單核細(xì)胞趨化蛋白1 對(duì)肺癌A549 細(xì)胞遷移和侵襲的影響及其機(jī)制

［摘 要］ 目的：探討單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1） 對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲的影響，并闡明其作用機(jī)制。方法：采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 80例非小細(xì)胞肺癌 （NSCLC） 及癌旁正常肺組織中MCP-1 蛋白表達(dá)情況。體外培養(yǎng)人肺癌A549 細(xì)胞，MCP-1-小干擾RNA （siRNA） 實(shí)驗(yàn)分為空白組、陰性對(duì)照組（si-NC 組）、MCP-1-siRNA-1 組和MCP-1-siRNA-2 組；MCP-1 過表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、空載對(duì)照組（OE-NC 組， 轉(zhuǎn)染MCP-1 過表達(dá)空載質(zhì)粒）、過表達(dá)MCP-1 組（OE-MCP-1 組， 轉(zhuǎn)染MCP-1 過表達(dá)質(zhì)粒）、過表達(dá)MCP-1+ 細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK） 信號(hào)通路抑制劑PD98059 組（OE-MCP-1+PD98059 組，共轉(zhuǎn)染MCP-1 過表達(dá)質(zhì)粒和PD98059） 和PD98059 組（轉(zhuǎn)染PD98059）。分別將MCP-1-siRNA 和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肺癌A549 細(xì)胞，Western blotting 法驗(yàn)證各組A549 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 小室實(shí)驗(yàn)觀察各組A549 細(xì)胞遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)，Western blotting 法檢測(cè)各組A549 細(xì)胞中磷酸化ERK （p-ERK）、 總ERK （t-ERK） 和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT） 相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與癌旁組織比較，NSCLC 組織中 MCP-1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高 （Plt;0. 05）；NSCLC 組織中MCP-1 蛋白表達(dá)水平與TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)（Plt;0. 05）。與si-NC 組比較，MCP-1-siRNA-1 組和MCP-1-siRNA-2 組A549 細(xì)胞中MCP-1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 01）；與對(duì)照組和OE-NC 組比較， OE-MCP-1 組A549 細(xì)胞中MCP-1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，與si-NC 組比較，MCP-1-siRNA-1 組和MCP-1-siRNA-2 組細(xì)胞遷移率均明顯降低（Plt;0. 01）；與 OE-NC 組比較，OE-MCP-1 組細(xì)胞遷移率明顯升高（Plt;0. 01）；與 OE-MCP-1 組比較，OE-MCP-1+PD98059 組細(xì)胞遷移率明顯降低（Plt;0. 01）； 與 OE-MCP-1+PD98059 組比較，PD98059組細(xì)胞遷移率明顯降低（Plt;0. 01）。Transwell小室實(shí)驗(yàn)，與si-NC組比較，MCP-1-siRNA-1組和MCP-1-siRNA-2 組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（Plt;0. 01）； 與OE-NC 組比較， OE-MCP-1 組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加（Plt;0. 01）； 與OE-MCP-1 組比較， OE-MCP-1+PD98059 組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（Plt;0. 01）； 與 OE-MCP-1+PD98059 組比較， PD98059 組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（Plt;0. 01）。 Westernblotting 法， 與si-NC 組比較， MCP-1-siRNA-1 組和MCP-1-siRNA-2 組A549 細(xì)胞中p-ERK、波形蛋白（Vimentin） 和N-鈣黏蛋白（N-cadherin） 表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），E-鈣黏蛋白（E-cadherin） 表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01）； 與 OE-NC 組比較， OE-MCP-1 組 A549 細(xì)胞中p-ERK、Vimentin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01），E-cadherin 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 01）；與OE-MCP-1 組比較，OE-MCP-1+PD98059 組A549 細(xì)胞中p-ERK、Vimentin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 01），E-cadherin 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）；與OE-MCP-1+PD98059 組比較， PD98059 組A549 細(xì)胞中p-ERK 、Vimentin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或 Plt;0. 01）， E-cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01）。結(jié)論：MCP-1蛋白可上調(diào)肺癌A549細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞的遷移和侵襲，其作用機(jī)制與激活ERK 信號(hào)通路有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 單核細(xì)胞趨化蛋白1； 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶； 癌，非小細(xì)胞肺； 細(xì)胞侵襲； 細(xì)胞遷移

