果蠅在阿爾茨海默病研究中的應(yīng)用

［摘要］阿爾茨海默?。ˋD）是較為常見的慢性神經(jīng)退行性改變。果蠅遺傳背景清晰、實(shí)驗(yàn)操作簡便、與人類疾病有關(guān)的基因或是與其高度相似的同源基因都可以在果蠅體內(nèi)找到。利用果蠅經(jīng)典的半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件4 -上游激活序列（GAL4-UAS）系統(tǒng)已建立了多種AD果蠅模型，開展了AD的分子機(jī)制及藥物篩選研究。本文針對不同類型的AD果蠅模型的制備原理、方法及應(yīng)用作一綜述，為利用果蠅進(jìn)行AD研究提供思路。

［關(guān)鍵詞］阿爾茨海默??；黑腹果蠅；GAL4-UAS系統(tǒng)

doi：10.3969/j.issn.1674-7593.2024.02.018

Utilizing Drosophila Melanogaster in Alzheimer's Disease Research：Applications and Insights

Ma Huiying1，Zhang Xiaoyun1，Zhang Liyuan1，Li Fangyu1，Li Xinran1，Zhu Mingxue2，Yang Limin1，2**

1Department of Human Anatomy and Histology and Embryology，School of Medicine，Dalian University，Dalian116622;2Chronic DiseaseResearch Center of Dalian，Dalian116622

**Corresponding author：Yang Limin，email：yanglimin@dlu.edu.cn

［Abstract］Alzheimer′s disease（AD） is a widely recognized chronic neurodegenerative condition.Drosophila，with its well-defined genetic structure，straightforward experimental methodologies，and the presence of human disease-related genes or highly similar homologous genes，serves as an advantageous model organism.The utilization of "Drosophila′s renowned Galactose-regulated Upstream Promoter Element 4-Upstream Activating Sequence（GAL4-UAS） system has led to the development of various AD models.These models facilitate the exploration of AD′s molecular mechanisms and the advancement of drug discovery efforts.This paper reviews the foundational principles，methodologies，and diverse applications of different AD Drosophila models，offering insights and innovative approaches for AD research utilizing Drosophila.

［Key words］Alzheimer′s disease;Drosophila melanogaster;GAL4-UAS system

阿爾茨海默?。ˋlzheimer 's disease，AD）是老年人群表觀神經(jīng)元功能障礙中最常見的一種，臨床表現(xiàn)為神經(jīng)紊亂、認(rèn)知功能持續(xù)性進(jìn)行性衰退、運(yùn)動(dòng)功能喪失等。在AD患者的大腦中，可以觀察到細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原的纖維纏結(jié)（Neurofibrillary tangles，NFTs）和細(xì)胞外淀粉樣斑塊（Senile plaques，SPs）沉積以及腦萎縮，這些病理改變導(dǎo)致進(jìn)行性神經(jīng)元死亡、腦內(nèi)突觸丟失、記憶障礙和認(rèn)知障礙［1］。當(dāng)前，對于AD發(fā)病機(jī)理存在數(shù)種假說，主要包括炎癥、氧化應(yīng)激、β淀粉樣蛋白（Amyloid beta，Aβ）在大腦神經(jīng)元外異常沉積、神經(jīng)元內(nèi)Tau蛋白的NFTs、膽堿能神經(jīng)元損傷等，但其確切的病理機(jī)制尚不明確［2］。果蠅壽命僅60 d左右，繁殖周期僅10～12 d，而AD具有緩慢進(jìn)行性加重的特征，因此，該模型有助于短時(shí)間內(nèi)觀察到完整病程。除此之外，果蠅繁殖力極強(qiáng)，雌性果蠅一次可產(chǎn)卵約400枚，這使得實(shí)驗(yàn)規(guī)模和數(shù)據(jù)獲取速度得以大幅提升。最重要的是，果蠅遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)簡單，基因組現(xiàn)已被完全解析，人類AD基因可以在果蠅體內(nèi)找到相應(yīng)同源基因。本文對現(xiàn)有的數(shù)種AD果蠅模型及其特點(diǎn)、應(yīng)用等作一綜述，以期為AD相關(guān)研究提供新的方向和選擇。

