益腎活血通竅法對(duì)D-半乳糖致老化大鼠模型前庭內(nèi)側(cè)核PI3K/AKT信號(hào)通路和氧化應(yīng)激的影響

［摘要］目的觀察益腎活血通竅法對(duì)D-半乳糖腹腔注射致老化大鼠模型前庭內(nèi)側(cè)核磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路和氧化應(yīng)激表達(dá)水平的影響，探討益腎活血通竅法延緩前庭內(nèi)側(cè)核老化的機(jī)制。方法18只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分成空白組、模型組和中藥組，各6只?？瞻捉M腹腔注射生理鹽水500 mg/（kg·d），模型組、中藥組腹腔注射D-半乳糖500 mg/（kg·d），連續(xù)注射8周。造模成功后，空白組、模型組灌服生理鹽水18.45 g/（kg·d），中藥組灌服益腎活血通竅方18.45 g/（kg·d），連續(xù)灌服8周。末次給藥后2 h評(píng)估各組大鼠前庭功能，然后進(jìn)行前庭內(nèi)側(cè)核取材，通過(guò)ELISA法檢測(cè)各組血清谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）的表達(dá)水平，通過(guò)Westernblot法檢測(cè)各組前庭內(nèi)側(cè)核PI3K、AKT1的表達(dá)水平。結(jié)果三組空中翻正反射實(shí)驗(yàn)成功率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組、中藥組的頭偏斜角度大于空白組，中藥組的頭偏斜角度小于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白組比較，模型組血清GSH的表達(dá)水平降低，MDA、ROS的表達(dá)水平增高，前庭內(nèi)側(cè)核組織中PI3K、AKT1表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，中藥組血清GSH表達(dá)水平及前庭內(nèi)側(cè)核中PI3K、AKT1表達(dá)水平升高，血清MDA、ROS的表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論益腎活血通竅法對(duì)老化大鼠模型前庭內(nèi)側(cè)核具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路與氧化應(yīng)激相關(guān)。

［關(guān)鍵詞］益腎活血通竅法；老化；前庭內(nèi)側(cè)核；PI3K/AKT信號(hào)通路；氧化應(yīng)激

doi：10.3969/j.issn.1674-7593.2024.02.007

The Effect of Yishen Huoxue Tongqiao Method on the PI3K/AKT Signal Pathway andOxidative Stress in the Medial Vestibular Nucleus of D-galactose InducedAging Model Rats

Zhang Qi1， Leng Hui1**，Jin Jing2，Sun Jiawei1，2，Tian Yu1

1Department of ENT amp; HN，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital，Shenyang110000;2Graduate School，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning110847

**Corresponding author：Leng Hui，email：Lengh1976@163.com

［Abstract］ObjectiveTo observe the effects of Yishen Huoxue Tongqiao method on the PI3K/AKT signaling pathway and oxidative stress expression level in the medial vestibular nucleus of aging model rats induced by intraperitoneal injection of D-galactose，and to explore the mechanism of Yishen Huoxue Tongqiao method in delaying the aging of the medial vestibular nucleus.MethodsAfter adaptive feeding of 18 rats for 7 days，they were randomly divided into a blank group，a model group，and a Traditional Chinese Medicine group，with 6 rats in each group.The blank group was intraperitoneally injected with 500 mg/（kg·d） of physiological saline，while the model group and Traditional Chinese Medicine group were intraperitoneally injected with 500 mg/（kg·d） of D-galactose for 8 consecutive weeks.After successful modeling，the blank group and model group were orally administered physiological saline at 18.45 g/（kg·d），while the Traditional Chinese Medicine group was orally administered Yishen Huoxue Tongqiao decoction at 18.45 g/（kg·d） for 8 consecutive weeks.The vestibular function of each group of rats 2 hours after the last administration was evaluated，and the samples from the medial vestibular nucleus were collected.The expression levels of glutathione（GSH），malondialdehyde（MDA），reactive oxygen species（ROS） in each group were detected by the Elisa method，and the expression levels of PI3K and AKT1 in the medial vestibular nucleus were detected by the Western blot method.ResultsThere was no statistically significant difference in the success rates of three sets of aerial righting reflex tests（Pgt;0.05）.The head deviation angle of the model group and the Traditional Chinese Medicine group was greater than that of the blank group，while the head deviation angle of the Traditional Chinese Medicine group was smaller than that of the model group，and the differences were statistically significant（Plt;0.05）.Compared with the blank group，the expression of serum GSH in the model group decreased，while the expression of MDA and ROS increased.The expression levels of PI3K and AKT1 in the medial vestibular nucleus tissue decreased，and the differences were statistically significant（Plt;0.05）.Compared with the model group，the expression levels of serum GSH and PI3K and AKT1 in the medial vestibular nucleus were increased in the Traditional Chinese Medicine group，while the expression levels of serum MDA and ROS were reduced，with statistical significance（Plt;0.05）.ConclusionThe Yishen Huoxue Tongqiao method has a protective effect on the medial vestibular nucleus of aging model rats，and its mechanism may be related to regulating the PI3K/AKT signaling pathway and oxidative stress.

