C57BL/6 小鼠大腦皮層區(qū)與基底神經(jīng)節(jié)隆起區(qū)神經(jīng)元突觸發(fā)育過程比較

［摘 要］ 目的：觀察小鼠皮層區(qū)和基底神經(jīng)節(jié)隆起 （GE） 區(qū)神經(jīng)元突觸發(fā)育過程，闡明興奮性突觸和抑制性突觸在不同腦區(qū)的體內(nèi)外發(fā)育差異。方法：C57BL/6雌鼠于妊娠第13. 5～15. 5天斷頸處死后，經(jīng)無菌操作取胚胎小鼠，顯微鏡下逐步分離獲取胚胎小鼠腦組織皮層區(qū)和GE 區(qū)。體外原代培養(yǎng)胚胎小鼠神經(jīng)元，于培養(yǎng)3、7、14 和21 d 分別收集細(xì)胞樣品，并將其作為培養(yǎng)3、7、14 和21 d 組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測(cè)各組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中突觸后表達(dá)蛋白突觸后密度蛋白95 （PSD95） 及橋尾蛋白（Gephyrin） mRNA 表達(dá)水平。免疫熒光法檢測(cè)各組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 （vGLUT1）、PSD95、囊泡γ-氨基丁酸（GABA） 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（vGAT） 及Gephyrin 蛋白表達(dá)水平。免疫熒光法檢測(cè)胚胎小鼠腦組織皮層區(qū)和GE區(qū)神經(jīng)元中vGLUT1及vGAT蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與培養(yǎng)3 d組比較，培養(yǎng)14和21 d組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中PSD95 及Gephyrin mRNA 表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01）；與皮層區(qū)比較，培養(yǎng)14 d 組小鼠GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中Gephyrin mRNA 表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）。顯微鏡下觀察，培養(yǎng)14 d 組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中興奮性突觸及抑制性突觸均初步發(fā)育，相關(guān)蛋白呈陽性表達(dá)；其中興奮性突觸相關(guān)蛋白陽性表達(dá)在皮層區(qū)神經(jīng)元中更為明顯，且突觸前分子vGLUT1 和突觸后分子PSD95 在皮層區(qū)神經(jīng)元的胞體及突起部位均呈現(xiàn)共定位的特征；抑制性突觸前分子vGAT 蛋白和突觸后分子Gephyrin 蛋白在GE 區(qū)神經(jīng)元胞體及突起中也呈現(xiàn)共定位的特征，且突觸前分子較相應(yīng)的突觸后分子蛋白陽性表達(dá)更明顯。與皮層區(qū)比較，培養(yǎng)14 d 組小鼠GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中vGLUT1 和PSD95 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01），vGAT 和Gephyrin 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01）。培養(yǎng)21 d 組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白陽性表達(dá)增加，興奮性突觸和抑制性突觸進(jìn)一步成熟并完善。皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元的胞體及突起部位均形成了豐富的突觸前后對(duì)應(yīng)的表達(dá)模式，突觸結(jié)構(gòu)逐步發(fā)育良好，且突觸前分子較相應(yīng)的突觸后分子蛋白陽性表達(dá)更明顯。與皮層區(qū)比較，培養(yǎng)21 d 組小鼠GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中vGLUT1 和PSD95 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 01），vGAT 和Gephyrin 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 01）。與皮層區(qū)比較，胚胎小鼠腦組織GE 區(qū)神經(jīng)元中vGLUT1 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01），vGAT 蛋白表達(dá)水平明顯升高 （Plt;0. 05）。結(jié)論：皮層區(qū)和GE區(qū)神經(jīng)元的突觸發(fā)育具有明顯的差異性，皮層區(qū)興奮性突觸發(fā)育較早，GE 區(qū)抑制性突觸發(fā)育較早。突觸的腦區(qū)特異性發(fā)育提示不同細(xì)胞類型的神經(jīng)疾病可能具有不同的發(fā)育來源。

［關(guān)鍵詞］ 神經(jīng)元發(fā)育； 興奮性突觸； 抑制性突觸； 皮層區(qū)； 基底神經(jīng)節(jié)隆起區(qū)