［中圖分類號(hào)］ R734. 2 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一， 其中80%～85% 為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lungcancer，NSCLC）。因其易復(fù)發(fā)、微轉(zhuǎn)移和預(yù)后差等特點(diǎn)，肺癌患者5 年生存率較低［1］。深入研究肺癌侵襲與轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制可為肺癌治療提供新的作用靶點(diǎn)。單核細(xì)胞趨化蛋白1 （monocytechemoattractant protein-1， MCP-1） 屬于趨化因子家族，參與調(diào)控機(jī)體炎癥。研究［2-5］ 顯示：MCP-1在多種腫瘤組織中過表達(dá)，可能通過激活CC 趨化因子受體（CC chemokine receptor， CCR） 2 或CCR4， 經(jīng)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellularregulated protein kinase， ERK）、 蛋白激酶B（protein kinase B， AKT） 和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 （signal transducer and activator oftranscription 3， STAT3） 等信號(hào)通路誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。目前， 關(guān)于 MCP-1調(diào)控肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究探討MCP-1 對(duì)NSCLC A549 細(xì)胞遷移和侵襲的影響， 初步闡明MCP-1 調(diào)控肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT 的信號(hào)通路，為肺癌治療提供新的思路。

1 資料與方法

1. 1 一般資料

收集80例2020年1—12月來源于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科的NSCLC 標(biāo)本。本研究已獲得錦州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。選取經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的NSCLC 標(biāo)本和距腫瘤邊緣5 cm 的癌旁正常肺組織。所有選取患者在術(shù)前均未接受過化療及放療。

1. 2 細(xì)胞、主要試劑和儀器

人肺癌細(xì)胞株 A549購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。RPMI-1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司， 胎牛血清購(gòu)自美國(guó) CLARKBioscience 公 司， MCP-1- 小干擾 RNA （smallinterfering RNA， siRNA） 購(gòu)自蘇州吉瑪生物有限公司，MCP-1 過表達(dá)質(zhì)粒GV657-MCP-1 購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因公司， Lipofectamine 3000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司， MCP-1、 波形蛋白（Vimentin）、N-鈣 黏 蛋 白（N-cadherin）、 E-鈣 黏 蛋 白（E-cadherin） 和β-actin 等抗體均購(gòu)自美國(guó)SAB 公司， 磷酸化ERK （phosphorylated ERK， p-ERK）和總ERK （total ERK， t-ERK） 抗體購(gòu)自沈陽(yáng)萬類生物技術(shù)有限公司， ERK 信號(hào)通路抑制劑PD98059 購(gòu)自美國(guó) MCE 公司， Matrigel 基底膠購(gòu)自美國(guó)BD 公司，Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)康寧生物技術(shù)有限公司， BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司， 免疫組織化學(xué)染色用MCP-1 抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity 公司，即用型免疫組織化學(xué)超敏SP 試劑盒、檸檬酸緩沖液和濃縮DAB 試劑盒購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)：Thermo Heracell 150l） 購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司，垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)：Bio-rad 1645050） 購(gòu)自美國(guó)伯樂公司， 顯影儀（型號(hào)： AmershamImager 600） 購(gòu)自日本GE 公司， 數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)（型號(hào)： Easy scan NFC） 購(gòu)自廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。

1. 3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) NSCLC 組織和癌旁正常肺組織中 MCP-1蛋白表達(dá)情況

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水， 并于 pH 值為 6. 0 的檸檬酸修復(fù)液中經(jīng)高壓抗原修復(fù) 3. 5 min， 3% H2O2 室溫下孵育10 min，清除內(nèi)源性過氧化物酶活性，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline， PBS） 沖洗 3 次，MCP-1 一抗4 ℃冰箱過夜。次日 PBS 緩沖液沖洗3 次，滴加二抗工作液。新鮮配制的DAB 顯色，蘇木素復(fù)染7 min， 自來水反藍(lán)30 min， 脫水透明后樹脂封片。 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：MCP-1 陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)， 以其內(nèi)出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒狀為陽(yáng)性。由2 位醫(yī)師采用雙盲法觀察每張切片，對(duì)每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)高倍視野。將切片中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分率計(jì)為分?jǐn)?shù)1：0 分，無陽(yáng)性細(xì)胞；1 分，陽(yáng)性細(xì)胞百分率lt;25%；2 分， 陽(yáng)性細(xì)胞百分率≥25% 但lt;50%； 3 分， 陽(yáng)性細(xì)胞百分率≥50%。按細(xì)胞中細(xì)胞顯色強(qiáng)度計(jì)為分?jǐn)?shù)2： 0 分， 細(xì)胞無顯色； 1 分， 細(xì)胞呈淺黃色（弱染色）；2 分，細(xì)胞呈棕黃色（中等染色）；3 分，細(xì)胞呈棕褐色（強(qiáng)染色）。分?jǐn)?shù)1×分?jǐn)?shù)2≥3 分計(jì)為陽(yáng)性， lt;3 分計(jì)為陰性。MCP-1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率=MCP-1 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1. 4 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染

