SGK1 對Cyclin B/Cdc2 通路介導(dǎo)小鼠G1期受精卵卵裂的調(diào)控作用及其機制

［摘 要］ 目的：探討血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶1（SGK1） 在小鼠細胞周期G1期受精卵早期發(fā)育過程中的調(diào)控作用，并闡明相關(guān)機制。方法：取若干只 4～6周齡且體質(zhì)量約為 20 g的雌鼠和若干只8 周齡以上且體質(zhì)量約為30 g 的雄鼠，雌鼠腹腔注射孕馬血清促性腺激素（PMSG），每只10 IU，48 h 后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素（HCG），每只10 IU，并將注射HCG 的雌鼠與雄鼠1∶ 1 合籠過夜。取交配成功的雌鼠受精卵，注射HCG 后分別于12～21 h、21～26 h、26～28 h 和28～30 h 收集細胞周期G1 期、S 期、G2 期及M 期的受精卵，并于光學(xué)顯微鏡下觀察不同細胞周期的細胞形態(tài)表現(xiàn)。收集小鼠超排卵后 G1 期受精卵，體外轉(zhuǎn)錄生成 mRNA 后，分為未注射組、Tris-EDTA 緩沖液注射組（TE 注射組） 和SGK1-mRNA 注射組。采用SGK1 抗體與KSOM 培養(yǎng)液配置1∶ 25、1∶ 50、1∶ 100、1∶ 200 和0 共5 種不同濃度SGK1 抗體組的培養(yǎng)液，培養(yǎng)小鼠G1期受精卵。Western blotting 法檢測各組小鼠受精卵中SGK1 蛋白表達水平和各組小鼠及不同濃度SGK1 抗體組HCG 注射不同時間受精卵中磷酸化細胞分裂周期因子2 （Cdc2） 酪氨酸15 位點（Cdc2-pTyr15） 去磷酸化情況，相差顯微鏡觀察各組小鼠和不同濃度SGK1 抗體組受精卵發(fā)育情況，Western blotting 法檢測HCG 注射不同時間小鼠受精卵中磷酸化SGK1-蘇氨酸256位點（SGK1-pThr256）和Cdc2-pTyr15蛋白表達水平。結(jié)果：與未注射組和TE注射組比較，SGK1-mRNA 注射組SGK1蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 01）。HCG 注射后27～28 h，SGK1-mRNA 注射組小鼠受精卵中Cdc2-pTyr15 磷酸化信號逐漸消失，至HCG 注射29 h，Cdc2-pTyr15磷酸化信號完全消失；HCG 注射后28～29 h，未注射組和TE 注射組小鼠受精卵中Cdc2-pTyr15 磷酸化信號逐漸消失， 至HCG 注射后30 h， Cdc2-pTyr15 磷酸化信號完全消失； 隨著SGK1 抗體濃度升高，不同濃度SGK1 抗體組受精卵中Cdc2-pTyr15 磷酸化信號減弱和磷酸化信號消失的時間逐漸延長。HCG 注射后27 h，SGK1-mRNA 注射組小鼠受精卵開始卵裂；HCG 注射后31 h，SGK1-mRNA 注射組受精卵幾乎全部分裂為G2 期細胞受精卵；HCG 注射后33 h，0 和 1∶ 200 SGK1 抗體組受精卵全部發(fā)生卵裂；隨著 SGK1 抗體濃度升高， 1∶ 25、1∶ 50 和1∶ 100 SGK1 抗體組受精卵卵裂逐漸減少，在1∶ 25 SGK1 抗體組受精卵卵裂減少最明顯。HCG 注射后31 h， 與未注射組和TE 注射組比較，SGK1-mRNA 注射組小鼠受精卵死亡率明顯降低（Plt;0. 05）， 卵裂率明顯升高（Plt;0. 05）。注射HCG 后31 和33 h，隨著SGK1 抗體濃度升高，與1∶ 200 SGK1 抗體組比較，1∶ 100、1∶ 50 和1∶ 25SGK1 抗體組受精卵死亡率逐漸升高（Plt;0. 05）， 卵裂時間延長， 受精卵卵裂率降低（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性， 其中1∶ 25 SGK1 抗體組受精卵卵裂率最低。HCG 注射后27 h， 小鼠受精卵中SGK1-pThr256 蛋白表達水平逐漸升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），并呈時間依賴性；HCG 注射后28～29 h，小鼠受精卵中Cdc2-pTyr15 蛋白表達水平逐漸降低（Plt;0. 01），并呈時間依賴性，并于HCG 注射后30 h完全消失。結(jié)論：過表達或抑制SGK1均會影響小鼠G1期受精卵進入M期的時間，SGK1蛋白可能是小鼠G1期受精卵早期發(fā)育的調(diào)控因子之一，其可能通過Cdc2 調(diào)節(jié)G1期受精卵發(fā)育。