［中圖分類號(hào)］ R394 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

突觸是神經(jīng)系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)，神經(jīng)元之間及神經(jīng)元與效應(yīng)細(xì)胞之間形成突觸連接是傳遞電化學(xué)信號(hào)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。因此，突觸發(fā)育是神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵步驟。突觸結(jié)構(gòu)包括興奮性突觸和抑制性突觸，分別由各自特異的突觸前后蛋白組成。興奮性突觸通常會(huì)形成樹突棘樣結(jié)構(gòu)，突觸前膜和突觸后膜均聚集大量特異性蛋白， 電鏡下觀察可見突觸后致密體。興奮性突觸可使用的標(biāo)志物包括興奮性突觸前特異性分子囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 （vesicularglutamate transporter 1， vGLUT1） 和興奮性突觸后特異性分子突觸后密度蛋白95 （postsynapticdensity 95，PSD95），可分別對(duì)突觸前成分和突觸后成分進(jìn)行染色并觀察［1-4］。抑制性突觸由獨(dú)特的蛋白聚集于突觸前膜和后膜形成，其中具有特征性且常用于染色觀察的標(biāo)志物包括抑制性突觸前特異性分子囊泡γ - 氨基丁酸（γ -aminobutyric acid，GABA） 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（vesicular GABA transporter，vGAT） 和抑制性突觸后特異性分子橋尾蛋白（Gephyrin），相關(guān)特異性分子分別組成特定的突觸結(jié)構(gòu)，共同形成復(fù)雜的神經(jīng)環(huán)路［5-9］。神經(jīng)元的體外原代培養(yǎng)是一種常用的神經(jīng)觀察體系［10］。原代培養(yǎng)神經(jīng)元被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)發(fā)育和突觸發(fā)育的觀察，還可用于藥理作用下或病理模型中神經(jīng)元生理和病理的研究及神經(jīng)元電生理功能的觀測(cè)等［11-14］。不同腦區(qū)來源的神經(jīng)元其體外發(fā)育過程不同，突觸相關(guān)發(fā)育也存在差異。對(duì)不同腦區(qū)神經(jīng)元的發(fā)育和突觸發(fā)育進(jìn)行觀察可為后續(xù)開展針對(duì)性的生理病理及電生理研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究［15-16］ 顯示：原代神經(jīng)元培養(yǎng)大多選擇皮層區(qū)神經(jīng)元，對(duì)基底神經(jīng)節(jié)隆起（ganglionic eminence，GE） 區(qū)神經(jīng)元培養(yǎng)并觀察其發(fā)育情況的研究較少。本研究對(duì)皮層區(qū)和GE 區(qū)神經(jīng)元突觸發(fā)育過程進(jìn)行比較，探討體外培養(yǎng)小鼠不同腦區(qū)來源神經(jīng)元的突觸結(jié)構(gòu)發(fā)育情況， 闡明不同性質(zhì)突觸結(jié)構(gòu)中最佳觀察和干預(yù)時(shí)間，為突觸發(fā)育研究和病理藥理研究提供參考。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器

