血必凈對(duì)抗NMDA 受體腦炎模型小鼠腦組織損傷及腦脊液中Th17/Treg 免疫失衡的改善作用

［摘 要］ 目的：探討血必凈對(duì)抗N-甲基-D-天門冬氨酸 （NMDA） 受體腦炎模型小鼠腦組織損傷及腦脊液（CSF） 中輔助性T 淋巴細(xì)胞17 （Th17） /調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞（Treg） 免疫失衡的影響，闡明其治療作用。方法：60只健康雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、低劑量血必凈組和高劑量血必凈組， 每組15 只。除對(duì)照組外， 其余3 組小鼠均給予抗原注射與免疫刺激結(jié)合法建立抗NMDA 受體腦炎模型，低和高劑量血必凈組小鼠分別給予腹腔注射5 和10 mL·kg－1 血必凈注射液。采用HE 染色觀察各組小鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)，TUNEL 法檢測(cè)各組小鼠腦組織海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元凋亡率，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 法檢測(cè)各組小鼠血清中白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10、IL-17 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β （TGF-β） 水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠CSF 中Th17 和Treg 細(xì)胞百分率，Westernblotting 法檢測(cè)各組小鼠腦組織中維甲酸相關(guān)核孤兒受體（RORγt）、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3 （Foxp3）、IL-10 和IL-17 蛋白表達(dá)水平， 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)各組小鼠腦組織中 IL-17 和 Foxp3 陽性細(xì)胞率。結(jié)果：HE染色，對(duì)照組小鼠腦組織海馬 CA1 區(qū)結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯病變；與對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織海馬CA1 區(qū)部分錐體細(xì)胞呈三角形固縮濃染，頂樹突拉長(zhǎng)，少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞脫失，組織稀疏；與模型組比較，低和高劑量血必凈組小鼠腦組織海馬CA1 區(qū)細(xì)胞損傷減小，形態(tài)恢復(fù)正常，排列較為整齊，且高劑量血必凈組小鼠腦組織海馬CA1 區(qū)損傷的改善情況更明顯。TUNEL 法，與對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元凋亡率明顯升高（Plt;0. 05）；與模型組比較，低和高劑量血必凈組小鼠腦組織海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元凋亡率明顯降低（Plt;0. 05）；與低劑量血必凈組比較，高劑量血必凈組小鼠腦組織海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元凋亡率明顯降低（Plt;0. 05）。ELISA 法，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中IL-6 和IL-17 水平明顯升高（Plt;0. 05），IL-10 和TGF-β 水平明顯降低（Plt;0. 05）；與模型組比較，低和高劑量血必凈組小鼠血清中IL-6 和IL-17 水平明顯降低（Plt;0. 05），IL-10 和TGF-β水平明顯升高（Plt;0. 05）；與低劑量血必凈組比較，高劑量血必凈組小鼠血清中IL-6 和IL-17 水平明顯降低（Plt;0. 05），IL-10 和TGF-β 水平明顯升高（Plt;0. 05）。流式細(xì)胞術(shù)，與對(duì)照組比較，模型組小鼠CSF 中CD4+IL-17A+Th17 細(xì)胞百分率明顯升高（Plt;0. 05），CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞百分率明顯降低（Plt;0. 05）；與模型組比較，低和高劑量血必凈組小鼠CSF 中CD4+IL-17A+Th17 細(xì)胞百分率明顯降低（Plt;0. 05），CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞百分率明顯升高（Plt;0. 05）；與低劑量血必凈組比較，高劑量血必凈組小鼠CSF中CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞百分率明顯降低（Plt;0. 05），CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞百分率明顯升高（Plt;0. 05）。Western blotting 法，與對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織中RORγt和IL-17 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05），F(xiàn)oxp3 和IL-10 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 05）；與模型組比較， 低和高劑量血必凈組小鼠腦組織中RORγt 及IL-17 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 05），F(xiàn)oxp3 和IL-10 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）；與低劑量血必凈組比較，高劑量血必凈組小鼠腦組織中RORγt 和IL-17 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 05），F(xiàn)oxp3 和IL-10 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）。免疫組織化學(xué)染色法，與對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織中IL-17 陽性細(xì)胞率明顯升高（Plt;0. 05），F(xiàn)oxp3 陽性細(xì)胞率明顯降低（Plt;0. 05）；與模型組比較，低和高劑量血必凈組小鼠腦組織中IL-17 陽性細(xì)胞率明顯降低（Plt;0. 05），F(xiàn)oxp3 陽性細(xì)胞率明顯升高（Plt;0. 05）； 與低劑量血必凈組比較， 高劑量血必凈組小鼠腦組織中IL-17 陽性細(xì)胞率明顯降低（Plt;0. 05），F(xiàn)oxp3 陽性細(xì)胞率明顯升高 （Plt;0. 05）。結(jié)論：血必凈能夠有效改善抗NMDA受體腦炎小鼠腦組織損傷，調(diào)控細(xì)胞因子水平，干預(yù)抗NMDA 受體腦炎小鼠Th17/Treg 免疫失衡現(xiàn)象。

