柵藻多糖的復(fù)合酶法提取工藝、化學(xué)組成及其抗氧化活性研究

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.07.027

引文格式：劉浩文，王川林，李佳瑩，等.柵藻多糖的復(fù)合酶法提取工藝、化學(xué)組成及其抗氧化活性研究.中國(guó)調(diào)味品，2024，49（7）：176-183.

LIU H W， WANG C L， LI J Y， et al.Study on extraction process of complex enzyme method， chemical composition and antioxidant activity of polysaccharide from Tetranephris brasiliensis.China Condiment，2024，49（7）：176-183.

摘要：以柵藻粉為研究對(duì)象，研究柵藻多糖（TBP）的復(fù)合酶法提取工藝、化學(xué)組成及抗氧化活性。采用復(fù)合酶法提取TBP，考察酶解pH、復(fù)合酶（纖維素酶和木瓜蛋白酶按1∶1復(fù)配）添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)TBP提取率的影響，并通過響應(yīng)面模型優(yōu)化TBP的提取工藝。對(duì)TBP的化學(xué)成分含量、單糖組成、官能團(tuán)結(jié)構(gòu)和體外抗氧化活性進(jìn)行了分析研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TBP的復(fù)合酶法最佳提取工藝參數(shù)為酶解pH 6.1、復(fù)合酶添加量5.35%、酶解溫度53.1 ℃和酶解時(shí)間84.2 min，在最佳提取條件下，TBP提取率可達(dá)（8.86±0.13）%；經(jīng)化學(xué)組成分析，發(fā)現(xiàn)TBP的總糖含量為（57.59±1.06）%、蛋白質(zhì)含量為（5.14±0.88）%、糖醛酸含量為（3.16±0.42）%，TBP具備典型的糖類化合物特征峰，含有吡喃糖和硫酸基團(tuán)，其單糖共計(jì)10種類型，主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖組成；對(duì)TBP的抗氧化活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)TBP對(duì)ABTS自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基具有較好的清除能力。該研究可對(duì)柵藻多糖的提取及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供相應(yīng)參考。

關(guān)鍵詞：柵藻多糖；復(fù)合酶法；工藝優(yōu)化；抗氧化

中圖分類號(hào)：TS201.2""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""""" 文章編號(hào)：1000-9973（2024）07-0176-08

Study on Extraction Process of Complex Enzyme Method， Chemical Composition

and Antioxidant Activity of Polysaccharide from Tetranephris brasiliensis

LIU Hao-wen， WANG Chuan-lin， LI Jia-ying， LIU Ping-huai*

（School of Chemistry and Chemical Engineering， Hainan University， Haikou 570228， China）

Abstract： With Tetranephris brasiliensis powder as the research object， the extraction process of complex enzyme method， chemical composition and antioxidant activity of Tetranephris brasiliensis polysaccharide （TBP） are studied. TBP is extracted by complex enzyme method. The effects of enzymatic hydrolysis pH， the addition amount of complex enzymes （the ratio of cellulase to papain of 1∶1）， enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis time on the extraction rate of TBP are investigated， and response surface model is used to optimize the extraction process of TBP. The content of chemical components， monosaccharide composition， functional group structure and in vitro antioxidant activity of TBP are analyzed and studied. The results show that the optimal extraction process parameters of TBP by complex enzyme method are enzymatic hydrolysis pH of 6.1， addition amount of complex enzymes of 5.35%， enzymatic hydrolysis temperature of 53.1 ℃ and enzymatic hydrolysis time of 84.2 min. The extraction rate of TBP can reach （8.86±0.13）% under the optimal extraction conditions. Through chemical composition analysis， it is found that the total sugar content of TBP is （57.59±1.06）%， protein content is （5.14±0.88）%， and glucuronic acid content is （3.16±0.42）%. TBP has typical characteristic peaks of carbohydrates， and it contains pyranose and sulfate groups， with a total of ten types of monosaccharides， mainly including glucose， galactose and mannose. The antioxidant activity of TBP is studied， and it is found

收稿日期：2024-03-01

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2021YFA0909604）；海南省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（ZDYF2024XDNY268）

作者簡(jiǎn)介：劉浩文（1998—），男，碩士，研究方向：微藻代謝產(chǎn)物的生物和化學(xué)特性、提取和利用。

*通信作者：劉平懷（1967—），男，教授，碩士，研究方向：微藻細(xì)胞培養(yǎng)、發(fā)酵工藝優(yōu)化與放大及其產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。

that TBP has good scavenging capacity on ABTS radicals， superoxide anion radicals and hydroxyl radicals. This study can provide references for the extraction of Tetranephris brasiliensis polysaccharide and its application in food industry.