1黑腹果蠅的簡介

黑腹果蠅（Drosophila melanogaster），以下簡稱果蠅，是昆蟲綱、雙翅目、果蠅科、果蠅屬昆蟲。由于其遺傳背景清晰、繁殖力極強(qiáng)、生命周期較短以及實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)維持成本較低等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域。此外在發(fā)育生物學(xué)以及分子生物學(xué)領(lǐng)域，果蠅的作用也不容小覷。在人類孟德爾遺傳在線（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數(shù)據(jù)庫內(nèi)，929個(gè)人類疾病相關(guān)基因條目中有714個(gè)（77%）在果蠅中具有高度相似的同源基因，與神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的果蠅基因與潛在人類疾病基因集的分析顯示，兩者相關(guān)基因共74個(gè)，重合度達(dá)10.36%［3］。此外，果蠅還是人類基因組計(jì)劃一部分測序工作的主要模式生物之一［4］。

果蠅的半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件4 -上游激活序列（Galactose-regulated upstream promoter element4- upstream activating sequence，GAL4-UAS）系統(tǒng)是一種雙元表達(dá)系統(tǒng)，常被用于果蠅遺傳學(xué)相關(guān)研究。UAS是基因啟動(dòng)子的上游激活序列，是酵母中一種類似高等真核生物增強(qiáng)子的序列，可通過增加轉(zhuǎn)錄活性來增強(qiáng)目的基因的表達(dá)。GAL4是一個(gè)酵母轉(zhuǎn)錄激活因子， 其DNA結(jié)構(gòu)結(jié)合域（DNA-binding domain，BD）可以識別UAS并與之結(jié)合，從而激活UAS下游的目標(biāo)基因，誘導(dǎo)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。在GAL4未與UAS結(jié)合的情況下，UAS下游的靶基因處于沉默狀態(tài)［5］。由于 GAL4可強(qiáng)效激活擁有 GAL4 結(jié)合位點(diǎn)的基因轉(zhuǎn)錄，因此，將組織特異性的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子與GAL4基因相連所建立的轉(zhuǎn)基因系，與UAS-目標(biāo)基因系進(jìn)行雜交，可產(chǎn)生在特定組織中表達(dá)目標(biāo)基因的子代［6］。例如，肌動(dòng)蛋白5C-半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件4（Actin 5C- galactose regulates upstream promoter elements 4，act5C-GAL4）果蠅品系與UAS-目標(biāo)基因系進(jìn)行雜交可使目標(biāo)基因表達(dá)在所有細(xì)胞內(nèi)，而胚胎致死性異常視覺系統(tǒng)-半乳糖調(diào)節(jié)上游啟動(dòng)子元件4（Embryonic lethal abnormal visual system- Galactose regulates upstream promoter elements 4，elav-GAL4）則可使目標(biāo)基因僅在果蠅神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)。目前，果蠅的 GAL4-UAS 系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域，也是利用果蠅研究AD的重要工具之一。

2AD果蠅模型

目前存在多種關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制的假說，其中Aβ級聯(lián)假說和Tau蛋白異常磷酸化假說得到了科學(xué)家的廣泛認(rèn)可。根據(jù)Aβ級聯(lián)假說，大腦中Aβ的積累是AD的主要原因。淀粉樣前體蛋白（Amyloid precursor protein，APP）被β分泌酶，也稱為β位點(diǎn)APP裂解酶（Beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme，BACE），和γ分泌酶連續(xù)水解產(chǎn)生Aβ，Aβ逐漸聚合形成SPs，被認(rèn)為是AD的關(guān)鍵致病因素。Tau 蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，在AD患者腦中，Tau蛋白過度磷酸化，由可溶性轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄缘?，同時(shí)高度聚集，無法執(zhí)行其原來所具有的生物學(xué)功能，反而會(huì)產(chǎn)生毒性，并導(dǎo)致NFTs的形成［7］。基于這兩種主流學(xué)說，研究人員構(gòu)建了多種不同的AD果蠅模型。