［關(guān)鍵詞］ 血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶1； 受精卵； 細胞分裂； 磷脂酰肌醇3-激酶； 卵裂

［中圖分類號］ Q132 ［文獻標志碼］ A

血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶（serum andglucocorticoid-induced protein kinase， SGK） 是一種絲氨酸/蘇氨酸雙重特異性蛋白激酶，主要包括SGK1、SGK2 和SGK3 基因編碼的蛋白激酶［1］。SGK1 作為SGK 家族的重要成員之一，在腫瘤的發(fā)生、心肌纖維化、慢性疾病、離子轉(zhuǎn)運和自噬的發(fā)生中起重要作用［2-6］。研究［7］ 表明：SGK 的酶活性由磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K） 信號級聯(lián)控制， 參與調(diào)控細胞減數(shù)分裂。SGK1 可在PI3K 信號通路下游被激活， 從而磷酸化細胞分裂周期因子25 （cell division cyclin 25，Cdc25）。Cdc25 可使處于磷酸化狀態(tài)的細胞分裂周期因子2 （cell division cyclin 2， Cdc2） -酪氨酸15位點（tyrosine 15 site，Tyr15） 發(fā)生脫磷酸化，產(chǎn)生有活性的細胞周期蛋白B （Cyclin B） /Cdc2 復(fù)合物， 調(diào)控細胞快速完成細胞G2 期向M 期轉(zhuǎn)換，進而完成細胞分裂［8-11］。研究［12］ 顯示：SGK1 對哺乳動物卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)具有重要意義，磷酸化SGK1- 蘇氨酸256 位點（phosphorylated SGK1-threonine 256 site， SGK1-pThr256） 可通過磷酸化Cdc25B 和促進磷酸化Cdc2-Tyr15 （phosphorylatedCdc2-Tyr15，Cdc2-pTyr15） 去磷酸化，激活Cyclin B/Cdc2 復(fù)合物，誘導(dǎo)小鼠卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)，但SGK1 和Cdc25B 在卵母細胞中具體作用機制尚未完全闡明。目前，SGK1 對生殖細胞發(fā)育的作用研究多局限于卵母細胞減數(shù)分裂，其在哺乳動物受精卵早期發(fā)育過程中的作用機制和通過調(diào)控Cdc2 對受精卵卵裂發(fā)揮作用進而調(diào)控細胞周期的研究較少。本研究分析小鼠受精卵早期發(fā)育過程中SGK1-pThr256 和Cdc2-pTyr15 磷酸化狀態(tài)， 探討SGK1對小鼠受精卵卵裂和早期發(fā)育過程中的作用，并闡明其相關(guān)作用機制，為SGK1 在小鼠受精卵的G2/M轉(zhuǎn)化作用研究提供參考。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物、藥物、主要試劑和儀器

