龍麥系列部分品種（系）Wx-B1b基因檢測與淀粉特性分析

摘要：小麥品質改良是東北春麥區(qū)強筋小麥育種的主要目標之一，小麥籽粒淀粉特性是決定面條品質的重要因素。淀粉特性與直鏈淀粉含量密切相關，Wx-B1b基因為控制小麥直鏈淀粉含量的主效基因。為明確該基因在龍麥系列品種（系）中的分布情況，從而為面包面條兼用型強筋小麥育種和品質改良提供有用信息，利用Wx-B1b基因特異性分子標記檢測了153份小麥品種（系），并對該基因在東北春麥區(qū)強筋小麥遺傳背景下淀粉特性的影響進行分析。結果表明，該特異性標記能準確鑒定Wx-B1b基因，在檢測的153份材料中，82份材料含有Wx-B1b基因，占比為53.6%；黏度儀的峰值黏度在Wx-B1b和Wx-B1a基因型間差異達到顯著水平（Plt;0.05），為淀粉特性改良的主效基因。因此在東北春麥區(qū)為進一步提高面包面條兼用型強筋小麥新品種選育效率，在親本組配、后代選擇及穩(wěn)定品系處理中應加強Wx-B1b基因的應用和選擇。

關鍵詞：小麥；育種；龍麥系列；穩(wěn)定品系；Wx-B1b基因

中國是全球最大的小麥生產國和消費國，2022年我國小麥面粉產量為8 891.67萬 t，其中，傳統(tǒng)面制品占面粉消費量的80%左右（面條類占35%、饅頭類占30%、水餃類占9%、餅類占6%）；烘焙類面制品占比15%左右（面包類占比7%、餅干蛋糕類8%）；工業(yè)用粉（淀粉、谷朊粉用粉）占5%左右[1]。面條現為我國傳統(tǒng)面制品消費量最大的品類，加強小麥的面條品質育種符合我國面制品消費國情，對于促進面制品加工業(yè)高質量發(fā)展具有重要意義。

東北春麥區(qū)為我國強筋小麥優(yōu)勢產業(yè)帶之一[2]，寒地黑土，一年一季，同我國各大麥區(qū)相比該區(qū)小麥生產的病、蟲害發(fā)生少，化肥和農藥投入量低，無重金屬污染等不利因素[3-5]，具有發(fā)展綠色強筋“硬紅春”面包麥生產的各種比較優(yōu)勢，為我國優(yōu)質強筋和超強筋小麥的重要生產基地[2，6]。在強筋面包麥小麥育種基礎上，進一步加強小麥品種面條品質改良，有利于拓寬該區(qū)小麥原糧二次加工品質適用范圍，實現小麥生產提質增效，對于推動該區(qū)小麥產業(yè)發(fā)展意義重大。

小麥籽粒淀粉特性是決定面條品質的重要因素[7-8]。淀粉分為直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種類型，占比分別為22%～35%和65%～78%[9-10]。其中，淀粉特性與直鏈/支鏈淀粉比值密切相關[11-12]。降低直鏈/支鏈淀粉比值有利于改善面條軟度、黏性、光滑性、口感和綜合評分[13-14]。直鏈淀粉含量低是澳大利亞、日本等國衡量面條小麥品質的重要指標[15-16]。

直鏈淀粉主要由顆粒結合型淀粉合酶（Granule-bound starch synthase，GBSS）合成，GBSS又稱為Waxy蛋白（Wx protein）[17]。普通小麥含有3種Wx蛋白亞基，

Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1，分別由位于7AS、4AL和7DS的Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1基因編碼[18]。其中任何一個Wx基因的缺失都會影響直鏈淀粉合成，使直鏈淀粉含量降低、支鏈淀粉含量增加，導致直鏈/支鏈淀粉比值降低[19-20]。大量研究表明，降低直鏈/支鏈淀粉比值能顯著改善小麥加工品質[13-14，21]。3個位點對直鏈淀粉含量的影響效應表現為Wx-B1缺失型gt;Wx-D1缺失型gt;Wx-A1缺失型[22]。在強筋小麥育種進程中，加強Wx-B1缺失型基因（即Wx-B1b）選擇，對于拓寬強筋小麥二次加工用途具有重要意義[11-12]。

為明確Wx-B1b基因在東北春麥區(qū)龍麥系列品種及穩(wěn)定品系的分布情況，本研究利用該基因特異性分子標記對153份龍麥系列部分小麥品種及優(yōu)異穩(wěn)定品系（系）進行檢測，并對其在淀粉特性改良的遺傳效應進行分析，以期為面包面條兼用型強筋小麥育種提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 材料

153份供試材料為黑龍江省農業(yè)科學院作物資源研究所小麥研究室育成的部分品種，以及2018-2020年獲得的優(yōu)異穩(wěn)定品系。陽性對照品種龍麥26[11]，陰性對照品種龍麥30。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和目的基因檢測