10只 C57BL/6小鼠來源于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK （陜） 2019-001。小鼠于SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)， 室內(nèi)溫度約為24 ℃， 相對(duì)濕度約為50%， 光照為 12 h 光/12 h 暗循環(huán)。 神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)液（neurobasal medium， NB）、 0. 25% 胰酶消化液（Typsin-EDTA）、 細(xì)胞平衡鹽緩沖液（Hanks’ balanced salt solution， HBSS）、B27 添加劑和青- 鏈霉素混合液（100 U·mL－1 青霉素和0. 1 g·L－1 鏈霉素）（美國Gibco 公司），L-谷氨酰胺（美國Amresco 公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）， 多聚賴氨酸（美國Sigma 公司）， 抗PSD95 抗體和抗vGAT 抗體（美國 Abcam 公司），抗Gephyrin 抗體（美國Synaptic Systems 公司），抗vGLUT1 抗體（美國SYSY 公司）， Alexa Fluor?488 標(biāo)記鼠抗小鼠多克隆二抗、Alexa Fluor? 488 標(biāo)記鼠抗兔多克隆二抗、Alexa Fluor? 594 標(biāo)記鼠抗兔多克隆二抗和Alexa Fluor? 594 標(biāo)記抗豚鼠多克隆二抗（美國 Jackson Immunoresearch 公司），4'， 6- 二脒基-2- 苯基（4'， 6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）（德國Sigma 公司）， 山羊血清（北京索萊寶科技有限公司），Triton X-100 （瑞士Roche 公司）， NovoStart?SYBR High-sensitivityqPCR SuperMix （合肥吉象生物技術(shù)有限公司），PrimeScripttm RT Master Mix （北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）， TRIzol （北京TIANGEN 公司）。CO２培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific 公司），酶標(biāo)儀（瑞士TECAN 公司），超凈工作臺(tái)（蘇州蘇凈集團(tuán)安泰公司）， 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR （real-timefluorecence quantitative PCR， RT-qPCR） 儀（型號(hào)：C1000 Touch，美國Bio-Rad 公司），激光共聚焦顯微鏡（型號(hào)：FV3000，日本Olympus 公司）。

1. 2 神經(jīng)元原代培養(yǎng)及分組

C57BL/6雌鼠于妊娠第13. 5～15. 5 天斷頸處死后， 經(jīng)無菌操作取胚胎小鼠，置于含提前預(yù)冷1×HBSS 的培養(yǎng)皿中。于顯微鏡下逐步分離以獲取胚胎小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)腦組織，并去掉其表面腦膜。0. 25% Typsin-EDTA消化腦組織，制備為單細(xì)胞懸液，接種至預(yù)先用多聚賴氨酸包被的6 孔和24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，采用含2% B27、1% 青-鏈霉素混合液和0. 5 mmol·L－1 L-谷氨酰胺的NB 培養(yǎng)液培養(yǎng)。神經(jīng)元細(xì)胞于37 ℃ 、5% CO2 孵箱中孵育。隔日進(jìn)行半量換液1 次。于培養(yǎng)3、7、14 和21 d 分別收集細(xì)胞樣品， 并將其作為培養(yǎng)3、7、14 和21 d 組。

1. 3 RT-qPCR法檢測(cè)各組小鼠皮層區(qū)和GE區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中PSD95及Gephyrin mRNA表達(dá)水平

于培養(yǎng)3、7、14 和21 d 取出小鼠皮層區(qū)及GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元后，采用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA。采用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA 的濃度和純度， 取吸光度（A）（260） /A （280） 比值范圍于1. 8～2. 0 的RNA 樣本，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以合成cDNA。以β-actin 為內(nèi)參，檢測(cè)小鼠皮層區(qū)及GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中PSD95 和Gephyrin mRNA 表達(dá)水平。將配制好的反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至Bio-Rad CFX96 儀器中，設(shè)置反應(yīng)程序，進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件： 95 ℃ 起始模板變性15 min； 94 ℃ 變性20 s、60 ℃退火30 s，75 ℃延伸30 s，循環(huán)45 次。擴(kuò)增結(jié)束后，分析熔解曲線。采用2—ΔΔCt 法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。引物序列見表1。

1. 4 免疫熒光法檢測(cè)各組小鼠皮層區(qū)和 GE區(qū)原代 培 養(yǎng) 神 經(jīng) 元 中 vGLUT1、PSD95、vGAT 及Gephyrin蛋白表達(dá)水平