肺癌 A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清和1% 青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫、5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代。MCP-1-siRNA 實(shí)驗(yàn)分為空白組、陰性對(duì)照組（si-NC 組）、MCP-1-siRNA-1 組和MCP-1-siRNA-2 組。細(xì)胞培養(yǎng)至密度為40%～50% 時(shí)，使用Lipofectamine 3000 包裹MCP-1-siRNA 干擾序列。siRNA 序列：MCP-1-siRNA-1 組，上游引物，5'-GCUCAUAGCAGCCACCUUCTT-3'， 下游引物， 5'-GAAGGUGGCUGCUAUGAGCTT-3'；MCP-1-siRNA-2 組， 上游引物， 5'-CAAACCCAAACUCCGAAGATT-3'，下游引物，5'-UCUUCGGAGUUUGGGUUUGTT-3'；陰性對(duì)照組，上游引物，5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，下游引物， 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。構(gòu)建MCP-1 過表達(dá)質(zhì)粒GV657-MCP-1，細(xì)胞培養(yǎng)至密度為70%～90% 時(shí)， 使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染。過表達(dá)MCP-1 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、空載對(duì)照組（OE-NC 組， 轉(zhuǎn)染MCP-1 過表達(dá)空載質(zhì)粒）、過表達(dá)MCP-1 組（OE-MCP-1 組， 轉(zhuǎn)染MCP-1 過表達(dá)質(zhì)粒）、過表達(dá)MCP-1+PD98059 組（OEMCP-1+PD98059 組， 共轉(zhuǎn)染MCP-1 過表達(dá)質(zhì)粒和 PD98059） 和 PD98059 組（轉(zhuǎn) 染 PD98059）。PD98059 濃度為10 μmol·L－1。轉(zhuǎn)染4～6 h 后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，采用Western blotting 法驗(yàn)證各組A549 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1. 5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組肺癌 A549細(xì)胞遷移率

收集處于對(duì)數(shù)期細(xì)胞，按每孔4×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板。轉(zhuǎn)染24 h 后，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度約90% 時(shí)， 使用 200 μL 槍頭劃痕，PBS 緩沖液洗滌3 次。0 h 時(shí)顯微鏡下觀察并拍照記錄，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后拍照，觀察細(xì)胞遷移情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次， 計(jì)算各組A549 細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率= （0 h 劃痕面積－24 h 劃痕面積） /0 h 劃痕面積×100%。

1. 6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組肺癌 A549細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)

Matrigel 膠和 RPMI-1640 培養(yǎng)液按1∶9 混合，上室每孔加入80 μL 已稀釋的Materigel膠，置于 37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 30 min，待其聚合成膠。轉(zhuǎn)染 24 h 后無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105 mL－1。上室每孔加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入600 μL 完全培養(yǎng)基。24 h 后吸去上室培養(yǎng)基，PBS 緩沖液洗滌 2 次，75% 甲醇固定30 min，PBS 緩沖液洗滌 2 次，0. 1% 結(jié)晶紫染色20 min，PBS 緩沖液洗滌 2 次。棉簽擦去上室未透膜的細(xì)胞，晾干小室。倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5 個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)， 計(jì)算各組A549 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)。

1. 7 Western blotting 法檢測(cè)各組肺癌 A549 細(xì)胞中p-ERK、t-ERK和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染48 h 后收集并裂解細(xì)胞， 離心收集上清液， BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈（polyacrylamide gel electrophoresis， PAGE），聚偏二氨乙烯（polyvinglidene difluoride， PVDF）轉(zhuǎn)膜， 5% 脫脂牛奶室溫封閉2 h 后， 分別加入相應(yīng)的一抗，4 ℃ 孵育過夜。次日，TBST 溶液洗去一抗， 室溫孵育二抗1 h， TBST 溶液洗滌后加入ECL 發(fā)光試劑，顯影，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 Graphpad Prism 9. 0. 2 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同臨床病理特征（包括性別、年齡、腫物最大徑、組織學(xué)類型、分化程度、TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等） 患者NSCLC 組織中MCP-1 蛋白表達(dá)情況以例數(shù)表示，采用χ2 檢驗(yàn)。各組肺癌A549 細(xì)胞遷移率、侵襲細(xì)胞數(shù)和 MCP-1、 ERK 及 EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布， 以-x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析， 組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 NSCLC組織和癌旁正常肺組織中 MCP-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率

