫瘤發(fā)生、 發(fā)展的關(guān)鍵因子， 是目前被廣泛發(fā)現(xiàn)治療癌癥的靶點(diǎn)之一［20-21］。研究［22］顯示： AR 異常表達(dá)被認(rèn)為是腫瘤耐藥的主要因素。AR 在乳腺癌耐藥株細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而下調(diào)其表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制癌細(xì)胞耐藥。在CRPC 中， 長(zhǎng)鏈非編碼 RNA （long noncodingRNA， lncRNA） NXTAR 可抑制AR 表達(dá)， 降低癌細(xì)胞ENZA 耐藥［23］。研究［24-25］ 顯示：EGF 是雄激素非依賴性AR 激活的關(guān)鍵因子，可通過激活下游磷脂酰肌醇3- 激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase， PI3K） /AKT 信號(hào)通路促進(jìn)AR 轉(zhuǎn)錄活性和CRPC 發(fā)展。本研究結(jié)果顯示：聯(lián)合EGF 處理后，細(xì)胞中AR 和PSA 蛋白表達(dá)水平及p-ARSer213/AR 和p-ARSer81/AR 比值均升高，提示EGF 處理可激活A(yù)R 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)， 這與HSIEH 等［26］ 研究結(jié)果一致。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示： EGF 處理NDRG1 過表達(dá)的C4-2/ENZA 細(xì)胞，可增強(qiáng)細(xì)胞增殖活性，升高細(xì)胞IC50， 降低細(xì)胞凋亡率， 提示EGF 可通過激活A(yù)R 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)逆轉(zhuǎn)NDRG1 對(duì)C4-2/ENZA 細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用，提高細(xì)胞耐藥性。

綜上所述，NDRG1 在C4-2 細(xì)胞ENZA 耐藥中起著關(guān)鍵作用，能夠抑制AR 通路逆轉(zhuǎn)CRPC 耐藥細(xì)胞株C4-2/ENZA 對(duì)ENZA 的耐藥性。NDRG1可能是CRPC 患者有效的治療靶點(diǎn)和預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：張鷹和萬朝輝參與論文設(shè)計(jì)、撰寫及修改，張鷹和蔣先訓(xùn)參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲取及分析。

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[基金項(xiàng)目] 湖南省衛(wèi)健委衛(wèi)生科研項(xiàng)目（D202304058812，D202213014836）