［關(guān)鍵詞］ 抗N- 甲基-D- 天門冬氨酸受體腦炎； 血必凈； 神經(jīng)元凋亡； 輔助性T 淋巴細(xì)胞17；調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞； 免疫失衡

［中圖分類號(hào)］ R512.3 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

抗N- 甲基-D- 天門冬氨酸（N-methyl-Daspartate，NMDA） 受體腦炎是一種由抗NMDA受體抗體介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，主要發(fā)生在兒童和女性人群中［1］?？筃MDA 受體腦炎患者表現(xiàn)出的臨床癥狀主要包括精神行為異常、記憶或認(rèn)知缺陷、癲癇發(fā)作、中樞性通氣不暢和運(yùn)動(dòng)障礙［2］。由于早期缺乏典型的臨床表現(xiàn)和疾病特異性檢測(cè)方案，該疾病常被誤診為病毒性腦炎或精神疾病等。近年來，抗NMDA 受體腦炎相關(guān)研究不斷深入。研究［3-4］ 發(fā)現(xiàn)：該疾病多與腫瘤，尤其是畸胎瘤有關(guān)，也與感染和遺傳等因素有關(guān)，但其確切病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確。T 淋巴細(xì)胞是淋巴細(xì)胞中數(shù)量最多且功能復(fù)雜的一類細(xì)胞， 包括CD4+T 淋巴細(xì)胞和CD8+T 淋巴細(xì)胞兩大類。其中，CD4+T 淋巴細(xì)胞協(xié)調(diào)各種免疫反應(yīng)以應(yīng)對(duì)各種致病病原體的攻擊，活化的CD4+T 淋巴細(xì)胞可分化為具有不同功能的效應(yīng)細(xì)胞，這些細(xì)胞類型主要有輔助性T 淋巴細(xì)胞（helper T lymphocyte，Th） 1、Th2、Th17 和調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞（regulatory Tlymphocyte，Treg） 等［5］。研究［6-7］顯示：Th17/Treg免疫失衡是誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病的主要機(jī)制，并已在病毒性腦炎患兒血漿中檢測(cè)到Th17 細(xì)胞百分率升高和Treg 細(xì)胞百分率降低， 呈現(xiàn)Th17/Treg 比例失衡的現(xiàn)象［8］。血必凈是經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于膿毒癥、胰腺炎、心臟疾病、呼吸系統(tǒng)疾病和全身炎癥反應(yīng)綜合征等多種臨床疾病治療的中藥注射液，其具有清熱解毒、行氣活血和化瘀止痛的功效，目前臨床應(yīng)用也越來越廣泛［9］。研究［10］ 顯示： 血必凈能夠調(diào)控Th17 和Treg 細(xì)胞分化并抑制炎癥反應(yīng)， 緩解早期過度的先天性免疫反應(yīng)，維持機(jī)體內(nèi)Th17/Treg 免疫系統(tǒng)平衡， 從而對(duì)膿毒癥小鼠休克起到保護(hù)作用。然而，關(guān)于血必凈對(duì)抗NMDA 受體腦炎的影響及其作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過構(gòu)建抗NMDA 受體腦炎小鼠模型， 探討血必凈對(duì)該模型小鼠的治療效果，并分析其調(diào)控Th17/Treg 免疫失衡的作用機(jī)制，為血必凈治療抗NMDA 受體腦炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物、主要試劑和儀器