［Key words］Yishen Huoxue Tongqiao method;Aging;Medial vestibular nucleus;PI3K/AKT signaling pathway;Oxidative stress

隨著醫(yī)療保健、診療技術(shù)、預(yù)防接種的逐步完善，人類預(yù)期壽命穩(wěn)步增加，預(yù)估2050年全球60歲以上的人口將高達(dá)21億，然而疾病易感性及人體脆弱性也隨著老年人數(shù)量的增加及壽命的延長(zhǎng)呈現(xiàn)持續(xù)增長(zhǎng)狀態(tài)。近年來(lái)，頭暈、不平衡感已成為老年人群最常見的主訴之一。研究表明，限制日?；顒?dòng)的嚴(yán)重頭暈的1年患病率與年齡相關(guān)，其中年齡為60歲以上的患者患病率為20%，70歲以上為30%，80歲以上高達(dá)50%［1］。此類人群中，前庭性疾病占比較高，每年約5萬(wàn)次的跌倒是由前庭疾病造成的。前庭系統(tǒng)在維持軀體穩(wěn)定和保持姿勢(shì)平衡方面起著重要作用，本課題組前期對(duì)2 053例正常人進(jìn)行的雙溫試驗(yàn)眼震最大慢相角速度與年齡的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，老年患者前庭功能出現(xiàn)減退［2］。2019年Bárány學(xué)會(huì)制定了老年性前庭病（Presbyvestibulopathy，PVP）的定義和診斷標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)適用于因機(jī)體老化出現(xiàn)的輕度生理性前庭功能下降，這類人群表現(xiàn)為前庭功能不完全喪失［3］。盡早發(fā)現(xiàn)PVP的意義在于盡早通過(guò)主動(dòng)干預(yù)以降低老年人群跌倒、摔傷的風(fēng)險(xiǎn)。中醫(yī)藥治療眩暈歷史悠久，臨床應(yīng)用益腎活血通竅法治療耳源性眩暈緩解期患者療效顯著［4-5］。研究證實(shí)磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB即AKT）信號(hào)通路與細(xì)胞周期改變、凋亡有關(guān)，在細(xì)胞老化中發(fā)揮著非常重要的作用［6-7］。本研究基于PI3K/AKT信號(hào)通路和氧化應(yīng)激研究益腎活血通竅法對(duì)老化大鼠模型前庭內(nèi)側(cè)核的保護(hù)作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性SD大鼠18只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司［合格證號(hào)SCXK（遼）2020-0001］，飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室［使用許可證編號(hào)SYXK（遼）2019-0004］。實(shí)驗(yàn)室屏障通風(fēng)循環(huán)良好，室溫20～25℃，濕度45%～55%，光照12 h/d。實(shí)驗(yàn)遵循相關(guān)規(guī)定，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查［批件號(hào)2023CS（DW）-003-01］，大鼠飼養(yǎng)期間均受人道對(duì)待。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物、試劑及儀器

益腎活血通竅法為口服益腎活血通竅方，組方包括熟地黃20 g、山藥15 g、山萸肉20 g、丹皮15 g、茯苓15 g、澤瀉15 g、枸杞20 g、菊花15 g、桃仁15 g、紅花15 g、丹參15 g、石菖蒲15 g、炙甘草10 g，飲片購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院草藥局。D-半乳糖購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（貨號(hào)63004434）。兔抗鼠PI3K抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司（貨號(hào)ab191606）、兔抗鼠AKT1抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司（貨號(hào)10176-2-AP），β-Actin抗體購(gòu)自美國(guó)SAB公司（貨號(hào)21338）。谷胱甘肽（Glutathione，GSH）ELISA檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)YJ531010）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）ELISA檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)YJ077384）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）ELISA檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)YJ026288）均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。儀器主要有垂直電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，JY-ZY5）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能生命科學(xué)有限公司，Tanon-5200Multi）、多功能全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek，Epoch）等。