采用CTAB法提取小麥籽?；蚪MDNA。利用紫外分光光度計檢測DNA濃度，稀釋至終濃度100 mg·L-1。

1.2.2 引物序列的合成

根據Saito等[23]方法合成Wx-B1b基因檢測的特異性標記引物，序列為5’-CGTAGTAAGGTGCAAAAAAGTGCCACG-3’ 和5’-ACAGCCTTATTGTACCAAGACCCATGTGTG-3’，由上海生工有限公司合成。

1.2.3 PCR反應的體系及程序

模板DNA 50 ng，Taq酶1 U（寶生物工程（大連）有限公司），上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.6 μL，dNTP（2.5 μmol·L-1）0.8 μL，10×buffer（Mg2+ plus）2.5 μL，用無菌蒸餾水補充反應體系至20 μL。

PCR反應程序：首先94 ℃ 5 min；然后94 ℃ 變性35 s，退火溫度60 ℃ 50 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察照相。

1.2.4 淀粉特性分析

利用德國Brabender生產的Visco-E型快速黏度分析儀（Rapid Viscosity Analyser，RVA），對2019-2021年對照品種龍麥26和龍麥30，以及2019-2022年部分品系淀粉的糊化特性進行分析。測定方法參照GB/T 24853-2010標準[24]。

1.2.5 數據分析

利用SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析。進行分析的對照品種龍麥26和龍麥30為2019-2021年RVA數據。部分品系間RVA數據（2019-2021年）差異顯著性分析以Wx-B1b基因檢測結果進行分組。

2 結果與分析

2.1 龍麥系列品種（系）Wx-B1b基因的分子標記檢測

由圖1可知，Wx-B1b基因特異性標記在陰性對照品種龍麥30中無PCR擴增產物，在陽性對照品種龍麥26中擴增出668 bp片段，而且擴增條帶清晰、重復性好。以上結果表明，Wx-B1b基因特異性標記能夠準確鑒定Wx-B1蛋白缺失型，可作為控制直鏈淀粉含量的Wx-B1b基因的分子標記輔助育種可靠標記。

2.2 龍麥系列品種（系）Wx-B1b基因的分布

在檢測的153個小麥品種（系）中（表1），有82份材料攜帶Wx-B1b基因，占比為53.6%。以上結果表明，該基因在小麥育種過程中得到應用，但是所占比例相對較低，仍是開展面條面包強筋小麥育種的限制因子。

2.3 Wx-B1b基因效應分析

2019-2022年對龍麥系列部分優(yōu)異穩(wěn)定品系進行黏度儀分析，峰值黏度為2年或3年測試的平均結果（表2）。

由表3可知，對照品種龍麥26和龍麥30 2019-2021年的3年平均峰值黏度達到極顯著水平（Plt;0.001）。

部分品系在2019-2022年結果中，峰值黏度在Wx-B1b和Wx-B1a基因型間差異也達到顯著水平（Plt;0.05）。

以上結果表明，在東北春小麥遺傳背景下Wx-B1b對峰值黏度影響顯著。

3 討論

我國為面條、饅頭等蒸煮食品消費大國，其中面條類、饅頭類分別位列第一和第二[1，25]。研究表明，蒸煮品質與面粉淀粉特性相關密切，降低直鏈/支鏈淀粉比值使蒸煮品質得到顯著改善[7，21]。強筋小麥育種進程中，在改進籽粒蛋白質質量，提高蛋白質含量的基礎上，進一步加強淀粉特性的改良，能夠顯著拓寬強筋小麥二次加工用途，使其更適合我國小麥消費特點。東北春麥區(qū)是中國強筋小麥重要生產基地之一，具有強筋小麥生產的各種比較優(yōu)勢[2]。加強該區(qū)面包面條兼用型強筋小麥育種，對于東北春麥區(qū)“硬紅春”小麥品牌建設意義重大。

Wx-B1b基因為控制小麥直鏈淀粉含量的主效基因。育種過程中對Wx-B1b基因的準確鑒定為利用該基因發(fā)揮其品質改良作用的關鍵。本研究中選用的特異性分子標記能夠準確鑒定Wx-B1b基因，可靠性高，實用性好，適合在育種中應用。

峰值黏度為RVA參數衡量淀粉特性的最終重要指標。峰值黏度越大，制作面條品質越好[7-8]。本研究中，Wx-B1b基因在對照品種和部分穩(wěn)定的優(yōu)異品系中對峰值黏度影響顯著，表明在東北春麥區(qū)強筋小麥遺傳背景下，Wx-B1b基因對峰值黏度參數影響顯著，可以將Wx-B1b基因作為東北春麥區(qū)面條小麥改良的主效基因。