無特定病原體級(jí)健康C57BL/6J 小鼠60 只， 雄性， 6～8 周齡，體質(zhì)量（20±2） g，購(gòu)于海南省藥品檢驗(yàn)所，動(dòng)物使用許可證號(hào)： SYXK （瓊） 2021-0009； 將所有小鼠飼養(yǎng)于溫度為20 ℃～24 ℃、相對(duì)濕度為50%～70% 和12 h 明暗交替的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)，該環(huán)境通風(fēng)良好，并確保食物和水源供應(yīng)充足，1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；本研究獲得海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：20220926158）。血必凈注射液購(gòu)于天津紅日藥業(yè)股份有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20040033）。GluN1359-378 購(gòu)于廣州卓一生物科技公司， 結(jié)核桿菌H37Ra 購(gòu)于美國(guó)BD 公司，完全弗氏佐劑、百日咳桿菌毒素和戊四氮購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司， HE 染色試劑盒和TUNEL 染色試劑盒購(gòu)于北京百奧博萊生物公司，小鼠血清白細(xì)胞介素（interleukin，IL） -6、IL-10、IL-17 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β （transforming growth factor-β，TGF-β）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbentassay，ELISA） 試劑盒購(gòu)于武漢華美生物工程研究所， 4'， 6-二脒基-2-苯基吲哚（4'， 6-diamidino-2-phenylindole， DAPI） 染液、放射免疫沉淀分析（radio immunoprecipitation assay， RIPA） 裂解液、聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride， PVDF）和電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence， ECL）試劑液購(gòu)于上海碧云天生物研究所，過氧化酶阻斷劑購(gòu)于廣州安必平醫(yī)藥科技公司， 二氨基聯(lián)苯胺（3， 3'-diaminobenzidine， DAB） 顯色試劑盒購(gòu)于北京普非生物科技公司， 異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate， FITC） 標(biāo)記的CD4 抗體、別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin， APC） 標(biāo)記的CD25 抗體、多甲藻黃素- 葉綠素- 蛋白質(zhì)復(fù)合物（peridinin-chlorophyll-protein complex， PerCP） -花菁染料5. 5 （Cyanine5. 5，Cy5. 5） 標(biāo)記的IL-17 抗體、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE） 標(biāo)記的叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3 （forkhead box P3， FOXP3） 抗體、兔抗FOXP3 多克隆抗體、兔抗維甲酸相關(guān)孤兒受體γt（retinoic acid related orphan receptor-gamma-t，RORγt） 多克隆抗體、兔抗IL-10 單克隆抗體、兔抗IL-17 單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體均購(gòu)于英國(guó)Abcam 公司。光學(xué)顯微鏡購(gòu)于日本Olympus 公司，Elx800 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó) Bio-Tek 公司，F(xiàn)ACSCalibur 型流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó) BD 公司，DYY-6B 型電泳儀購(gòu)于北京市六一儀器廠。

1. 2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備、分組及給藥

將 60只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、低劑量血必凈組和高劑量血必凈組，每組15 只。除對(duì)照組外，其余3 組小鼠均建立抗NMDA 受體腦炎小鼠模型，具體參考文獻(xiàn)［11］ 方法。將200 μg GluN1359-378 溶解于100 μL 磷酸鹽緩沖液（phosphate bufferedsaline，PBS） 中，再與含600 μg 結(jié)核桿菌H37Ra 的完全弗氏佐劑等體積混合，乳化成劑后備用。將小鼠全身消毒，四肢均注射50 μL 上述方法制備的混合乳劑， 并腹腔注射200 μL 含200 ng 百日咳桿菌毒素的生理鹽水，48 h 后再注射1 次。2 周后，給予腹腔注射50 mg·kg－1戊四氮，制備抗NMDA 受體腦炎小鼠模型。對(duì)照組小鼠在造模組小鼠注射各藥劑時(shí)注射等量生理鹽水。造模結(jié)束后，低和高劑量血必凈組小鼠分別通過腹腔注射5 和10 mL·kg－1血必凈注射液，每12 h 注射1 次，共給藥6 次。給藥結(jié)束2 周后，各組小鼠通過腹主動(dòng)脈取血，采集腦脊液，處死小鼠后取腦組織，將一部分腦組織置于4% 多聚甲醛中固定，另一部分在液氮中迅速冷凍后保存于－80 ℃ 冰箱備用。采集小鼠眼眶血，檢測(cè)血清中抗NMDA 受體IgG 抗體陽性， 即為抗NMDA 受體腦炎小鼠造模成功。