于培養(yǎng)第 14和 21天時(shí)，由孵箱中取出小鼠皮層區(qū)或GE 區(qū)神經(jīng)元，4% 多聚甲醛固定細(xì)胞，采用3% BSA+0. 1% Triton X-100封閉液預(yù)處理15 min， 加入1% BSA 液體稀釋的vGLUT1 （1∶500） 與PSD95 （1∶150） 的抗體混合液或vGAT （1∶ 1 000） 與Gephyrin （1∶ 150）的抗體混合液，4 ℃條件下于濕盒中孵育過夜。次日， 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline， PBS）洗滌細(xì)胞。加入稀釋的Alexa 488 標(biāo)記（1∶500）和Alexa 594 標(biāo)記（1∶500） 的熒光二抗，于暗室中孵育1 h。PBS 緩沖液漂洗細(xì)胞3 次后，于暗室孵育DAPI （1∶1 000） 染色以襯染細(xì)胞核。PBS 緩沖液漂洗細(xì)胞3 次，所有玻片倒置于加入適量抗熒光淬滅封片液的載玻片上，小心封片。－20 ℃避光保存。將樣品置于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察，每張玻片在60 倍目鏡下隨機(jī)采集3 個(gè)視野圖像，采用Imaris 軟件的“Filaments”功能計(jì)算樹突長度，計(jì)算單位長度樹突陽性染色點(diǎn)數(shù)，代表目的蛋白表達(dá)水平。陽性染色點(diǎn)數(shù)=陽性蛋白染色總點(diǎn)數(shù)/樹突長度。

1. 5 免疫熒光法檢測(cè)胚胎小鼠腦組織皮層區(qū)和GE 區(qū)神經(jīng)元中 vGLUT1 及 vGAT 蛋白表達(dá)水平

C57BL/6 雌鼠妊娠第13. 5～15. 5 天時(shí)行腹腔注射1% 戊巴比妥麻醉， 麻醉起效后取出胚胎小鼠。行4% 多聚甲醛灌注后，取出胚胎小鼠腦組織浸泡入4% 多聚甲醛后固定2 h，30% 蔗糖-PBS 緩沖液脫水。脫水24 h 后，進(jìn)行OCT 包埋和冰凍切片。對(duì)腦切片采用10% BSA+0. 1% Triton X-100 預(yù)處理30 min，加入1% BSA 稀釋的vGLUT1 （1∶ 200）和vGAT （1∶400） 抗體孵育液，于4 ℃濕盒中孵育過夜。次日，PBS 緩沖液洗滌腦片，加入稀釋的Alexa 488 標(biāo)記（1∶500） 和Alexa 594 標(biāo)記（1∶500）的熒光二抗，并于暗室孵育1 h。PBS 緩沖液漂洗切片3次后，暗室孵育DAPI （1∶1 000） 染液以顯示細(xì)胞核。PBS 緩沖液漂洗后加入適量抗熒光淬滅封片液于腦片，蓋玻片封片，待觀察。將完成染色的腦片置于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察，重點(diǎn)觀察皮層區(qū)和GE 區(qū)視野。采集10 倍和40 倍顯微鏡下的圖像， 采用Image J 軟件檢測(cè)蛋白熒光強(qiáng)度，“Image”功能標(biāo)簽計(jì)算特定顏色的像素值，代表目的蛋白表達(dá)水平。

1. 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中PSD95、Gephyrin mRNA 表達(dá)水平及vGLUT1、PSD95、vGAT 和Gephyrin 蛋白表達(dá)水平， 胚胎小鼠腦組織皮層區(qū)和GE 區(qū)神經(jīng)元中vGLUT1 及vGAT 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以-x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 各組小鼠皮層區(qū)和 GE區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中PSD95及Gephyrin mRNA表達(dá)水平

與培養(yǎng)3 d組比較， 培養(yǎng) 7 d 組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中PSD95 及Gephyrin mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）， 培養(yǎng)14 和21 d 組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中PSD95 及Gephyrin mRNA 表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 01）。與皮層區(qū)比較，培養(yǎng)3、7 和21 d 組小鼠GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中PSD95 及Gephyrin mRNA 表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）； 培養(yǎng)14 d 組小鼠GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中PSD95 mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）， GephyrinmRNA 表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）。見圖1。

2. 2 各組小鼠皮層區(qū)和 GE區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中vGLUT1、PSD95、vGAT 及 Gephyrin 蛋白表達(dá)水平

