氯己定對(duì)糞腸球菌耐藥性和致病性的影響及其機(jī)制

［摘 要］ 目的：探討長(zhǎng)期使用氯己定對(duì)糞腸球菌（E. faecalis）耐藥性的影響，并闡明其作用機(jī)制。方法：將E. faecalis標(biāo)準(zhǔn)菌株反復(fù)暴露于氯己定中傳代10代，記錄每一次傳代時(shí)的最低抑菌濃度（MIC）值。收集第10 代且MIC 值增加的細(xì)菌，即為E. faecalis 氯己定耐藥菌株（E. faecalis-Cs）。繪制2 種菌株生長(zhǎng)曲線，透射電子顯微鏡觀察2 種菌株形態(tài)表現(xiàn)，結(jié)晶紫染色法檢測(cè)2 種菌株細(xì)菌生物膜形成量，微生物黏著碳?xì)浠衔铮∕ATH） 法檢測(cè)2 種菌株細(xì)菌疏水率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測(cè)2種菌株細(xì)菌生物膜中S-核糖基高半胱氨酸裂解酶 （LuxS） mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：隨著傳代次數(shù)（第0～10 代） 的增加，E. faecalis 的MIC 值逐漸升高。E. faecalis 和E. faecalis-Cs 的生長(zhǎng)曲線無明顯差異。透射電鏡，E. faecalis 和E. faecalis-Cs 均呈橢圓形或雙球型，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整，邊緣光滑，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，2 種細(xì)菌形態(tài)大小和細(xì)胞壁厚度及完整性方面無明顯差異。結(jié)晶紫染色法，與E. faecalis比較，E. faecalis-Cs生物膜形成量明顯增加（Plt;0. 05）。MATH 法，與E. faecalis比較，E. faecalis-Cs的細(xì)菌疏水率明顯升高（Plt;0. 05）。RT-qPCR 法， 與E. faecalis 比較， E. faecalis-Cs 細(xì)菌生物膜中LuxS mRNA表達(dá)水平明顯升高 （Plt;0. 05）。結(jié)論：E. faecalis在反復(fù)暴露于氯己定后會(huì)產(chǎn)生耐藥性，耐藥菌株致病能力增強(qiáng)。群體感應(yīng)（QS） 系統(tǒng) LuxS 基因高表達(dá)和更強(qiáng)的細(xì)菌生物膜形成能力可能是E. faecalis 對(duì)氯己定產(chǎn)生耐藥性的潛在機(jī)制。

［關(guān)鍵詞］ 糞腸球菌； 氯己定； 耐藥性； 糞腸球菌氯己定耐藥菌株； 群體感應(yīng)系統(tǒng)

［中圖分類號(hào)］ Q939.121 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

糞腸球菌（Enterococcus faecalis， E. faecalis）是一種革蘭陽性兼性厭氧菌，也是導(dǎo)致持續(xù)難治性根尖周炎最常見的細(xì)菌之一，可定植于根管壁的牙本質(zhì)小管內(nèi)形成生物膜［1-2］。根尖周炎治療的有效性主要取決于根管內(nèi)E. faecalis 生物膜清除程度，因此根管治療術(shù)是控制根尖周感染的關(guān)鍵。氯己定作為最常見的根管沖洗劑之一，在臨床上被大量使用。氯己定是一種雙胍類廣譜抗菌劑，在低濃度時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌中鈣離子和鎂離子的置換及細(xì)胞壁中鉀離子的流失，從而產(chǎn)生抑菌作用。高濃度氯己定環(huán)境會(huì)導(dǎo)致所有細(xì)胞內(nèi)主要成分滲出至細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)菌裂解死亡， 從而產(chǎn)生殺菌作用［3］。研究［4］ 顯示：長(zhǎng)期使用氯己定可能會(huì)導(dǎo)致部分口腔微生物產(chǎn)生耐藥性。EMILSON 等［5］ 從長(zhǎng)期使用氯己定漱口水的患者口腔中分離出對(duì)氯己定敏感性降低的血鏈球菌。研究［6-7］ 表明：E. faecalis 對(duì)多種抗生素的耐藥性較高，但目前關(guān)于E. faecalis 對(duì)氯己定耐藥性的研究較少，具體機(jī)制尚未完全闡明。E. faecalis具有形成生物膜的能力，可在根管壁上形成牢固附著的生物膜，利用牙本質(zhì)和牙周膜的血清作為其營養(yǎng)來源， 可耐受抗菌劑和高堿性環(huán)境等極端環(huán)境［8］。同時(shí)， E. faecalis 含有多種毒力因子， 這些毒力因子有利于細(xì)菌之間的質(zhì)粒交換和黏附［9-10］。