120 只SPF 級昆明系小鼠， 實驗動物使用許可證號：SYXK （蒙） 2020-0003； 雌鼠， 4～6 周齡， 體質(zhì)量約為20 g；雄鼠，8 周齡以上，體質(zhì)量約為30 g，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）（獸藥字110914564，寧波三生生物科技有限公司）， 人絨毛膜促性腺激素（human chorionicgonadotropin， HCG）（獸藥字101631282， 蘇州素仕公司）。透明質(zhì)酸酶和M16 培養(yǎng)液（美國Sigma公司）， 二丁酰環(huán)磷腺苷試劑（dibutyryl-cAMP，dbcAMP）（上海麥克林試劑公司）， KSOM 培養(yǎng)液、M1430 和礦物油M2460 （南京愛貝生物科技有限公司），SDS-PAGE 凝膠快速配制試劑盒、預(yù)染蛋白Marker、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS）（上海碧云天公司），0. 45 μm NC 膜［愛西默科技（上海） 有限公司］， ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國Piece Biotechnology 公司）、蛋白印跡膜再生液（北京康為世紀生物科技有限公司）， SGK1 抗體和Cdc2 抗體（美國ProteinTech 公司）， β-actin 抗體（美國Santa Cruzbio 公司） 和微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒［生工生物工程（上海） 股份有限公司］。相差顯微鏡（型號：CKX53，日本Olympus公司），基因擴增儀（型號：Hema9600，珠海黑馬儀器有限公司），電泳儀（型號：JY600E，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

1. 2 小鼠受精卵采集和培養(yǎng)

將若干只4～6周約為20 g 的成熟雌鼠和若干只體質(zhì)量約為30 g 的成熟雄鼠分籠飼養(yǎng)。開始實驗第1 天上午對雌鼠腹腔注射PMSG，每只10 IU，48 h 后腹腔注射HCG，每只10 IU， 并將注射HCG 的雌鼠與雄鼠1∶ 1 合籠過夜。21 h 后檢查雌鼠陰栓，使用頸椎脫臼法處死交配成功的雌鼠。剪開小鼠腹部，將輸卵管取出并用生理鹽水清洗。于體視顯微鏡下使用無菌注射器劃開輸卵管壺腹部， 使用100 μL 移液槍將自然流出的受精卵細胞團轉(zhuǎn)移至0. 3% 透明質(zhì)酸酶溶液中，反復(fù)吹洗去除卵丘細胞后移入M16 培養(yǎng)液中，反復(fù)清洗3～5 次， 再移至提前預(yù)熱并覆蓋好石蠟油的KSOM 培養(yǎng)液液滴中， 每55 μL KSOM 液滴放置10 顆受精卵。將受精卵置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)注射HCG 的時間和受精卵細胞形態(tài)表現(xiàn)分別收集細胞周期G1、S、G2和M 期的受精卵，用于后續(xù)實驗。注射HCG 后分別于12～21 h、21～26 h、26～28 h 和28～30 h 收集細胞周期G1、S、G2和M 期的受精卵，并于光學(xué)顯微鏡下觀察不同細胞周期細胞的形態(tài)表現(xiàn)。G1期受精卵雌雄原核開始形成；S 期受精卵雌雄原核體積增大，形成可見核仁，是顯微注射的最佳時期；G2期雌雄原核核膜破裂、核仁消失，細胞骨架重組為卵裂做準備；M 期細胞體拉長。