按方中劑量取中藥飲片并加入500 mL蒸餾水，煎煮前浸泡藥材30 min，然后置于電子萬(wàn)用爐上煎煮，調(diào)至高功率迅速煮沸后再調(diào)至低功率，保持沸騰狀態(tài)20 min。分離藥液，再次加入500 mL蒸餾水，按照上法繼續(xù)煎煮20 min，共計(jì)煎煮3次。將上述藥液混合收集，混勻后濃縮至100 mL，生藥濃度為2.05 g/mL。

1.3分組及造模

將18只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分成空白組、模型組、中藥組，每組各6只。模型組、中藥組腹腔注射500 mg/（kg·d）的D-半乳糖，連續(xù)注射8周進(jìn)行模型制作［8］。同期，空白組腹腔注射等量的生理鹽水。

成人（60 kg）口服益腎活血通竅方的劑量為3.42 g/（kg·d）。通過(guò)人與大鼠等效劑量換算公式換算大鼠經(jīng)口灌服益腎活血通竅方的等效劑量為18.45 g/（kg·d）?？瞻捉M和模型組灌服生理鹽水18.45 g/（kg·d），中藥組灌服益腎活血通竅方18.45 g/（kg·d），連續(xù)8周。

1.4前庭功能評(píng)估

空中翻正反射實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估前庭的動(dòng)態(tài)平衡：操作者手持清醒大鼠使其保持仰臥位姿態(tài)，并將其置于鋪設(shè)泡沫墊的地面上方約50 cm處，隨后松手使大鼠自由落體降落，觀察大鼠的落地姿勢(shì)，若落地姿態(tài)為俯臥位則記錄為成功，若落地姿態(tài)為側(cè)臥位或仰臥位則記錄為失?。?］。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)5次，每次保證2 min間隔時(shí)間，最后記錄5次實(shí)驗(yàn)的成功率。

頭偏斜實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估前庭的靜態(tài)平衡：按照空中翻正反射實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行，在大鼠落地后30 s，于其正上方照相記錄姿態(tài)，設(shè)立并測(cè)量夾角a°（為鼻尖至肩胛正中連線與第十胸椎正中至肩胛正中連線的角度），頭偏斜度數(shù)=|180°-a°|［10］。重復(fù)測(cè)量5次取平均值。

1.5ELISA法檢測(cè)血清GSH、MDA、ROS的表達(dá)

大鼠腹腔注射麻醉后，抽取腹主動(dòng)脈血3 mL，4℃環(huán)境下3 000 r/min離心20 min，分離血清。按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組大鼠血清GSH、MDA、ROS表達(dá)水平。

1.6Western blot法檢測(cè)前庭內(nèi)側(cè)核PI3K、AKT1的表達(dá)

大鼠處死后腦組織置平顱位，于前囟后約1 cm橫切（小腦絨球前方），取小腦部分，置于冰水中，在解剖顯微鏡取新鮮前庭內(nèi)側(cè)核（50～100 mg），置于-80℃冰箱內(nèi)保存待后期檢測(cè)用。取-80℃保存的前庭內(nèi)側(cè)核組織，剪碎、勻漿，裂解30 min。4℃環(huán)境下12 000 r/min離心5 min，取上清液，進(jìn)行蛋白定量，上樣行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，加入100 g/L脫脂奶粉后室溫封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，洗滌，加入二抗室溫孵育1 h，洗滌，化學(xué)發(fā)光法顯色，成像掃描分析系統(tǒng)保存圖像。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用±s表示，數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)性檢驗(yàn)，當(dāng)方差齊時(shí)多組間比較采用單因素方差分析，兩組間進(jìn)一步比較采用LSD-t檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)采用Welch法，兩組間進(jìn)一步比較采用Tamhane′s T2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組前庭功能評(píng)估結(jié)果比較

三組空中翻正反射實(shí)驗(yàn)成功率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。三組頭偏斜角度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中模型組、中藥組的頭偏斜角度大于空白組（P＜0.05），中藥組的頭偏斜角度小于模型組（P＜0.05），見表1。

2.2各組血清GSH、MDA、ROS表達(dá)水平比較

各組血清GSH、MDA、ROS表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白組比較，模型組血清GSH表達(dá)水平降低（P＜0.05），MDA、ROS的表達(dá)水平增高（P＜0.05）。與模型組比較，中藥組血清GSH表達(dá)水平增高（P＜0.05），MDA、ROS的表達(dá)水平降低（P＜0.05），見表2。