持留菌狀態(tài)是指細(xì)菌中可耐受致死濃度抗生素的亞群，E. faecalis 可在低氧、強(qiáng)堿、高鹽、寡營養(yǎng)狀態(tài)和干燥的環(huán)境中以持留菌狀態(tài)生存，并可誘導(dǎo)羥基磷灰石沉淀形成鈣化生物膜，使其對(duì)常用的根管消毒藥物不敏感［11］。待藥物被清除后， 持留菌狀態(tài)的E. faecalis 則恢復(fù)生長(zhǎng)能力，導(dǎo)致感染復(fù)發(fā)和炎癥遷延不愈［12］。群體感應(yīng)（quorum sensing，QS） 系統(tǒng)是細(xì)菌之間傳遞信號(hào)和調(diào)節(jié)群體行為的機(jī)制［13］。QS 系統(tǒng)為細(xì)菌種群密度依賴性調(diào)節(jié)機(jī)制，細(xì)菌與細(xì)菌之間可通過自誘導(dǎo)劑（autoinducer，AI）進(jìn)行交流。研究［14］ 證實(shí)： 細(xì)菌QS 系統(tǒng)與細(xì)菌耐藥性和生物膜形成有關(guān)，細(xì)菌可通過QS 系統(tǒng)產(chǎn)生信號(hào)分子，調(diào)節(jié)細(xì)菌的基因表達(dá)［15］。在E. faecalis中 QS 系統(tǒng)可由 S- 核糖基高半胱氨酸裂解酶（S-ribosylhomocysteine lyase， LuxS） 基因操控。目前E. faecalis 氯己定耐藥性與QS 系統(tǒng)之間的關(guān)系尚未完全闡明。本研究探討長(zhǎng)期使用氯己定對(duì)E. faecalis 耐藥性的影響， 初步闡明其作用機(jī)制，為相關(guān)疾病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 細(xì) 菌、 主 要 試 劑 和 儀 器

E. faecalisATCC29212 （廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），腦心浸出液（brain heart infusion， BHI） 培養(yǎng)基（英國Oxoid 公司）， 氯己定（北京索萊寶科技有限公司），結(jié)晶紫染料（北京酷來博科技有限公司），引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成，總RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RTqPCR）試劑盒（上海翌圣生物科技股份有限公司）。RT-qPCR 儀（型號(hào)： CFX96， 美國Bio-Rad公司），高速低溫冷凍離心機(jī)（型號(hào)：Sorvall ST8，美國Thermo 公司），酶標(biāo)儀（型號(hào)：Synergy-HT，美國Bio-Tek公司），透射電子顯微鏡（型號(hào)：HT7800，日本HITACHI 公司）。