1. 3 體外轉(zhuǎn)錄生成受精卵 mRNA

制備線性化DNA： 配制50 μL 酶切反應(yīng)體系， 10×QuickCutBuffer 5 μL， 質(zhì)粒5 μL， QuickCutApa Ⅰ 1 μL，ddH2O 39 μL； 充分吹吸混勻后離心； 37 ℃ 酶切30 min； 室溫靜置5 min 后加入20 g·L－1 Protein K0. 5 μL； 加入10% SDS 2. 5 μL， 50 ℃ ， 30 min；加入混勻的等體積酚∶氯仿（25∶24） 進行抽提，12 000 r·min－1 離心2 min， 吸取上層溶液于EP 管中； 加入1/10 體積的3 mol·L－1 醋酸鈉和3 倍體積的無水乙醇沉淀， 混合后于－20 ℃ 溫度下放置15 min； 12 000 r·min－1 離心10 min， 棄去上清液。4 ℃ 、12 000 r·min－1 低溫離心15 min； 最后加入RNase Free H2O 20 μL 重懸DNA 沉淀， 獲得的線性DNA 可作為模板，用于體外轉(zhuǎn)錄生成mRNA。

DNA 模板體外轉(zhuǎn)錄生成mRNA： 配制20 μL體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系， 線性化DNA template 6 μL，T7 Enzyme Mix 2 μL， T7 Reaction Buffer （5×）4 μL，RNase Free H2O 20 μL；充分吹吸混勻后離心；置于PCR 儀中37 ℃孵育2 h；將反應(yīng)結(jié)束后的體系置于冰上， 防止mRNA 降解； 去除DNA 模板， 加入1 μL DNase， 充分吹吸混勻后離心， 于PCR 儀中37 ℃孵育30 min；加Poly （A） 尾；最后配制100 μL 反應(yīng)體系，Mixture 20 μL，RNase FreeH2O 36 μL，5×E-PAP 緩沖液20 μL，25 mmol·L－1二氯化錳（Manganese chloride， MnCl2） 10 μL，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate， ATP） 溶液10 μL，E-PAP 酶4 μL；37 ℃，40 min，置于冰上；配制100 μL RNA 產(chǎn)物純化體系，去除模板后的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物21 μL， RNase Free H2O 67 μL， PurificationAssistant A 10 μL， Purification Assistant B 2 μL；充分混合后加入預(yù)冷的無水乙醇 300 μL， 置于－20 ℃冰箱中沉淀。沉淀后， 采用低溫冷凍離心機4 ℃、13 000 r·min－1 離心30 min，離心后可觀察到明顯的RNA 沉淀。使用乙醇清洗2 次后再用低溫冷凍離心機4 ℃ 、13 000 r·min－1 離心10 min。將RNA 沉淀至透明，采用Nanodrop 2000 超微量分光光度計檢測生成mRNA 的純度，并測定吸光度（A） 值，A （260） /A （280） 比值為1. 8～2. 0 時，表明mRNA 純度相對較高，可用于后續(xù)實驗。

1. 4 實驗分組和處理

設(shè)計SGK1-mRNA注射組和對照組，每組各500 顆受精卵。對照組分為未注射組和Tris-EDTA 緩沖液注射組（TE 注射組）。SGK1-mRNA 注射組將10 pL SGK1-mRNA 注入處于S 期的受精卵細胞質(zhì)中，并將注射后的受精卵移至含200 μmol·L－1 dbcAMP 的M16 培養(yǎng)液中， 于37 ℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。TE 注射組將10 pLTris-EDTA 緩沖液注入S 期的受精卵細胞質(zhì)中，并將注射后的受精卵移至上述相同條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，未進行注射的受精卵以相同條件培養(yǎng)，以備后用。采用SGK1 抗體與KSOM 培養(yǎng)液配置1∶25、1∶50、1∶100、1∶200 和0 共5 種不同濃度SGK1 抗體組培養(yǎng)液， 培養(yǎng)小鼠G1 期受精卵， 每個濃度組各100 顆受精卵。