Key words： Tetranephris brasiliensis polysaccharide; complex enzyme method; process optimization; antioxidation

微藻是存在于眾多生態(tài)系統(tǒng)中的各種真核光合自養(yǎng)單細(xì)胞微生物，生存環(huán)境包括水域、空氣和陸地。它們能夠在艱苦的條件下生存，并將捕獲的太陽(yáng)能、水和二氧化碳等無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成生物質(zhì)，其效率超過大多數(shù)陸生植物，符合國(guó)家的雙碳理念。微藻富含多種生物活性分子，在化妝品、食品和動(dòng)物飼料等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

柵藻屬綠藻門綠球藻目柵藻科，個(gè)體微小，藻體呈柵狀或橢圓形，是常見的淡水藻之一，因具有易培養(yǎng)收集的特性而成為微藻生物技術(shù)研究中較常見的微藻種類。目前對(duì)微藻多糖的研究主要集中在一些優(yōu)勢(shì)微藻，如螺旋藻多糖等，而對(duì)柵藻多糖的相關(guān)報(bào)道較少。

多糖作為微藻重要的活性成分之一，其復(fù)雜且特殊的結(jié)構(gòu)不僅使其具有多種生物活性，包括抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、抗病毒、抗炎等，而且使其具備特殊的功能特性，如Mishra等報(bào)道的杜氏鹽藻多糖的乳化性高于市售表面活性劑，是潛在的多糖乳化劑；Cosenza等報(bào)道的紫球藻多糖具有高黏性，表現(xiàn)出假塑性和剪切稀釋特性，是潛在的多糖增稠劑；Roohinejad 等報(bào)道的微藻硫酸化多糖部分替代食品中的脂質(zhì)不僅可以降低脂肪的含量，而且可以提供更高的黏度、更長(zhǎng)的熔化時(shí)間和更好的感官特性。在調(diào)味品方面，Camacho等報(bào)道的鈍頂螺旋藻多糖應(yīng)用于乳制品中不僅具有增稠特性，而且可以作為益生元選擇性地促進(jìn)發(fā)酵酸奶中益生菌的生長(zhǎng)并提高其活性，提高乳制品的風(fēng)味；龐庭才等以小球藻粉為原料，提取藻多糖和藻蛋白后合并提取液，按一定比例添加蜂蜜、白糖、檸檬酸直接配制澄清型小球藻保健飲料，產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特。因此，微藻多糖在功能性食品、食品添加劑及食品調(diào)味劑中具有豐富的開發(fā)潛力。

多糖的提取技術(shù)直接影響多糖的得率，目前常見的提取方法有水熱法、超聲波輔助法、微波輔助法等，各種方法的優(yōu)勢(shì)存在差異。復(fù)合酶法是利用不同酶的單一性，多種酶復(fù)合后可高效破壞細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu)，提高細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的通透性，促進(jìn)多糖、蛋白質(zhì)等內(nèi)容物的溶解和釋放，進(jìn)而增加產(chǎn)物的提取率，提高整體效率。酶法提取條件溫和，不破壞活性成分結(jié)構(gòu)，且環(huán)境友好，任曉莉等采用復(fù)合酶法提取的槐花多糖得率為10.71%，而趙慶友等采用單一纖維素酶提取的泰山槐花多糖得率為4.93%，表明多種酶復(fù)合后可以更高效地破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，提高多糖得率。

本研究采用復(fù)合酶法提取TBP，通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，分析TBP的3種化學(xué)成分含量，并采用紅外光譜、離子色譜對(duì)TBP的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)與單糖組成展開分析，同時(shí)評(píng)估了TBP的抗氧化活性，旨在為TBP的深入開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)參考。