與癌旁正常肺組織 （26. 2%） 比較， NSCLC 組織中 MCP-1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率（62. 5%） 明顯升高（Plt;0. 05）。NSCLC 組織中MCP-1 蛋白表達(dá)水平與TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)（Plt;0. 05）。見圖1 和表1。

2. 2 各組肺癌 A549 細(xì)胞中 MCP-1 蛋白表達(dá)水平

MCP-1-siRNA 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示： 與空白組比較， si-NC 組A549 細(xì)胞中MCP-1 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。與si-NC 組比較，MCP-1-siRNA-1 組和MCP-1-siRNA-2 組A549 細(xì)胞中MCP-1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 01）。MCP-1 過表達(dá)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示： 與對(duì)照組和OE-NC 組比較，OE-MCP-1 組A549 細(xì)胞中MCP-1蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01）。見圖2 和3。

2. 3 各 組 肺 癌 A549 細(xì) 胞 遷 移 率

與 si-NC 組（23. 33%±0. 78%） 比較， MCP-1-siRNA-1 組和MCP-1-siRNA-2 組細(xì)胞遷移率（11. 50%±0. 69% 和10. 51%±1. 19%） 均明顯降低（Plt;0. 01）。見圖4。與OE-NC組（8. 55%±0. 13%） 比較，OE-MCP-1組細(xì)胞遷移率（24. 45%±2. 62%） 明顯升高（Plt;0. 01）； 與 OE-MCP-1 組比較， OE-MCP-1+PD98059 組細(xì)胞遷移率（15. 87%±0. 71%） 明顯降低（Plt;0. 01）； 與 OE-MCP-1+PD98059 組比較，PD98059 組細(xì)胞遷移率（4. 88%±0. 09%） 明顯降低（Plt;0. 01）。見圖5。

2. 4 各組肺癌A549細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)

與si-NC組（274. 30 個(gè)±12. 01 個(gè)） 比較， MCP-1-siRNA-1 組和MCP-1-siRNA-2 組侵襲細(xì)胞數(shù)［ （90. 67 個(gè)±9. 29 個(gè)） 和（87. 67 個(gè)±3. 06 個(gè)）］ 明顯減少（Plt;0. 01）；與OE-NC 組（132. 30 個(gè)±6. 51 個(gè)） 比較，OE-MCP-1 組侵襲細(xì)胞數(shù)（295. 30 個(gè)±13. 80 個(gè)）明 顯 增 加（Plt;0. 01）； 與 OE-MCP-1 組 比 較，OE-MCP-1+PD98059 組侵襲細(xì)胞數(shù)（181. 70 個(gè)±11. 68 個(gè)） 明顯減少（Plt;0. 01）；與OE-MCP-1+PD98059組比較，PD98059組侵襲細(xì)胞數(shù)（66. 67個(gè)±6. 81 個(gè)） 明顯減少（Plt;0. 01）。見圖6。

2. 5 各組肺癌A549細(xì)胞中p-ERK、t-ERK和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平

與 si-NC 組比較，MCP-1-siRNA-1 組和MCP-1-siRNA-2 組A549 細(xì)胞中p-ERK、Vimentin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）， E-cadherin 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01）。見圖7。與OE-NC 組比 較， OE-MCP-1 組 A549 細(xì) 胞 中 p-ERK、Vimentin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01）， E-cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）。與 OE-MCP-1 組比較，OE-MCP-1+PD98059 組 A549 細(xì) 胞 中 p-ERK、Vimentin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 01），E-cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05）。與 OE-MCP-1+PD98059 組 比 較， PD98059 組A549 細(xì)胞中p-ERK 、Vimentin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），E-cadherin 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01）。各組A549 細(xì)胞中t-ERK 蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見圖8。

3 討 論

肺癌是全球重大的健康問題，也是癌癥導(dǎo)致死亡的重要原因。近年來肺癌的診斷和治療方面取得了一定進(jìn)展，但隨著腫瘤耐藥和轉(zhuǎn)移的發(fā)生，肺癌患者的預(yù)后仍然較差，需要尋找肺癌治療的有效靶點(diǎn)。研究［6-8］ 證實(shí)：MCP-1 在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)， 通過影響腫瘤微環(huán)境、促進(jìn)血管生成和誘導(dǎo)EMT 等過程促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，發(fā)揮促癌作用。血清MCP-1 水平可作為預(yù)測(cè)胰腺癌患者預(yù)后的潛在標(biāo)志物， 高表達(dá)MCP-1 是淋巴瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素［9-10］。此外，MCP-1 還可預(yù)測(cè)乳腺癌的早期復(fù)發(fā)［11］。本研究結(jié)果顯示： MCP-1 蛋白在NSCLC 組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常肺組織， 并與 TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)， 提示MCP-1 可能促進(jìn) NSCLC 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移， 與LI 等［12］ 的研究結(jié)果一致。