2.1基于 APP/BACE的果蠅模型

APP/BACE模型是通過在發(fā)育過程中果蠅的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)過表達(dá)人類 APP 和 BACE 基因，造成神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)Aβ生成增多，形成Aβ沉積。利用elav-GAL4在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)過表達(dá)這兩種基因產(chǎn)物，即親本elav-GAL4;與UAS-APP，UAS-BACE雜交，得到子一代，即目標(biāo)轉(zhuǎn)基因果蠅elav-GAL4;UAS-APP;UAS-BACE，該品系果蠅在生物化學(xué)、神經(jīng)病理、神經(jīng)解剖和行為等方面會(huì)發(fā)生明顯改變。包括大腦內(nèi)出現(xiàn)Aβ樣斑塊、與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)元樹突和軸突的減少等。

該模型的優(yōu)勢在于模擬了人體內(nèi)從APP剪切到Aβ的累積等一系列AD相關(guān)病理過程，由于人類APP和人類BACE基因在果蠅中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)以及被γ分泌酶的切割等過程的發(fā)生，會(huì)導(dǎo)致果蠅生物化學(xué)、神經(jīng)解剖學(xué)、神經(jīng)病理學(xué)和行為學(xué)等方面一系列的改變，且這些神經(jīng)病變和記憶缺陷在數(shù)日內(nèi)就會(huì)發(fā)生，而發(fā)育生物學(xué)可以幫助確定藥物在體內(nèi)的作用機(jī)制，因此，與其他果蠅模型相比，該模型與臨床AD關(guān)聯(lián)更為緊密，而且更適用于快速檢測小分子藥物對AD干預(yù)的有效性［8］。如通過巴浦洛夫嗅覺記憶實(shí)驗(yàn)、壽命實(shí)驗(yàn)等檢測藥物的抗AD效果［9］。但需要注意的是，該模型的果蠅大腦內(nèi)不會(huì)出現(xiàn)顯著的NFTs。其次，利用果蠅經(jīng)典的 GAL4-UAS 系統(tǒng)，通過連續(xù)雜交和分子表型的篩選建立的，在果蠅全部神經(jīng)元中表達(dá)兩個(gè)拷貝APP /BACE的轉(zhuǎn)基因果蠅，神經(jīng)退行性病變表型相較于其他模型更為明顯［10］。由此可見，在神經(jīng)系統(tǒng)中過表達(dá)APP/BACE是快速構(gòu)建 AD果蠅模型的有效工具。

近年來，許多研究人員利用該模型，以γ分泌酶抑制劑為突破口進(jìn)行了深入研究。例如，實(shí)驗(yàn)證明γ分泌酶抑制劑N-［N-（3，5-二氟苯乙?；? l -丙氨酰］-（S）-苯基甘氨酸叔丁基酯（N-］N-（3，5-difluorophenacetyl）-L-alanyl］-（S）-phenylglycine t-butyl ester ，DAPT）可以降低體內(nèi)的Aβ水平，有望作為AD的潛在治療藥物［11］。遺傳學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法的發(fā)展將會(huì)提供蛋白質(zhì)表達(dá)、分布和特性的精確結(jié)果，基于 APP/BACE的果蠅模型的遺傳學(xué)價(jià)值，涉及AD和γ分泌酶抑制劑等藥物之間相互作用的研究將會(huì)更加深入、快速和精準(zhǔn)。