1. 3 HE 染色觀察各組小鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)

將各組小鼠腦組織固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，在切片機(jī)上切成厚度約為4 μm 的組織切片。在55 ℃烤箱內(nèi)處理30 min，二甲苯透明，梯度乙醇水化，蘇木素染色5 min， 流水下沖洗， 伊紅染色1 min，流水下沖洗， 再次常規(guī)脫水、透明， 中性樹膠封片，晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)并拍照。

1. 4 TUNEL法檢測(cè)各組小鼠腦組織海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率

將各組小鼠腦組織海馬 CA1區(qū)切片進(jìn)行脫水透明處理后， PBS 緩沖液清洗， 滴加20 mg·L－ 1 蛋白酶K 溶液于切片上， 室溫水解20 min，蒸餾水洗滌，滴加末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxyribonucleotidyl transferase， TdT）緩沖液，室溫處理5 min，濾紙吸去多余液體，滴加TdT 酶反應(yīng)液，37 ℃下避光孵育1 h，PBS 緩沖液清洗切片。再次滴加DAPI 染液，室溫避光孵育10 min，蒸餾水沖洗切片，晾干，以含抗熒光淬滅劑的封片液封片。熒光顯微鏡下觀察各組小鼠腦組織染色情況，TUNEL 陽性細(xì)胞呈綠色熒光，即為凋亡細(xì)胞。計(jì)數(shù)隨機(jī)5 個(gè)視野下TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果取平均值，計(jì)算TUNEL 陽性細(xì)胞率，即為神經(jīng)元凋亡率。TUNEL 陽性細(xì)胞率=TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1. 5 ELISA 法檢測(cè)各組小鼠血清中 IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β水平

將采集的各組小鼠、血液樣品室溫靜置1 h，置于離心機(jī)中，以4 ℃、4 000 r·min－1離心10 min， 獲得血清。采用ELISA 試劑盒檢測(cè)各組小鼠血清中IL-6、IL-10、IL-17 和TGF- β 水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。測(cè)定后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組小鼠血清中細(xì)胞因子水平。

1. 6 流 式 細(xì) 胞 術(shù) 檢 測(cè) 各 組 小 鼠 腦 脊 液（cerebrospinal fluid，CSF）中 Th17和 Treg 細(xì) 胞 百分率

取收集的各組小鼠 CSF 2. 5 mL，以4 ℃、1 000 r·min－1離心10 min，棄上清留沉淀，加入適量PBS 緩沖液重懸沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106 mL－1。吸取50 μL 懸液至干凈流式管內(nèi)， 分別加入5 μLCD4-FITC 抗體和5 μL CD25-APC 抗體， 混合均勻， 室溫避光孵育30 min，將細(xì)胞在固定或透化溶液中處理30 min，再加入5 μL IL-17-PerCP-Cy5. 5抗體和5 μL FOXP3-PE抗體，混勻后繼續(xù)孵育30 min，PBS 緩沖液清洗并再次離心重懸，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并計(jì)算各組小鼠CSF 中Th17 和Treg 細(xì)胞百分率。

1. 7 Western blotting 法檢測(cè)各組小鼠腦組織中RORγt、FOXP3、IL-10和 IL-17蛋白表達(dá)水平

將凍存的小鼠腦組織取出，剪碎并加入液氮研磨，添加適量RIPA 溶液裂解，提取總蛋白，BCA 法測(cè)定濃度。將蛋白煮沸5 min，制備10%SDS-PAGE 凝膠，將冷卻后的蛋白等量加入膠孔進(jìn)行上樣，恒壓電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。轉(zhuǎn)膜完畢后，以5% 脫脂奶粉作為封閉液， 置于搖床中緩慢搖動(dòng)， 室溫封閉1 h。立即加入稀釋后的一抗（1∶1 000），置于4 ℃下孵育。次日，棄一抗，TBST洗溶液膜， 加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。結(jié)束后，TBST 溶液洗膜， ECL 化學(xué)發(fā)光劑顯影。采用Image ProPlus 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 8 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)各組小鼠腦組織中IL-17和FOXP3陽性細(xì)胞率