1. 5 Western blotting 法檢測各組小鼠受精卵中SGK1 蛋白表達水平

取顯微注射 4 h 后 SGK1-mRNA 注射組和對照組受精卵各180 顆，置于EP 管中，加入PBS 緩沖液漂洗細胞，4 ℃、3 000 r·min－1離心10 min， 棄去上清液后按1∶1∶100 比例加入30 μL 磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和RIPA 裂解混合物， 按4∶1 比例加入7. 5 μL 5×SDS-PAGELoading Buffer，離心后取30 μL 上清加入至凝膠點樣孔中進行PAGE 凝膠電泳， 然后進行轉(zhuǎn)膜， 將NC 膜取出，充分清洗后置于5% 脫脂奶粉中室溫封閉1 h，加入對應(yīng)稀釋過的一抗，SGK1 （1∶500）和β-actin （1∶1 000），4 ℃過夜。取出NC 膜，1×TBST 溶液清洗后加入稀釋過的二抗，室溫振搖孵育2 h，將NC 膜充分清洗后，避光ECL 顯色，曝光分析， 采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 蛋白條帶灰度值。

1. 6 Western blotting法檢測各組小鼠和不同濃度SGK1 抗體組 HCG 注射不同時間受精卵中 Cdc2-pTyr15去磷酸化情況

取各組小鼠顯微注射及HCG注射后27、28、29、30、31 和32 h 的受精卵，每組180 顆，放入 1. 5 mL EP 管中，4 ℃、3 000 r·min－1離心10 min 后，棄去上清后加入30 μL 磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和RIPA 裂解混合物，加入7. 5 μL5×SDS-PAGE Loading Buffer。100 ℃沸水煮5 min，冰水混合物中冰浴1 min， 4 ℃、10 000 r·min－1 離心1 min 備用。同時取不同濃度SGK1 抗體組受精卵于相同條件下培養(yǎng)和處理，采用Western blotting法檢測各組小鼠和不同濃度SGK1 抗體組HCG 注射不同時間受精卵中Cdc2-pTyr15 去磷酸化情況。

1. 7 相差顯微鏡觀察各組小鼠和不同濃度 SGK1抗體組受精卵發(fā)育情況

將各組小鼠顯微注射后的受精卵放入含400 μmol·L－1 dbcAMP 的KSOM 培養(yǎng)液中， 37 ℃ 、5% CO2 培養(yǎng)4 h。充分清洗dbcAMP 后， 繼續(xù)培養(yǎng)至HCG 注射后27 h。不同濃度SGK1 抗體組培養(yǎng)至注射HCG 后27～33 h。顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)表現(xiàn)和受精卵發(fā)育情況，包括開始卵裂時間、受精卵卵裂率和受精卵死亡率。受精卵卵裂率=受精卵卵裂個數(shù)/受精卵總個數(shù)×100%；受精卵死亡率=注射HCG 27 h 后受精卵死亡個數(shù)/受精卵總個數(shù)×100%。

1. 8 Western blotting 法檢測 HCG 注射不同時間小鼠受精卵中SGK1-pThr256和Cdc2-pTyr15蛋白表達水平

取HCG注射后27、28、29、30和31 h并培養(yǎng)于KSOM 培養(yǎng)液中的小鼠受精卵各180 顆于EP 管中，離心去上清，加入30 μL 磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和RIPA 裂解混合物， 加入7. 5 μL5×SDS-PAGE Loading Buffer。100 ℃沸水煮5 min，冰水混合物中冰浴1 min， 4 ℃、10 000 r·min－1 離心1 min 備用。采用Western blotting 法檢測HCG注射不同時間小鼠受精卵中SGK1-pThr256 和Cdc2-pTyr15 蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 蛋白條帶灰度值。

1. 9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 23. 0 和 GraphPadPrism 9 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。小鼠受精卵中SGK1 蛋白表達水平符合正態(tài)分布且方差齊， 以-x±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析， 組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q 檢驗； 各組小鼠受精卵和不同濃度SGK1 抗體組受精卵卵裂率和死亡率以百分率表示，多組間百分率比較采用χ2 檢驗或Fisher 確切概率法。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 各組小鼠受精卵中 SGK1蛋白表達水平

與未注射組比較，TE 注射組小鼠受精卵中SGK1 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0. 05）。與未注射組和TE 注射組比較，SGK1-mRNA 注射組小鼠受精卵中SGK1 蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 01）。見圖1。