EMT 是由上皮細(xì)胞來源惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程。EMT 發(fā)生過程中， 當(dāng)E-cadherin 轉(zhuǎn)化為N-cadherin 時(shí)， 可促進(jìn)細(xì)胞增殖，細(xì)胞生長(zhǎng)失去控制，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，在腫瘤的進(jìn)展過程中具有重要作用。N-cadherin 異常表達(dá)常賦予腫瘤細(xì)胞由原發(fā)腫瘤范圍內(nèi)逃逸并轉(zhuǎn)移至繼發(fā)部位的能力，使其獲得侵襲性的腫瘤表型，是EMT 的標(biāo)志。Vimentin 是典型的間充質(zhì)分子標(biāo)志物，對(duì)患者的治療及預(yù)后評(píng)估具有重要的指導(dǎo)意義［13-14］。DONG 等［15］ 證 實(shí)：MCP-1 蛋白可通過磷脂酰肌醇3- 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K） /AKT 信號(hào)通路促進(jìn)舌癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，MCP-1 蛋白可通過上調(diào)Snail 誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)細(xì)胞遷移［16］。 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通過 MCP-1/AKT/β-catenin 信號(hào)通路傳導(dǎo)，促進(jìn)三陰性乳腺癌的EMT 和癌癥干細(xì)胞特性［17］。

本研究結(jié)果顯示：沉默肺癌A549 細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)后，A549 細(xì)胞遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少， EMT 相關(guān)蛋白Vimentin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)水平降低， E-cadherin 蛋白表達(dá)水平升高。過表達(dá)MCP-1 蛋白可明顯促進(jìn)A549 細(xì)胞遷移和侵襲，提示 MCP-1 蛋白可明顯提高A549 細(xì)胞遷移和侵襲的能力，促進(jìn)EMT 發(fā)生。

MCP-1 蛋白可以激活多種信號(hào)通路， 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［18］。ERK 信號(hào)通路是腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用。研究［19］ 顯示： 高表達(dá)早期生長(zhǎng)應(yīng)答因子1 （early growth response 1，EGR1） 的胃癌SGC7901R 細(xì)胞可激活MCP-1 蛋白并促進(jìn)EMT，MCP-1 蛋白也可激活ERK 通路， 促進(jìn) EGR 活性，進(jìn)而形成 EGR1-MCP-1 反饋環(huán)路， 促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT 和血管生成。此外，MCP-1 蛋白還可通過ERK 信號(hào)通路促進(jìn)輻射誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，在輻射引起的肺毒性作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用［20］。然而， 在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中，MCP-1 蛋白與ERK 信號(hào)通路之間的關(guān)系尚未完全闡明。本研究結(jié)果顯示：沉默肺癌A549 細(xì)胞MCP-1 蛋白表達(dá)可抑制p-ERK 蛋白表達(dá)， 并抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力；過表達(dá)MCP-1 蛋白可促進(jìn)p-ERK 蛋白表達(dá)水平升高并促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲；PD98059 可顯著抑制過表達(dá)MCP-1 蛋白對(duì)肺癌A549 細(xì)胞遷移和侵襲的促進(jìn)作用，同時(shí)下調(diào) p-ERK 蛋白表達(dá)。以上結(jié)果均提示：MCP-1 蛋白可上調(diào)肺癌A549 細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)， 促進(jìn)肺癌A549 細(xì)胞的遷移和侵襲， 其可能的作用機(jī)制與 MCP-1 蛋白激活ERK 信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，MCP-1 蛋白通過激活ERK 信號(hào)通路， 調(diào)控EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)， 促進(jìn)肺癌A549 細(xì)胞的遷移和侵襲，本研究結(jié)果為肺癌治療提供了新的方向和靶點(diǎn)。 MCP-1 蛋白在腫瘤細(xì)胞遷移、 定植、 增殖和侵襲中發(fā)揮重要作用， 靶向 MCP-1 蛋白及其受體的拮抗劑有望成為新開發(fā)型抗腫瘤藥物的靶向目標(biāo)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王遠(yuǎn)參與實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)收集和論文撰寫， 王志娟、張明姝、王藝慧和張晴參與實(shí)驗(yàn)操作及數(shù)據(jù)收集，葉麗平參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析及論文審校。

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