1" 材料與方法

1.1" 材料

柵藻藻種分離于海南省陵水河，經(jīng)過BG-11培養(yǎng)基擴(kuò)培后，收集藻液，離心后冷凍干燥得到柵藻粉。

1.2" 試劑

纖維素酶（1 000 U/g）、木瓜蛋白酶（3 000 U/g）：上海玻爾化學(xué)試劑有限公司；正丁醇、三氯甲烷、乙醇、苯酚、硫酸：西亞化學(xué)科技（山東）有限公司；間羥基聯(lián)苯、ABTS：上海安耐吉化學(xué)有限公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清蛋白：上海源葉生物科技有限公司；過硫酸鉀、硫酸亞鐵、水楊酸、Tris-HCl、鄰苯三酚：上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.3" 主要儀器和設(shè)備

CR-22GⅡ冷凍離心機(jī)" 日本日立公司；RV10 Plus旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀" 德國(guó)IKA公司；Scientz-10N真空冷凍干燥機(jī)" 寧波新芝生物科技股份有限公司；xMark全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀" 美國(guó)Bio-Rad公司；ICS5000型離子色譜儀、Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀" 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.4" 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1" 復(fù)合酶法提取工藝流程

參考王天怡等的方法并稍作修改，提取工藝流程見圖1。

1.4.2" TBP提取率

TBP提取率按公式（1）計(jì)算。

TBP提取率（%）=mM×100%。（1）

式中：m為TBP的質(zhì)量（g）；M為柵藻粉的質(zhì)量（g）。

1.4.3" 單因素實(shí)驗(yàn)

按照?qǐng)D1中的提取工藝，考察不同酶解pH（4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5）、復(fù)合酶添加量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）、酶解溫度（40，45，50，55，60，65 ℃）和酶解時(shí)間（30，60，90，120，150，180 min）對(duì)TBP提取率的影響。

1.4.4" 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)1.4.3中的實(shí)驗(yàn)最優(yōu)水平，使用Design-Expert 13軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表1。

1.4.5" TBP的化學(xué)組分測(cè)定

TBP總糖含量的測(cè)定參考DuBois等的方法；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參考徐天等的方法；糖醛酸含量的測(cè)定參考李玲的方法。

1.4.6" TBP的單糖組成分析

參考劉智鈞的實(shí)驗(yàn)方法，稱取5 mg TBP放入具塞試管內(nèi)，添加2 mL三氟乙酸（3 mmol/L），將氮?dú)獬淙刖呷嚬軆?nèi)，在110 ℃高溫下酸水解4 h。取適量TBP的酸水解液置于10 mL試管中，氮吹至干，加入5 mL超純水復(fù)溶，取150 μL復(fù)溶液，向其中加入850 μL超純水，離心后取上清液，過濾膜后，進(jìn)行離子色譜儀上樣分析。

1.4.7" TBP的紅外光譜分析

取適量溴化鉀（KBr）、5 mg TBP研磨均勻，壓片處理，進(jìn)行紅外光譜上機(jī)掃描分析（4 000～400 cm－1）。

1.4.8" TBP的體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.4.8.1" ABTS自由基清除能力

參考李知弦的實(shí)驗(yàn)方法，通過渦旋儀將配制好的K2S2O8（2.45 mmol/L）和ABTS（7 mmol/L）溶液按1∶1充分混合后作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的儲(chǔ)備液，室溫下暗處理16 h，通過無(wú)水乙醇稀釋儲(chǔ)備液的吸光度至7.0備用。分別配制濃度為0.5，1，1.5，2，3，4，5 mg/mL的TBP溶液，取100 μL TBP溶液并添加稀釋儲(chǔ)備液3 mL，在黑暗中反應(yīng)6 min，使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀對(duì)吸光度A734 nm進(jìn)行測(cè)定，陽(yáng)性對(duì)照采用抗壞血酸，ABTS自由基清除率按公式（2）計(jì)算。

ABTS自由基清除率（%）=A空白-A樣品A空白×100%。（2）

式中：A空白為超純水替代TBP溶液在734 mm處的吸光度。

1.4.8.2" 羥自由基清除能力

參考Tang等的實(shí)驗(yàn)方法，吸取1 mL FeSO4（6 mmol/L）溶液、2 mL H2O2（0.1%）溶液和1 mL TBP樣品溶液添加到10 mL試管內(nèi)，渦旋混合，在室溫下反應(yīng)25 min后添加2 mL C7H6O3（6 mmol/L）溶液，渦旋混合，在室溫下反應(yīng)30 min，通過全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀對(duì)吸光度A510 nm進(jìn)行測(cè)定，陽(yáng)性對(duì)照采用抗壞血酸，羥自由基清除率按公式（3）計(jì)算。