顯微鏡下觀察可見，培養(yǎng)14 d 組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中興奮性突觸及抑制性突觸均初步發(fā)育，相關(guān)蛋白呈陽性表達(dá)。其中興奮性突觸相關(guān)蛋白陽性表達(dá)在皮層區(qū)神經(jīng)元中更為明顯，且突觸前分子vGLUT1 蛋白和突觸后分子PSD95蛋白在皮層區(qū)神經(jīng)元的胞體及突起部位均呈現(xiàn)共定位的特征；抑制性突觸前分子vGAT 蛋白和突觸后分子Gephyrin 蛋白在GE 區(qū)神經(jīng)元胞體及突起中也呈現(xiàn)共定位的特征，且突觸前分子較相應(yīng)的突觸后分子蛋白陽性表達(dá)更明顯。見圖2 和3。與皮層區(qū)（0. 236±0. 040 和0. 193±0. 040） 比較， 培養(yǎng)14 d 組小鼠GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中vGLUT1 和PSD95 蛋白表達(dá)水平（0. 195±0. 047 和0. 143±0. 039） 均明顯降低（Plt;0. 01）。與皮層區(qū)（0. 180±0. 037 和0. 065±0. 027） 比較，培養(yǎng)14 d 組小鼠GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中vGAT 和Gephyrin 蛋白表達(dá)水平（0. 251±0. 043 和0. 198±0. 031） 均明顯升高（Plt;0. 01）。

培養(yǎng)21 d 組小鼠皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白陽性表達(dá)增加，興奮性突觸和抑制性突觸進(jìn)一步成熟并完善。皮層區(qū)和GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元的胞體及突起部位均形成豐富的突觸前后對(duì)應(yīng)的表達(dá)模式，突觸結(jié)構(gòu)逐步發(fā)育良好，且突觸前分子較相應(yīng)的突觸后分子蛋白陽性表達(dá)更明顯。見圖4 和5。與皮層區(qū)（0. 474±0. 064 和0. 264±0. 044） 比較， 培養(yǎng)21 d 組小鼠GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中vGLUT1 和PSD95 蛋白表達(dá)水平（0. 351±0. 072 和0. 231±0. 061） 均明顯降低（Plt;0. 01）。與皮層區(qū)（0. 293±0. 038 和0. 151±0. 028） 比較，培養(yǎng)21 d 組小鼠GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中vGAT 和Gephyrin 蛋白表達(dá)水平（0. 355±0. 063 和0. 269±0. 058） 均明顯升高（Plt;0. 01）。

2. 3 胚胎小鼠腦組織皮層區(qū)和 GE 區(qū)神經(jīng)元中vGLUT1 和 vGAT 蛋 白 表 達(dá) 水 平

與 皮 層 區(qū)（127. 70±17. 04 和103. 6±8. 87） 比較， 胚胎小鼠腦組織GE 區(qū)神經(jīng)元中vGLUT1 蛋白表達(dá)水平（104. 10±9. 08） 明顯降低（Plt;0. 01），vGAT蛋白表達(dá)水平（118. 30±8. 79）明顯升高（Plt;0. 05）。見圖6。

3 討 論

在神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的研究中，體外培養(yǎng)神經(jīng)元能夠?yàn)樯砗筒±硌芯刻峁┝己玫募?xì)胞模型，在神經(jīng)元功能、神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)藥理學(xué)和神經(jīng)疾病研究等方面具有重要的意義［17-18］。在神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默病的研究中，培養(yǎng)基底前腦的神經(jīng)元可觀察其中不同類型神經(jīng)元（如膽堿能神經(jīng)元） 在致病因素作用下的變化，揭示疾病相關(guān)的細(xì)胞病理變化及其機(jī)制［19］。因此， 對(duì)于神經(jīng)元體外培養(yǎng)發(fā)育時(shí)程和發(fā)育特征等生理過程的研究具有重要意義，也是病理研究的基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，體外培養(yǎng)皮層區(qū)和GE 區(qū)神經(jīng)元的發(fā)育過程中，突觸相關(guān)分子vGLUT1、PSD95、vGAT 和Gephyrin 蛋白表達(dá)水平均明顯升高，且皮層區(qū)和GE 區(qū)抑制性突觸及興奮性突觸發(fā)育存在差異。在相同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，興奮性突觸相關(guān)分子在皮層神經(jīng)元的表達(dá)高于GE 區(qū)神經(jīng)元， 抑制性突觸相關(guān)分子在GE 區(qū)神經(jīng)元的表達(dá)高于皮層神經(jīng)元。提示GE 區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元較皮層區(qū)原代培養(yǎng)神經(jīng)元更適合進(jìn)行GABA能神經(jīng)元的發(fā)育研究。此外，突觸前分子和突觸后分子的表達(dá)也存在差異，在皮層區(qū)和GE 區(qū)神經(jīng)元的興奮性及抑制性突觸中，突觸前相關(guān)分子的表達(dá)均較突觸后分子的表達(dá)更為明顯。