將各組小鼠腦組織切片進(jìn)行脫水透明， 置于微波爐中高溫加熱修復(fù)抗原。室溫晾涼，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育10 min，10% 山羊血清室溫封閉30 min。分別滴加兔抗IL-17 單克隆抗體和兔抗FOXP3 多克隆抗體，使液體均勻覆蓋切片， 置于4 ℃ 下孵育。次日，PBS 緩沖液沖洗， 甩干切片， 滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體（1∶1 000）， 室溫下孵育30 min。PBS 緩沖液沖洗， DAB 顯色， 蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠腦組織染色情況并拍照，胞質(zhì)或胞核呈棕色至褐色為陽性，計(jì)數(shù)隨機(jī)5 個(gè)視野下蛋白陽性細(xì)胞數(shù)， 結(jié)果取平均值， 計(jì)算IL-17 和FOXP3陽性細(xì)胞率。IL-17 或FOXP3 陽性細(xì)胞率=IL-17 或FOXP3 陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1. 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 23. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠神經(jīng)元凋亡率，血清中IL-6、IL-10、IL-17 和TGF-β 水平，CSF 中Th17 和Treg細(xì)胞百分率，腦組織中RORγt、FOXP3、IL-10 和IL-17 蛋白表達(dá)水平及IL-17 和FOXP3 陽性細(xì)胞率均符合正態(tài)分布，以x±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 各組小鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)

對(duì)照組小鼠腦組織海馬CA1 區(qū)結(jié)構(gòu)清晰， 未見明顯病變。與對(duì)照組比較， 模型組小鼠腦組織海馬CA1 區(qū)部分錐體細(xì)胞呈三角形固縮濃染，頂樹突拉長(zhǎng)，少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞脫失，組織稀疏。與模型組比較，低劑量血必凈組和高劑量血必凈組小鼠腦組織海馬CA1 區(qū)細(xì)胞損傷減小，形態(tài)恢復(fù)正常，排列較為整齊，且高劑量血必凈組小鼠腦組織海馬CA1 區(qū)損傷的改善情況更明顯。見圖1。

2. 2 各組小鼠腦組織海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元凋亡率

與對(duì)照組比較， 模型組小鼠腦組織海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元凋亡率明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較， 低和高劑量血必凈組小鼠腦組織海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元凋亡率明顯降低（Plt;0. 05）。與低劑量血必凈組比較， 高劑量血必凈組小鼠腦組織海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元凋亡率明顯降低（ Plt;0. 05）。見圖2 和3。

2. 3 各組小鼠血清中 IL-6、IL-10、IL-17和 TGF-β水平

與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中 IL-6和IL-17 水平明顯升高（Plt;0. 05）， IL-10 和TGF- β水平明顯降低（Plt;0. 05）。與模型組比較， 低和高劑量血必凈組小鼠血清中IL-6 及IL-17 水平明顯降低（Plt;0. 05）， IL-10 和TGF- β 水平明顯升高（Plt;0. 05）。與低劑量血必凈組比較，高劑量血必凈組小鼠血清中IL-6 和IL-17 水平明顯降低（Plt;0. 05），IL-10 和TGF-β 水平明顯升高（Plt;0. 05）。見表1。

2. 4 各組小鼠 CSF 中 Th17 和 Treg 細(xì)胞百分率

與對(duì)照組比較，模型組小鼠CSF中CD4+IL-17A+Th17 細(xì)胞百分率明顯升高（Plt;0. 05）， CD25+FOXP3+Treg 細(xì)胞百分率明顯降低（Plt;0. 05）。與模型組比較， 低和高劑量血必凈組小鼠CSF 中CD4+IL-17A+Th17 細(xì)胞百分率明顯降低（Plt;0. 05）， CD25+FOXP3+Treg 細(xì)胞百分率明顯升高（Plt;0. 05）。與低劑量血必凈組比較， 高劑量血必凈組小鼠CSF 中CD4+IL-17A+Th17 細(xì)胞百分率明顯降低（Plt;0. 05），CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞百分率明顯升高（Plt;0. 05）。見圖4 和5。