羥自由基清除率（%）=A空白-A樣品+A對(duì)照A空白×100%。（3）

式中：A對(duì)照為超純水替代H2O2溶液在510 nm處的吸光度。

1.4.8.3" 超氧陰離子自由基清除能力

參考唐婷的實(shí)驗(yàn)方法，配制30 mmol/L的鄰苯三酚溶液、0.05 mol/L 的Tris-HCl緩沖液。在試管中加入3 mL Tris-HCl緩沖液、0.2 mL TBP樣品溶液，在室溫條件下黑暗處理20 min，添加12 μL鄰苯三酚溶液，渦旋混合后黑暗處理5 min，隨后添加0.5 mL濃硫酸，使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀對(duì)吸光度A320 nm進(jìn)行測(cè)定，陽(yáng)性對(duì)照采用抗壞血酸，超氧陰離子自由基清除率按公式（4）計(jì)算。

超氧陰離子自由基清除率（%）=（1－A樣品-A對(duì)照A空白）×100%。（4）

式中：A對(duì)照為超純水替代鄰苯三酚溶液的TBP樣品在320 nm處的吸光度。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1" 酶解pH對(duì)TBP提取率的影響

extraction rate of TBP

環(huán)境中的酸堿度會(huì)影響酶蛋白的構(gòu)象，使酶的活性受到影響。由圖2可知，當(dāng)pH在4～6時(shí)，隨著pH的上升，復(fù)合酶活性顯著提高。酶活性較高，可以加快內(nèi)容物的釋放，當(dāng)pH為6.0時(shí)，TBP提取率達(dá)到最大值8.06%，但隨著pH繼續(xù)升高，復(fù)合酶活性逐漸降低，TBP提取率呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。

2.1.2" 復(fù)合酶添加量對(duì)TBP提取率的影響

由圖3可知，隨著體系中復(fù)合酶添加量的增加，底物柵藻粉能夠與酶更充分地反應(yīng)，釋放柵藻粉內(nèi)容物的速度也相應(yīng)提升。在復(fù)合酶添加量為5%時(shí)，酶和柵藻粉可以得到完全接觸和反應(yīng)，TBP提取率達(dá)到最大值8.43%，但隨著復(fù)合酶添加量的繼續(xù)增加，TBP提取率呈下降趨勢(shì)，推測(cè)是過高的復(fù)合酶添加量使部分多糖被降解，導(dǎo)致TBP提取率下降。

2.1.3" 酶解溫度對(duì)TBP提取率的影響

溫度對(duì)酶有雙重影響，一方面影響酶和底物的反應(yīng)速度，另一方面影響酶蛋白的構(gòu)象。由圖4可知，酶解溫度在40～55 ℃之間時(shí)，隨著酶解溫度的上升，復(fù)合酶活性逐漸增加，酶解效率大幅提高，可以有效促進(jìn)內(nèi)容物的析出，因此提高了TBP提取率，但隨著酶解溫度的進(jìn)一步上升，TBP提取率呈下降趨勢(shì)，推測(cè)是酶蛋白在高溫下變性，給酶蛋白構(gòu)象帶來(lái)一定影響，大幅降低了酶的活性和酶解效率，內(nèi)容物析出減少，使得多糖提取率相應(yīng)降低。

2.1.4" 酶解時(shí)間對(duì)TBP提取率的影響

酶解時(shí)間過短會(huì)導(dǎo)致酶和底物反應(yīng)不完全，內(nèi)容物析出較少；酶解時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致部分多糖被酶降解，影響提取率。由圖5可知，當(dāng)酶解時(shí)間為30～90 min時(shí)，酶和底物反應(yīng)的時(shí)間越來(lái)越充分，TBP提取率上升，但隨著酶解時(shí)間的繼續(xù)增加，TBP提取率呈下降趨勢(shì)，這可能是由于酶解時(shí)間過長(zhǎng)，部分多糖被酶降解成溶于水的物質(zhì)，導(dǎo)致TBP提取率降低。