2. 2 各組小鼠和不同濃度SGK1抗體組HCG注射不同時間受 精 卵 中 Cdc2-pTyr15 去磷酸化情況

HCG 注射后27～28 h， SGK1-mRNA 注射組小鼠受精卵中Cdc2-pTyr15 磷酸化信號逐漸消失，至HCG 注射后29 h Cdc2-pTyr15 磷酸化信號完全消失。HCG 注射后28～29 h，未注射組和TE 注射組小鼠受精卵中Cdc2-pTyr15 磷酸化信號逐漸消失，至HCG 注射后30 h，Cdc2-pTyr15 磷酸化信號完全消失。見圖2。隨著SGK1 抗體濃度升高，不同濃度SGK1 抗體組受精卵中Cdc2-pTyr15 磷酸化信號減弱和磷酸化信號消失的時間逐漸延長。見圖3 和表1。

2. 3 各組小鼠和不同濃度 SGK1抗體組受精卵形態(tài)表現(xiàn)

HCG 注射后 27 h，SGK1-mRNA 注射組小鼠受精卵開始卵裂，未注射組和TE 注射組小鼠未見受精卵卵裂；HCG 注射后31 h，SGK1-mRNA注射組小鼠受精卵幾乎全部分裂為G2 期細胞受精卵，未注射組和TE 注射組小鼠受精卵未分裂為G2期細胞受精卵。見圖4 。HCG 注射后 33 h ， 0 和1∶ 200 SGK1 抗體組受精卵全部發(fā)生卵裂； 隨著SGK1 抗體濃度升高， 1∶ 100、 1∶ 50 和 1∶ 25SGK1 抗體組受精卵卵裂減少，在 1∶25 SGK1 抗體時受精卵卵裂減少最明顯。見圖5。

2. 4 各組小鼠和不同濃度SGK1抗體組受精卵死亡率和卵裂率

HCG 注射后 31 h，與未注射組和TE 注射組比較，SGK1-mRNA注射組小鼠受精卵死亡率明顯降低（Plt;0. 05），卵裂率明顯升高（Plt;0. 05）。HCG注射后33 h，與未注射組和TE 注射組比較，各組小鼠受精卵卵裂率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見表2。注射HCG后31和33 h，隨著SGK1抗體濃度升高，與1∶200 SGK1 抗體組比較，1∶100、1∶50 和1∶25 SGK1 抗體組受精卵死亡率逐漸升高（Plt;0. 05），卵裂時間延長，受精卵死亡率和卵裂率降低（Plt;0. 05）， 并呈劑量依賴性， 其中1∶ 25SGK1 抗體組受精卵卵裂率最低； 與0 SGK1 抗體組比較，1∶200 SGK1 抗體組受精卵死亡率和卵裂率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見表3。

2. 5 HCG 注射不同時間小鼠受精卵中 SGK1-pThr256 和 Cdc2-pTyr15 蛋白表達水平

HCG 注射后27 h，小鼠受精卵中SGK1-pThr256 蛋白表達水平逐漸升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），并呈時間依賴性；與HCG 注射后29 h 比較，HCG 注射后30 h小鼠受精卵中SGK1-pThr256 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0. 05）。與HCG 注射后27 h 比較，HCG 注射后28 h 小鼠受精卵中Cdc2-pTyr15 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0. 05）；HCG 注射后28～29 h，小鼠受精卵中Cdc2-pTyr15 蛋白表達水平逐漸降低（Plt;0. 01）， 并呈時間依賴性，并于HCG 注射后30 h 完全消失。見圖6 和7。