2.2基于Aβ的果蠅模型

相較于其他模型，Aβ模型是最直接、最便利的研究Aβ42毒性及影響的模型。研究人員將Aβ40或Aβ42基因與果蠅內(nèi)源性壞死基因序列的信號肽基因融合，通過GAL4-UAS系統(tǒng)，培育了可以在不同時(shí)空上表達(dá)的Aβ40和Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅。如將elav-GAL4;與UAS- Aβ42;UAS-Aβ42雜交，得到所有神經(jīng)元都表達(dá)Aβ42的子一代果蠅elav-GAL4;UAS - Aβ42;UAS-Aβ42［12］。成年后的Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅較正常果蠅相比，具有運(yùn)動(dòng)能力下降、壽命縮短等AD病理表型，且表達(dá)兩個(gè)拷貝Aβ42的果蠅神經(jīng)退行性變表型相較只表達(dá)一個(gè)拷貝的果蠅要更為嚴(yán)重。

該模型可通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)、免疫熒光等手段檢測Aβ的含量，從而為藥物作用效果、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路探索、疾病進(jìn)程判斷提供支持，也可以利用果蠅的負(fù)趨地性進(jìn)行爬管實(shí)驗(yàn)，通過逆重力攀爬指數(shù)對運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行評定。由于表達(dá)的Aβ40或Aβ42與APP突變產(chǎn)生的肽相對應(yīng)，因此很好地避免了APP加工過程可能產(chǎn)生的其他大小不同的Aβ對實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的影響［13］。使得此果蠅模型具有直接評估Aβ毒性的主要優(yōu)勢。

有研究人員證實(shí)氧化還原傳感器在Aβ果蠅模型中的適用性，首次以定量方式區(qū)分神經(jīng)毒性蛋白質(zhì)聚集體對細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的影響，為后續(xù)以Aβ果蠅為模型研究抗氧化劑對Aβ毒性的影響提供了依據(jù)［14］。研究人員通過將在感光神經(jīng)元中表達(dá)Aβ42的果蠅暴露于反應(yīng)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）中，證明了ROS誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化可能會(huì)加劇Aβ42誘導(dǎo)的表型，以及ROS和Aβ42的存在可以協(xié)同誘導(dǎo)果蠅的神經(jīng)退行性變的假設(shè)。并且利用血腦屏障透過性抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸酰胺（N-acetylcysteine amide，NACA），可以強(qiáng)烈抑制過氧化脂質(zhì)的形成和果蠅神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中脂滴的積累，從而控制AD的發(fā)展［15］。

2.3基于Tau蛋白異常磷酸化的AD果蠅模型

除基于Aβ級聯(lián)假說的AD果蠅模型外，過表達(dá)人的Tau蛋白突變體的果蠅模型的應(yīng)用也比較廣泛，相較于基于Aβ的相關(guān)病理機(jī)制，Tau蛋白的病理機(jī)理與認(rèn)知功能減退聯(lián)系更加緊密［16］。Tau蛋白是NFTs的主要組成成分，而NFTs是AD主要病理特征之一［17］。研究人員應(yīng)用GAL4-UAS系統(tǒng)，將人Tau蛋白或Tau蛋白突變體過表達(dá)于果蠅的不同部位，開發(fā)出數(shù)種果蠅模型，用于AD的相關(guān)研究。應(yīng)用elav-GAL4將人Tau蛋白或Tau蛋白突變體過表達(dá)于所有神經(jīng)元，可導(dǎo)致果蠅壽命縮短和漸進(jìn)性神經(jīng)退行性病變［18］。應(yīng)用眼睛表達(dá)啟動(dòng)子（Glass multiple reporter- galactose regulates upstream promoter elements 4 ，GMR -GAL4）將人Tau蛋白或Tau蛋白突變體過表達(dá)于果蠅的光感受器神經(jīng)元，即 GMR-GAL4;與UAS-Tau;雜交，則可導(dǎo)致子一代基因型為GMR-GAL4;UAS- Tau;的果蠅產(chǎn)生粗糙眼表型［19］。該表型可以幫助研究人員直觀地判斷Tau蛋白的毒性作用。