1. 2 體 外 誘 導(dǎo) 耐 藥 菌 株

收 集 過 夜 培 養(yǎng) 的E. faecalis，離心后將其重懸于新鮮的BHI 培養(yǎng)基中，調(diào)整其濃度為1×107 CFU·L－1。將溶解于BHI培養(yǎng)基中的氯己定連續(xù)稀釋后， 取出100 μL 氯己定溶液， 將其與100 μL 調(diào)整后的菌懸液共同加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 以未接種細(xì)菌的BHI 培養(yǎng)基為對(duì)照。于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h， 記錄最低抑菌濃度（minimum inhibition concentration，MIC） 值。并將亞MIC 的細(xì)菌懸液吸出， 接種至含有相同濃度氯己定的新鮮BHI 培養(yǎng)基中， 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后5 000 r·min－ 1 離心5 min， 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS） 洗滌2 次以除去殘留的氯己定溶液。將離心后的細(xì)菌重懸于BHI 培養(yǎng)基中， 調(diào)整濃度， 繼續(xù)重復(fù)10 次。最后一次收集到的細(xì)菌即為 E. faecalis 氯己定耐藥菌株（E. faecalis chlorhexidine-resistant strains，E. faecalis-Cs）。氯己定體外誘導(dǎo)耐藥菌株在不含氯己定的BHI 瓊脂平板上連續(xù)傳代5 次，觀察其藥物耐受性是否穩(wěn)定存在，并于－80 ℃條件下存儲(chǔ)，以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1. 3 繪 制 2 種 菌 株 生 長(zhǎng) 曲 線

將 過 夜 培 養(yǎng) 的E. faecalis 和E. faecalis-Cs 菌株分別重懸于新鮮的BHI 培養(yǎng)基中， 然后加入至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL。于37 ℃條件下分別在培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12、24 和48 h 時(shí)，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)并記錄波長(zhǎng)600 nm 處的吸光度（A） 值，以A 值反映細(xì)菌懸液中的細(xì)菌數(shù)量，繪制E. faecalis 和E. faecalis-Cs菌株的生長(zhǎng)曲線。

1. 4 透射電子顯微鏡觀察 2種菌株形態(tài)表現(xiàn)

分別將E. faecalis 和E. faecalis-Cs 菌株以5 000 r·min－1離心5 min，PBS 緩沖液沖洗2 次，加入2. 5% 戊二醛溶液室溫避光固定30 min，4 ℃冰箱過夜。對(duì)樣品進(jìn)行包埋和制片，采用透射電子顯微鏡觀察2 種菌株形態(tài)表現(xiàn)。

1. 5 結(jié)晶紫染色法檢測(cè) 2種菌株細(xì)菌生物膜形成量

采用含1% 蔗糖的BHI培養(yǎng)基分別重懸E. faecalis和 E. faecalis-Cs 菌株， 調(diào)整細(xì)菌濃度至 1×108 CFU·L－1。將細(xì)菌懸液加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 于37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h。待生物膜形成后，去除上層培養(yǎng)基，PBS 緩沖液沖洗3 次。每孔加入100 μL 甲醇固定15 min，再加入100 μL 0. 1%結(jié)晶紫溶液，室溫染色5 min 后，PBS 緩沖液洗去多余染料后風(fēng)干。最后每孔中加入200 μL 95% 乙醇，室溫避光振蕩 30 min 后， 采用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)550 nm 處A 值，以生物膜A 值代表菌株細(xì)菌生物膜形成量。

1. 6 微生物黏著碳?xì)浠衔铮╩icrobial adhesionto hydrocarbons，MATH）法檢測(cè)2種菌株細(xì)菌疏水率

按照參考文獻(xiàn)［16］ 的方法，將培養(yǎng)24 h 的菌液以5 000 r·min－1 離心5 min，并在PUM 緩沖液中洗滌2 次后重懸， 檢測(cè)其在波長(zhǎng)600 nm 處A 值為A0。取3 mL 重懸后的菌液，加入400 μL 正十六烷，連續(xù)振蕩 1 min， 使其充分混勻， 隨后室溫靜置15 min， 待其分層后取下層水相， 于波長(zhǎng) 600 nm處檢測(cè)其最終A 值為A1， 以緩沖液為空白對(duì)照，計(jì)算2 種菌株細(xì)菌疏水率。 細(xì)菌疏水率= （A0－A1） /A0×100%。