2.3各組前庭內(nèi)側(cè)核PI3K、AKT1表達(dá)水平比較

各組前庭內(nèi)側(cè)核PI3K、AKT1表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白組比較，模型組前庭內(nèi)側(cè)核中PI3K、AKT1表達(dá)水平降低（P＜0.05），中藥組前庭內(nèi)側(cè)核中PI3K表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，中藥組前庭內(nèi)側(cè)核中PI3K、AKT1表達(dá)水平增高（P＜0.05），見表3、圖1。

3討論

氧化應(yīng)激與各種年齡相關(guān)的疾病有關(guān)，其中就包括與年齡相關(guān)的前庭功能喪失［11］。前庭解剖系統(tǒng)器質(zhì)性生理退化的改變，如耳石顆粒形態(tài)改變、毛細(xì)胞數(shù)量減少、前庭神經(jīng)核退行性改變等［12］。這可能是導(dǎo)致老年人群前庭癥狀明顯增多的原因。前庭神經(jīng)核位于延髓嘴側(cè)和橋腦尾側(cè)的背外側(cè)部，主要分為內(nèi)、外、上、下四部分。其中，前庭內(nèi)側(cè)核的嘴側(cè)部分接收來(lái)自半規(guī)管的傳入，并投射至第三、四、六顱神經(jīng)核，從而介導(dǎo)前庭眼反射，尾側(cè)部分與頸脊髓相互連接，可能介導(dǎo)前庭丘反射，并與小腦相連。前庭內(nèi)側(cè)核在前庭代償中發(fā)揮重要作用，在與年齡相關(guān)的退行性改變發(fā)生時(shí)，輕微的前庭病變就會(huì)打破前庭平衡的狀態(tài)，導(dǎo)致PVP的發(fā)生［13］。因此本研究將前庭內(nèi)側(cè)核作為研究部位。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為老年眩暈，病位多責(zé)之于肝、脾、腎三臟，常由風(fēng)、火、痰、虛、瘀兼夾致眩［14］。益腎活血通竅法根據(jù)中醫(yī)腎開竅于耳、心寄竅于耳、耳為宗脈所聚、頭為清竅之理論立方。以杞菊地黃湯作為基礎(chǔ)方，丹參起到“一味丹參飲，功同四物湯”的作用，桃仁、紅花用于活血祛瘀，石菖蒲通竅，炙甘草調(diào)和諸藥，諸藥共奏益腎活血通竅之功［5］。

D-半乳糖可致全身各系統(tǒng)發(fā)生氧化應(yīng)激和線粒體損傷，模擬自然衰老大鼠所發(fā)生的改變，是成熟的用于誘導(dǎo)動(dòng)物老化模型的藥物［15］。本研究通過(guò)大鼠老化模型探討益腎活血通竅法的作用機(jī)制，結(jié)果表明益腎活血通竅法對(duì)老化大鼠模型前庭內(nèi)側(cè)核具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)，具體表現(xiàn)為上調(diào)PI3K、AKT1。機(jī)體對(duì)衰老的調(diào)節(jié)與PI3K/AKT信號(hào)通路密切相關(guān)［16］。本研究結(jié)果還表明，益腎活血通竅法對(duì)老化大鼠模型前庭內(nèi)側(cè)核具有保護(hù)作用機(jī)制可能與調(diào)控氧化應(yīng)激水平相關(guān)，具體表現(xiàn)為下調(diào)MDA、ROS表達(dá)水平，上調(diào)GSH表達(dá)水平。MDA可反映抗氧化能力及過(guò)氧化損傷程度。生理狀況下，機(jī)體存在維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的ROS清除系統(tǒng)。病理狀態(tài)下，ROS的生成與清除關(guān)系失衡導(dǎo)致自由基的蓄積。GSH可以催化還原H2O2和其他過(guò)氧化物，防止內(nèi)皮細(xì)胞受到活性自由基的損害［17］。

綜上所述，PI3K/AKT信號(hào)通路和氧化應(yīng)激在PVP的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色，作用于PI3K/AKT信號(hào)通路和氧化應(yīng)激的藥物有望成為治療PVP的新方案。中醫(yī)中藥治療PVP臨床效果較好，可提高患者生存質(zhì)量。我國(guó)具有豐富的中藥資源，中藥中含有多種活性成分對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路和氧化應(yīng)激具有調(diào)節(jié)作用，故擁有巨大的開發(fā)價(jià)值。但是此方向的研究起步晚，積累少，因此進(jìn)一步發(fā)掘相關(guān)的中藥及其提取物用于治療PVP意義重大。

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（2023-10-18收稿）