2. 5 各組小鼠腦組織中 RORγt、FOXP3、IL-10和IL-17蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織中RORγt 和IL-17 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05），F(xiàn)OXP3 和IL-10 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 05）。與模型組比較，低和高劑量血必凈組小鼠腦組織中RORγt 及IL-17 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 05）， FOXP3 和 IL-10 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）。 與低劑量血必凈組比較， 高劑量血必凈組小鼠腦組織中RORγt 和IL-17 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 05），F(xiàn)OXP3 和IL-10 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）。見圖6。

2. 6 各組小鼠腦組織中 IL-17和 FOXP3陽性細(xì)胞率

與對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織中IL-17 陽性細(xì)胞率明顯升高（Plt;0. 05），F(xiàn)OXP3 陽性細(xì)胞率明顯降低（Plt;0. 05）。與模型組比較， 低和高劑量血必凈組小鼠腦組織中IL-17 陽性細(xì)胞率明顯降低（Plt;0. 05）， FOXP3 陽性細(xì)胞率明顯升高（Plt;0. 05）。與低劑量血必凈組比較，高劑量血必凈組小鼠腦組織中IL-17 陽性細(xì)胞率明顯降低（Plt;0. 05）， FOXP3 陽性細(xì)胞率明顯升高（Plt;0. 05）。見圖7 和8。

3 討 論

目前，抗NMDA 受體腦炎的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究［12］ 顯示： 100 例出現(xiàn)腦炎體征和精神癥狀的患者中有77 例經(jīng)檢測(cè)呈抗NMDA 受體抗體陽性，主要?dú)w因于人體對(duì)病原體表達(dá)非特異性免疫反應(yīng)。NMDA 受體是由甘氨酸結(jié)合NR1 亞基和谷氨酸結(jié)合NR2 亞基組成的四聚體復(fù)合物， 這些亞基聚集形成具有不同突觸定位、生理和藥理學(xué)特性及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)特性的受體亞型，參與調(diào)節(jié)突觸傳遞和促發(fā)突觸重塑。當(dāng)抗NMDA 受體抗體產(chǎn)生后，其與NMDA 受體結(jié)合使受體從細(xì)胞表面內(nèi)化，導(dǎo)致受體功能減退，從而引起臨床上異常的精神表現(xiàn)［13］。預(yù)防NMDA 受體功能障礙的藥物或策略尚未取得較好效果，多數(shù)藥物對(duì)NMDA 受體亞型無特異性。一旦確診為抗NMDA 受體腦炎，大部分患者將接受包括皮質(zhì)類固醇在內(nèi)的免疫療法、靜脈注射免疫球蛋白、血漿置換或使用利妥昔單抗和環(huán)磷酰胺進(jìn)行治療［14-15］。然而，這些方法無法有效降低鞘內(nèi)抗體滴度，部分患者在治療后預(yù)后仍較差。因此，闡明抗NMDA 受體腦炎發(fā)病機(jī)制并探究新型治療藥物與靶點(diǎn)是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的重要內(nèi)容。

血必凈對(duì)內(nèi)毒素具有拮抗作用，并可抑制腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF） 的釋放，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷，促進(jìn)免疫功能的恢復(fù)，因此血必凈可在多種疾病中發(fā)揮治療作用。CHEN 等［16］研究顯示：血必凈可以減少促炎細(xì)胞因子的分泌，如IL-6、IL-13 和TNF-α，減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激， 從而抑制急性肺損傷。LIU 等［17］ 研究顯示：血必凈可改善膿毒癥大鼠腎臟灌注和氧合，抑制腎臟炎癥，從而改善大鼠腎功能障礙。韓睿等［18］ 研究顯示：血必凈可以減少大鼠缺血性腦損傷的腦梗死范圍并降低神經(jīng)功能缺損評(píng)分，對(duì)大鼠起到神經(jīng)保護(hù)作用。研究［19］ 顯示：血必凈具有抵抗包括單純皰疹在內(nèi)的多種病毒復(fù)制功能，并能夠抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和病毒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)， 為血必凈抗病毒感染的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。本研究結(jié)果顯示： 分別經(jīng)低劑量和高劑量血必凈注射液治療抗NMDA 受體腦炎小鼠后，小鼠腦組織海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元損傷減輕， 神經(jīng)元凋亡減少， 提示血必凈能夠?qū)筃MDA 受體腦炎小鼠腦組織起到保護(hù)作用。