1. 7 RT-qPCR 法 檢 測(cè) 2 種 菌 株 細(xì) 菌 生 物 膜 中LuxS mRNA 表 達(dá) 水 平

采 用 TRIzol 法 提 取E. faecalis 和E. faecalis-Cs 生物膜的總RNA，測(cè)定總RNA 濃度后，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后進(jìn)行擴(kuò)增。采用RTqPCR法檢測(cè)2 種細(xì)菌中LuxS mRNA 表達(dá)水平，反應(yīng)總體系為20 μL。引物序列：LuxS 上游引物，5'-CGTTGGAACATTTATTAGC-3'， 下游引物，5'-TAGTTTCCGCACTCTTTTG-3'； 16S 上游引物，5'-AAGCAACGCGAAGAACCTTA-3'，下游引物， 5'-GTCTCGCTAGAGTGCCCAAC-3'。以16S 為內(nèi)參， 反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性10 s，60 ℃退火，延伸30 s，循環(huán)40 次。采用2－△△Ct 法計(jì)算2 種菌株細(xì)菌中LuxS mRNA 表達(dá)水平。

1. 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraghPad Prism 8. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2 種菌株細(xì)菌生物膜形成量、細(xì)菌疏水率和細(xì)菌中LuxS mRNA 表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以x±s 表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 氯己定誘導(dǎo)E. faecalis的MIC值

將E. faecalis暴露于氯己定中連續(xù)培養(yǎng)10 代，由第0 代至第10代，E. faecalis 的MIC 值逐漸升高。提示E. faecalis 長(zhǎng)期暴露于氯己定中可以導(dǎo)致E. faecalis-Cs 產(chǎn)生，誘導(dǎo)的E. faecalis-Cs 在不含氯己定的BHI 瓊脂平板上連續(xù)傳代5 次后耐藥性穩(wěn)定存在。見圖1。

2. 2 2種菌株生長(zhǎng)曲線

E. faecalis和E. faecalis-Cs菌株均在培養(yǎng)0～6 h 內(nèi)迅速生長(zhǎng)，之后生長(zhǎng)速度逐漸減慢，最后進(jìn)入穩(wěn)定期。E. faecalis-Cs 菌株在培養(yǎng)6～12 h 時(shí)菌液渾濁度高于標(biāo)準(zhǔn)株，后趨于一致。2 種菌株整體生長(zhǎng)趨勢(shì)無明顯差異。見圖2。

2. 3 透 射 電 子 顯 微 鏡 觀 察 2 種 菌 株 形 態(tài) 表 現(xiàn)

E. faecalis 和E. faecalis-Cs 在透射電子顯微鏡下均呈橢圓形或雙球型， 細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整， 邊緣光滑，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，2 種細(xì)菌大小和細(xì)胞壁厚度及完整性方面無明顯差異。見圖3。

2. 4 2 種菌株細(xì)菌生物膜形成量

與 E. faecalis（2. 633±0. 134） 比較， E. faecalis-Cs 菌株細(xì)菌生物膜形成量（3. 333±0. 121） 明顯增加（Plt;0. 05）。

2. 5 2 種 菌 株 細(xì) 菌 疏 水 率

培 養(yǎng) 24 h 后 ， 與E. faecalis（5. 410%±0. 217%）比較，E. faecalis-Cs菌株的細(xì)菌疏水率（29. 403%±1. 784%） 明顯升高（Plt;0. 05）。

2. 6 2 種菌株細(xì)菌生物膜中 LuxS mRNA 表達(dá)水平

與 E. faecalis （1. 001±0. 051） 比 較，E. faecalis-Cs 細(xì)菌生物膜中LuxS mRNA 表達(dá)水平（1. 454±0. 050） 明顯升高（Plt;0. 05）。

3 討 論

對(duì)于E. faecalis 導(dǎo)致的難治性根尖周炎，臨床上通常采用根管治療術(shù)進(jìn)行處理，氯己定作為一種根管沖洗藥物被廣泛使用。研究［17］ 顯示：氯己定會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，盡管氯己定導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥多在實(shí)驗(yàn)室條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生，但在臨床中由氯己定導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)也應(yīng)被重視。