3 討 論

SGK1 由WEBSTER 等［13］ 在大鼠乳腺腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)，是一種可快速活化的早期蛋白激酶。當細胞處于血清和（或） 糖皮質(zhì)激素中時， SGK1-mRNA 表達水平在30 min 內(nèi)迅速升高， 因此也稱血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶［14］。SGK1 在哺乳動物的所有組織中均有不同程度的表達［15］。與其他類型蛋白激酶比較，SGK1 轉(zhuǎn)錄和酶活性及亞細胞定位受嚴格的刺激依賴調(diào)節(jié)［16-17］。SGK1 的亞細胞定位可參與調(diào)節(jié)體細胞的細胞周期，SGK1 在細胞核和細胞質(zhì)之間動態(tài)穿梭是保證細胞周期有序進行的條件之一［18］。研究［12］ 顯示：在3 種哺乳動物血清糖皮質(zhì)激素激酶蛋白中，小鼠卵母細胞僅表達SGK1， 抑制卵母細胞中SGK1 蛋白活性會導(dǎo)致Cdc2 通過Cdc5B 的激活減少， 從而延遲或抑制核包膜破裂。SGK1 在減數(shù)分裂進程中可通過SGK1-pThr256/Cdc25B/CyclinB-Cdc2 通路參與卵母細胞紡錘體的合成及核膜破裂，促進小鼠卵母細胞由生發(fā)泡（germinal vesicle， GV） 期向生發(fā)泡破裂（germinal vesicle breakdown， GVBD） 期轉(zhuǎn)化［19］。但SGK1 在哺乳動物受精卵發(fā)育過程中的功能尚不明確， 能否通過CyclinB/Cdc2 通路參與受精卵卵裂從而控制細胞周期過程尚未完全闡明。

過表達SGK1 可以縮短小鼠受精卵完成卵裂的時間， 促使受精卵提前發(fā)生卵裂。本研究結(jié)果顯示： 未注射組和TE 注射組小鼠受精卵及1∶ 200SGK1 抗體組、1∶100 SGK1 抗體組和1∶50 SGK1抗體組受精卵中Cdc2-pTyr15 磷酸化信號分別在HCG 注射后30、31 及32 h 時完全消失； 而1∶ 25SGK1 抗體組受精卵中Cdc2-pTyr15 磷酸化信號在HCG 注射后33 h 仍可檢測到， 表明SGK1 抗體濃度與小鼠受精卵卵裂有關(guān)，隨著SGK1 抗體濃度升高，小鼠受精卵卵裂時間逐漸增加，受精卵卵裂率逐漸降低。提示SGK1 是小鼠受精卵早期發(fā)育的正性調(diào)控因子。本研究結(jié)果顯示： 小鼠受精卵中，SGK1-pThr256 的積累與細胞周期進程同步，表明SGK1-Thr256 的磷酸化可以促進小鼠受精卵早期發(fā)育， 并且在小鼠受精卵細胞周期進程中SGK1-Thr256 磷酸化較Cdc2-pTyr15 去磷酸化出現(xiàn)更早，提示在哺乳動物受精卵發(fā)育的過程中SGK1 可能是Cdc2 的上游基因調(diào)控因子，與相關(guān)研究［20］ 結(jié)果一致。SGK1 可通過調(diào)節(jié)CyclinB/Cdc2 復(fù)合物表達，誘導(dǎo)體細胞完成G2/M 細胞周期過渡，促進體細胞發(fā)育，從而調(diào)節(jié)細胞周期的進程。

綜上所述，過表達或抑制SGK1 均會影響小鼠G1期受精卵進入M 期的時間，SGK1 蛋白可能是小鼠G1 期受精卵早期發(fā)育的調(diào)控因子之一， 其可能通過Cdc2 調(diào)節(jié)G1期受精卵發(fā)育。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：張慧靈參與研究實施、數(shù)據(jù)采集和論文撰寫，韓迪參與研究過程、數(shù)據(jù)采集和整理，郭文秀參與文獻整理和分析，龐海垚參與論文修改和實驗設(shè)計，孟峻參與論文修訂和審校。

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