2.2" 響應(yīng)面分析

2.2.1" 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

注：“*”表示差異顯著（0.01lt;Plt;0.05），“**”表示差異極顯著（Plt;0.01），“#”表示差異不顯著（Pgt;0.05）。

由表2中數(shù)據(jù)分析得到，TBP提取率（Y）的二次多項(xiàng)回歸方程為Y=8.68+0.475 8A+0.340 8B－0.187 5C+0.145 8D－0.300 0AB+0.150AC+0.147 5AD－0.162 5BC－0.450 0BD－0.040 0CD－0.605 9A2－0.398 4B2－0.425 9C2－1.31D2。

由表3可知，回歸方程模型的Plt;0.01，表明此模型極顯著，該模型失擬項(xiàng)的P=0.301 1gt;0.05，失擬項(xiàng)差異不顯著，表明模型具備可靠性，可用于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。該模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.970 1，RAdj2=0.940 2，兩者均大于0.9，表明模型的擬合度良好。因此，該模型可以很好地反映TBP提取過程中各因素和響應(yīng)值的內(nèi)在聯(lián)系。由F值可知，酶解pH對(duì)TBP提取率的影響較大，酶解時(shí)間對(duì)TBP提取率的影響較小。

2.2.2" 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖能反映不同因素的交互效果，由圖6可知，6個(gè)響應(yīng)面圖呈現(xiàn)不同的陡峭程度，表明不同單因素的交互效果呈現(xiàn)差異性，其中AB、BD的陡峭程度明顯大于CD、BC、AC，表明A（酶解pH）、B（復(fù)合酶添加量）和B（復(fù)合酶添加量）、D（酶解時(shí)間）的交互作用效果較好，對(duì)TBP提取率有較大影響，符合表3中的方差分析結(jié)果。

2.2.3" TBP提取工藝的最佳條件及其驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)構(gòu)建的響應(yīng)面模型，通過Design-Expert 13軟件獲得的最佳工藝為酶解pH 6.1、復(fù)合酶添加量5.35%、酶解溫度53.1 ℃和酶解時(shí)間84.2 min，TBP的理想提取率為（8.94±0.13）%。對(duì)這一參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，TBP提取率為（8.86±0.13）%，與理論預(yù)測(cè)值偏差較小，在誤差范圍內(nèi)，表明所得模型與結(jié)果相匹配，具備一定的可行性。

2.3" TBP的化學(xué)組成分析

2.3.1" TBP的化學(xué)成分含量分析

根據(jù)1.4.5的實(shí)驗(yàn)方法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算，TBP的總糖含量為（57.59±1.06）%，純度較低的原因可能是TBP是未經(jīng)純化的粗多糖，存在一些雜質(zhì)。蛋白質(zhì)含量為（5.14±0.88）%，蛋白質(zhì)的含量偏高，可能是由于提取工藝中沒有脫蛋白工藝。糖醛酸含量為（3.16±0.42）%，表明酶法提取的TBP可能是一種酸性多糖。

2.3.2" TBP的單糖組成分析

由圖7中a可知，16種混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰效果較好，可對(duì)比性強(qiáng)。根據(jù)圖7中b的出峰時(shí)間和峰面積可知TBP由10種單糖組成，表明柵藻多糖是一種復(fù)雜的雜多糖，這與Capek等報(bào)道的小球藻胞外多糖結(jié)果一致，主要組成包括葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、甘露糖（Man）等，并且包含微量的核糖（Rib）、阿拉伯糖（Ara）、鹽酸氨基葡萄糖（GlcN）等；各單糖的摩爾比Fuc∶Rha∶Ara∶GlcN∶Gal∶Glc∶Xyl∶Man∶Rib∶GlcA為0.05∶0.22∶0.2∶0.33∶2.24∶5.30∶0.2∶0.75∶0.85∶0.1。核糖（Rib）的存在可能是因?yàn)門BP是未經(jīng)過純化的雜多糖，含有一定量的蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)。