皮層區(qū)和GE 區(qū)神經(jīng)元突觸分子的差異表達(dá)可能是由于2 個(gè)腦區(qū)發(fā)育的細(xì)胞類型不同所致。本研究結(jié)果顯示：胚胎小鼠腦組織皮層區(qū)和GE 區(qū)神經(jīng)元在突觸分子表達(dá)方面及突觸發(fā)育方面存在差異，可能與2 個(gè)腦區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)育有關(guān)。GE 區(qū)是大腦胚胎發(fā)育過程中短暫存在的腦結(jié)構(gòu)，位于端腦的腹側(cè)部，被認(rèn)為是紋狀體、杏仁核和基底前腦等重要腦區(qū)的發(fā)育原基［20］。GE 區(qū)神經(jīng)干（祖） 細(xì)胞分化為大量的GABA 能神經(jīng)元， 分布于皮層區(qū)和紋狀體等端腦亞區(qū)［21-23］。因此， 皮層區(qū)的抑制性GABA 能中間神經(jīng)元也來源于GE 區(qū)，并在分化發(fā)育過程中逐漸遷移至皮層區(qū)［24］。皮層區(qū)原位的神經(jīng)干（祖） 細(xì)胞主要發(fā)育為皮層區(qū)的興奮性神經(jīng)元。本研究結(jié)果顯示：相同的原代培養(yǎng)時(shí)間，與皮層區(qū)比較，GE 區(qū)神經(jīng)元中vGLUT1 和PSD95 蛋白表達(dá)水平明顯降低，vGAT 和Gephyrin 蛋白表達(dá)水平明顯升高，可能與不同腦區(qū)可作為不同類型神經(jīng)元的發(fā)育原基有關(guān)。

突觸前后相關(guān)分子的先后發(fā)育可能反映了發(fā)育過程中突觸前對(duì)突觸后的發(fā)育引導(dǎo)。在突觸發(fā)育過程中，突觸前成分與突觸后成分之間被證實(shí)存在相互作用， 且突觸前成分對(duì)突觸后成分具有引導(dǎo)作用［25］。當(dāng)突觸前神經(jīng)元釋放興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸后，可以通過 P38 和 Jun 等信號(hào)分子，誘導(dǎo)突觸后神經(jīng)元，上調(diào)與谷氨酸相對(duì)應(yīng)的離子型受體在細(xì)胞膜上的表達(dá)， 如興奮性受體 N-甲基-D 天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate， NMDA） 受體GluN1 亞基的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示：相同原代培養(yǎng)時(shí)間，突觸前成分相關(guān)蛋白表達(dá)較突觸后成分相關(guān)蛋白表達(dá)更明顯，與突觸發(fā)育過程中突觸前對(duì)突觸后的引導(dǎo)作用一致。

綜上所述，皮層區(qū)和GE 區(qū)神經(jīng)元的突觸發(fā)育具有明顯的差異性，皮層區(qū)興奮性突觸發(fā)育較早，GE 區(qū)抑制性突觸發(fā)育較早。突觸的腦區(qū)特異性發(fā)育提示不同細(xì)胞類型的神經(jīng)疾病可能具有不同的發(fā)育來源，需在實(shí)驗(yàn)中加以甄別。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：趙艷和盧廣泉參與文獻(xiàn)檢索、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及論文撰寫，趙艷、杜金樂、潘雨綺和董子意參與數(shù)據(jù)收集及分析，康鑫和高弋婷參與論文結(jié)果分析及討論，高方和楊加周參與論文寫作指導(dǎo)及審校。

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[基金項(xiàng)目] 國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（82071529）