本研究結(jié)果顯示： E. faecalis 反復(fù)暴露于氯己定會(huì)導(dǎo)致其MIC 值持續(xù)升高， 證實(shí)了長(zhǎng)期使用氯己定會(huì)導(dǎo)致E. faecalis 產(chǎn)生耐藥性。研究［18］ 顯示：與標(biāo)準(zhǔn)株比較，部分耐藥株的生長(zhǎng)速度較標(biāo)準(zhǔn)株更為緩慢， 許多耐藥株通常會(huì)改變其細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)。MAVRI 等［19］ 研究發(fā)現(xiàn)： 對(duì)十六烷基吡啶（cetylpyridinium chloride， CPC） 產(chǎn)生耐藥性的大腸彎曲桿菌細(xì)胞膜更厚。本研究結(jié)果顯示：標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥菌株的生長(zhǎng)曲線及形態(tài)表現(xiàn)均無顯著差異，這可能是由于細(xì)菌種類和抗菌藥物的多樣性導(dǎo)致的。

細(xì)菌黏附能力與其致病性有密切關(guān)聯(lián)，黏附是細(xì)菌形成生物膜的第一步［20］。E. faecalis 不僅能夠黏附于側(cè)支根管、根管峽部和根尖三角區(qū)等不易清除的部位，還可能黏附于預(yù)備后的根管壁上，進(jìn)而再次形成生物膜， 導(dǎo)致炎癥遷延不愈［21］。本研究結(jié)果顯示：與標(biāo)準(zhǔn)菌株比較，耐藥菌株的生物膜形成量明顯增加，且細(xì)菌疏水率明顯升高，提示耐藥菌株的黏附能力和生物膜形成能力明顯增強(qiáng)，其致病能力也較強(qiáng)。

盡管使用抗菌藥物能夠清除細(xì)菌群體中大部分細(xì)菌，但同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生。目前關(guān)于細(xì)菌的耐藥機(jī)制已經(jīng)受到廣泛關(guān)注。研究［22-23］ 表明：細(xì)菌的耐藥性可能與QS 系統(tǒng)有關(guān)。隨著細(xì)菌密度的增加， AI 分子會(huì)在環(huán)境中積累， 激活其同源受體，調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，可通過影響外排泵表達(dá)水平、可移動(dòng)遺傳元件（mobile genetic elements，MGEs） 和雙組分調(diào)控系統(tǒng)等多種途徑調(diào)控細(xì)菌的耐藥性［14，24-25］。 在 E. faecalis 中，QS 系統(tǒng)主要是LuxS/AI-2 依賴性 QS 系統(tǒng)［26］。本研究結(jié)果顯示：與標(biāo)準(zhǔn)菌株比較，耐藥菌株的LuxS mRNA 表達(dá)水平明顯升高。研究［27］ 證實(shí)：LuxS 基因表達(dá)水平與生物膜形成能力呈正相關(guān)關(guān)系， 與本研究結(jié)果一致。提示E. faecalis 對(duì)氯己定的耐藥性可能與LuxS基因的高表達(dá)及更強(qiáng)的細(xì)菌生物膜形成能力有關(guān)。

綜上所述，E. faecalis 會(huì)對(duì)氯己定產(chǎn)生耐藥性，且耐藥菌株的致病性明顯增加，QS 系統(tǒng)LuxS 基因的高表達(dá)及更強(qiáng)的細(xì)菌生物膜形成能力可能是E. faecalis 對(duì)氯己定產(chǎn)生耐藥性的潛在機(jī)制。因此，有必要改進(jìn)氯己定或研發(fā)新的藥物以取代氯己定。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：徐智博參與文獻(xiàn)檢索、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集和分析及論文撰寫，姜鑫淼參與文獻(xiàn)檢索、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和論文撰寫，甄雨琦和白瑪曲珍參與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集及分析，孫夢(mèng)瑤參與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和討論， 孟秀萍參與論文寫作指導(dǎo)和審校。

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[基金項(xiàng)目] 吉林省財(cái)政廳科技項(xiàng)目（JCSZ2021893-23）