Th17 細(xì)胞從初始T 淋巴細(xì)胞中分化而來， 以特異性分泌高水平IL-17 為特征，此外，Th17 細(xì)胞還可分泌IL-6、IL-21 和TNF-α 等細(xì)胞因子。Th17細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，其與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過敏性哮喘、自身免疫性腦炎及其他自身免疫性疾病有密切關(guān)聯(lián)［20-21］。 Treg 細(xì)胞是參與多種免疫調(diào)節(jié)的T淋巴細(xì)胞亞群，其主要分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF- β， 并可以通過抑制效應(yīng)T 淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞活性，減少組織損傷，控制免疫反應(yīng)并保持免疫耐受性［22］。Th17 細(xì)胞與Treg 細(xì)胞在分化和功能上相互制約， 從而維持機(jī)體免疫平衡。當(dāng)Th17 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞數(shù)量或功能異常時(shí)，會(huì)引起機(jī)體免疫失衡，進(jìn)而導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示：抗NMDA 受體腦炎小鼠血清中IL-6和IL-17水平升高， IL-10 和TGF-β 水平降低，CSF 中CD4+IL-17A+Th17 細(xì)胞百分率升高，CD25+FOXP3+Treg 細(xì)胞百分率降低，提示小鼠血清中Th17/Treg 細(xì)胞比例失衡。經(jīng)低和高劑量血必凈治療的抗NMDA 受體腦炎小鼠血清中IL-6 及IL-17 水平降低，IL-10 和TGF-β 水平升高，同時(shí)腦脊液中 CD4+IL-17A+Th17 細(xì)胞百分率降低，CD25+FOXP3+Treg 細(xì)胞百分率升高，提示血必凈能夠改善抗NMDA 受體腦炎小鼠的Th17/Treg細(xì)胞比例失衡現(xiàn)象。

本研究結(jié)果顯示：抗NMDA 受體腦炎小鼠腦組織中RORγt和IL-17蛋白表達(dá)水平升高，F(xiàn)OXP3和IL-10 蛋白表達(dá)水平降低，IL-17 陽性細(xì)胞率升高，F(xiàn)OXP3 陽性細(xì)胞率降低；而經(jīng)低和高劑量血必凈治療的抗NMDA 受體腦炎小鼠腦組織中RORγt 及IL-17 蛋白表達(dá)水平降低，F(xiàn)OXP3 和IL-10 蛋白表達(dá)水平升高，IL-17 陽性細(xì)胞率降低，F(xiàn)OXP3 陽性細(xì)胞率升高。RORγt 是Th17 細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，可以誘導(dǎo)Th17 細(xì)胞產(chǎn)生和分化，參與Th17 細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［23］。FOXP3 是Treg 細(xì)胞的特異性分子標(biāo)志物， 在Treg 細(xì)胞分化和功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［24］。提示血必凈能夠調(diào)節(jié)抗NMDA 受體腦炎小鼠Th17/Treg 細(xì)胞比例失衡，從而改善抗NMDA 受體腦炎小鼠腦組織損傷。

綜上所述，血必凈能夠有效改善抗NMDA 受體腦炎小鼠腦組織損傷，干預(yù)抗NMDA 受體腦炎小鼠的Th17/Treg 免疫失衡現(xiàn)象，改善其腦組織損傷，本研究結(jié)果為抗NMDA 受體腦炎的治療及發(fā)病機(jī)制的研究提供了參考。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：陳琳和曾超勝參與論文選題、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及論文撰寫，閆麗敏和邢槐杰參與實(shí)驗(yàn)操作及數(shù)據(jù)收集，陳敏和黎曉艷參與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及論文審校。

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[基金項(xiàng)目] 海南省科技廳社會(huì)發(fā)展類重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（ZDYF2022SHFZ291）