2.3.3" TBP的紅外光譜分析

紅外光譜法是糖類化合物常見的研究方法之一，部分特殊官能團(tuán)在多糖結(jié)構(gòu)的紅外光譜中會(huì)呈現(xiàn)特異的吸收峰。由圖8可知，在3 334 cm-1處有一個(gè)圓滑的強(qiáng)吸收峰，是OH伸縮振動(dòng)引起的，說(shuō)明TBP存在氫鍵，2 938 cm－1處的峰是TBP CH的對(duì)稱伸縮振動(dòng)導(dǎo)致的，1 653 cm-1處的峰是多糖的羰基的CO伸縮振動(dòng)導(dǎo)致的，表明TBP內(nèi)包含糖醛酸，符合2.3.1中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1 236 cm-1處的峰是SO伸縮振動(dòng)導(dǎo)致的，表明TBP中含有硫酸基團(tuán)，1 079 cm-1處的峰是COC的伸縮振動(dòng)導(dǎo)致的，說(shuō)明TBP可能有吡喃環(huán)的結(jié)構(gòu)。綜上所述，TBP具備典型的糖類化合物的特征峰，可以推斷TBP是糖類化合物，可為后續(xù)的純化多糖結(jié)構(gòu)研究提供參考。

2.4" TBP的抗氧化活性分析

2.4.1" ABTS自由基清除能力

對(duì)天然化合物進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)時(shí)，ABTS法是一種非常重要且快速的方法。由圖9可知，當(dāng)TBP處于低濃度（0.5～1 mg/mL）時(shí)，對(duì)ABTS自由基的清除能力較弱，只有10%左右，但隨著TBP濃度升高至3～5 mg/mL時(shí)，其ABTS自由基清除率出現(xiàn)了較大提升，當(dāng)TBP濃度為5 mg/mL時(shí)，清除率為（58.48±0.24）%，但遠(yuǎn)弱于同濃度VC的清除率，推測(cè)是由于TBP未經(jīng)過純化，有很多雜質(zhì)，影響其抗氧化性能。

2.4.2" 羥自由基清除能力

清除羥自由基對(duì)于細(xì)胞和機(jī)體的抗氧化防御至關(guān)重要，由圖10可知，當(dāng)TBP處于低濃度（1～2 mg/mL）時(shí)，羥自由基清除能力較弱，隨著TBP濃度的不斷提高，其羥自由基清除率表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，當(dāng)TBP濃度為5 mg/mL時(shí)，清除率為（77.14±0.38）%，和同濃度VC的清除率差距較小，表明TBP的羥自由基清除能力較好。

2.4.3" 超氧陰離子自由基清除能力

超氧陰離子自由基是生命體代謝過程中容易產(chǎn)生的一種對(duì)機(jī)體有害的自由基，與人類的衰老和身體部位的病變有著非常緊密的聯(lián)系。由圖11可知，當(dāng)TBP在低濃度（0.5～1 mg/mL）時(shí)，對(duì)超氧陰離子的清除能力在50%左右，當(dāng)TBP濃度為5 mg/mL時(shí)，超氧陰離子清除率達(dá)到（71.66±0.52）%，略低于同濃度VC的清除率，表明TBP具有良好的超氧陰離子自由基清除能力。

3" 結(jié)論

本研究采用復(fù)合酶法提取TBP，并對(duì)TBP的化學(xué)組成及抗氧化活性進(jìn)行研究，主要結(jié)論如下：

通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)，確定了TBP復(fù)合酶法提取的最優(yōu)工藝條件為酶解pH 6.1、復(fù)合酶添加量5.35%、酶解溫度53.1 ℃和酶解時(shí)間84.2 min，在最佳條件下，TBP提取率為（8.86±0.13）%。

TBP化學(xué)組成分析顯示，TBP中總糖含量為（57.59±1.06）%，蛋白質(zhì)含量為（5.14±0.88）%，糖醛酸含量為（3.16±0.42）%，其具備典型的糖類化合物特征峰，含有吡喃糖和硫酸基團(tuán)，是一種酸性多糖，其單糖主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖組成，是一種復(fù)雜的雜多糖。

對(duì)TBP進(jìn)行體外抗氧化活性分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，TBP在高濃度下的抗氧化效果表現(xiàn)良好，同時(shí)表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。

本研究結(jié)果可為柵藻多糖在功能性食品、食品添加劑及食品調(diào)味劑的深入開發(fā)和利用中的應(yīng)用提供參考。

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