對比基于Aβ級聯(lián)假說的幾種AD果蠅模型，Tau蛋白轉(zhuǎn)基因模型的最大優(yōu)勢在于可以模擬AD患者Tau蛋白的過度磷酸化，因而被廣泛應(yīng)用。但該模型不能用于模擬AD其他病理過程。Tau蛋白轉(zhuǎn)基因模型可應(yīng)用于針對Tau蛋白毒性或與Tau蛋白相關(guān)的細(xì)胞信號通路的研究，也可應(yīng)用此模型進(jìn)行抗Tau蛋白毒性藥物的快速篩選。近年來，由于以Aβ為靶點(diǎn)的多種藥物在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)不佳，因此Tau蛋白轉(zhuǎn)基因果蠅模型正受到來自世界范圍內(nèi)AD藥物研發(fā)領(lǐng)域的重視。

通過GMR-GAL4將人類Tau基因表達(dá)在果蠅視網(wǎng)膜上，將Tau蛋白毒性可視化，研究人員發(fā)現(xiàn)了可以調(diào)控AD相關(guān)基因表達(dá)水平的N6-甲基腺苷（N6 -methyladenosine，m6A），該模型幫助研究人員以一種快速、簡單、定性的方式確認(rèn)了m6A對Tau蛋白毒性的影響，為AD機(jī)制的探索以及未來的藥物研發(fā)提供了新的方向［20］。

3小結(jié)與展望

果蠅以其生命周期短，繁殖力強(qiáng)，遺傳背景清晰以及基因組測序已全部完成等顯著優(yōu)勢，克服了AD這一神經(jīng)退行性疾病研究過程中出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)周期長、成本高、致病機(jī)制復(fù)雜多樣等困難。但是哺乳動(dòng)物和昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)在發(fā)育過程中的組織結(jié)構(gòu)以及發(fā)育方式并不完全相同，這使得果蠅無法完美地模擬AD的一切病理過程，例如哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)NFTs的形成在果蠅腦內(nèi)并未觀察到。但是果蠅最大優(yōu)勢在于其遺傳可處理性，這使得它非常容易克服各種限制，在功能相對簡單但進(jìn)化保守的體內(nèi)系統(tǒng)中使用強(qiáng)大的遺傳工具，對疾病過程加以模擬，因此果蠅仍被證明是人類神經(jīng)退行性疾病的絕佳模型。

近年來，關(guān)于AD病理機(jī)制以及遺傳相關(guān)領(lǐng)域的研究取得了豐富的成果，使得我們對于AD有了更為深入的了解，應(yīng)用果蠅AD模型，不僅可以對大量藥物的抗AD藥效進(jìn)行初步篩選，還可以進(jìn)一步從分子水平，對藥物作用的機(jī)制進(jìn)行研究。本文對現(xiàn)有的AD果蠅模型的制備方案、特點(diǎn)、優(yōu)勢、局限性以及成功應(yīng)用的案例進(jìn)行了梳理總結(jié)。與對所有AD動(dòng)物模型的研究一樣，許多用于研究果蠅神經(jīng)退行性變的實(shí)驗(yàn)方法在疾病基因表達(dá)的空間和時(shí)間方面存在一些局限，例如Tau蛋白在顆粒細(xì)胞層中的積累過程超出了果蠅的壽命以及NFTs的模擬難題等。然而，該領(lǐng)域正在不斷發(fā)展，隨著新的遺傳工具不斷投入使用，研究人員將針對AD進(jìn)行更深層次、更精確的實(shí)驗(yàn)，使果蠅成為研究AD機(jī)制及藥物的強(qiáng)大的非哺乳動(dòng)物體內(nèi)系統(tǒng)。

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（2023-09-21收稿）