黑龍江省農業(yè)科學院龍麥課題組多年來以高分子量麥谷蛋白亞基5+10作為面筋質量改良的主效基因，實現強筋小麥育種品質性狀的突破，選育和推廣了龍麥26、龍麥33和龍麥35等系列強筋小麥新品種。其中，龍麥26在2004年獲得國家科技進步二等獎；龍麥33在2012-2017年連續(xù)6年被農業(yè)農村部確定為東北春麥區(qū)小麥生產主導品種，累計推廣面積100萬hm2以上[26-27]；龍麥35現已成為東北春麥區(qū)第一主栽品種，年種植面積100萬hm2以上，2022年被農業(yè)農村部確定為春小麥生產唯一主導品種。同時經課題組多年試驗檢測鑒定，發(fā)現在龍麥系列品種和優(yōu)異品系中，攜帶優(yōu)質亞基5+10的頻率可達95%以上，在育種進程中該亞基已成為后代選擇的非限制性因子。以上育種實踐表明，以5+10亞基為主效基因，“龍麥”號小麥實現以面筋質量改良為突破口的面包麥育種，并取得了顯著成效。為了在面包麥育種基礎上進一步開展面包面條麥育種，淀粉特性的改良至關重要，在育種進程中加強Wx-B1b基因應用和選擇勢在必行。本研究結果表明在龍麥系列部分品種和優(yōu)異穩(wěn)定品系中該基因得到應用，但是分布比例偏低，尚未達到5+10亞基比例水平。在組合配制中應注重該基因的應用，后代選擇過程中仍需加強選擇壓力，實現如5+10亞基應用水平，發(fā)揮Wx-B1b基因在東北春麥區(qū)強筋小麥淀粉特性的改良。

4 結論

Wx-B1b基因東北春麥區(qū)強筋小麥遺傳背景下，對淀粉特性影響顯著，可以將其作為東北春麥區(qū)強筋小麥面條改良的主效基因。但是，在153份東北春麥區(qū)小麥品種（系）中，攜帶Wx-B1b基因品種（系）有82個，占53.6%。因此應在未來小麥育種進程中加強Wx-B1b基因應用和選擇力度，發(fā)揮Wx-B1b基因在強筋小麥改良中的作用。

參考文獻：

［1］ 國家小麥產業(yè)技術體系產業(yè)經濟研究室.小麥產業(yè)研究報告[R/OL].（2023-08-16）[2023-11-01].https：//wenku.so.com/d/5865d756b0e6beccf12e43fc92348c28.

[2] 宋維富，楊雪峰，趙麗娟，等.東北春麥區(qū)強筋小麥育種進展及產業(yè)發(fā)展分析[J].麥類作物學報，2022，42（2）：171-177.

[3] 王朝輝，佘文婷，黨海燕，等.國家小麥產業(yè)技術體系2023年全國主要麥區(qū)營養(yǎng)小麥品質和衛(wèi)生安全狀況調研：農戶土壤測試評價與小麥施肥建議[R].2023.

[4] 王朝輝，佘文婷，孫蕊卿.國家小麥產業(yè)技術體系2023年全國主要麥區(qū)營養(yǎng)品質和衛(wèi)生安全狀況調研[R].2023.

[5] 王朝輝，羅一諾，李艷霏，等.國家小麥產業(yè)技術體系國家小麥良種聯(lián)合攻關廣適性品種試驗2023年全國小麥關鍵養(yǎng)分測試工作報告[R].2023.

[6] 趙麗娟，宋維富，車京玉，等.2008—2018年東北春麥區(qū)小麥生產與育種概況[J].黑龍江農業(yè)科學，2019（5）：146-151.

[7] 陳東升，KIRIBUCHI-OTOBE C，徐兆華，等.Waxy蛋白缺失對小麥淀粉特性和中國鮮面條品質的影響[J].中國農業(yè)科學，2005，38（5）：865-873.

[8] 宋健民，劉愛峰，李豪圣，等.小麥籽粒淀粉理化特性與面條品質關系研究[J].中國農業(yè)科學，2008，41（1）：272-279.

[9] GUO G， JACKSON D S， GRAYBOSCH R A， et al. Asian salted noodle quality： impact of amylose content adjustments using waxy wheat flour[J]. Cereal Chemistry， 2003， 80（4）： 437-445.

[10] BOGGINI G， CATTANEO M， PAGANONI C， et al. Genetic variation for waxy proteins and starch properties in Italian wheat germplasm[J]. Euphytica， 2001， 119（1）： 113-116.

[11] 楊雪峰，宋維富，劉東軍，等.Glu-D1d與Wx-B1b基因聚合在強筋小麥育種中的利用[J].麥類作物學報，2023，43（5）：545-550.

[12] 楊雪峰，宋維富，劉東軍，等.面包面條兼用型強筋小麥主要品質性狀分析與評價[J].麥類作物學報，2023，43（6）：738-743.

[13] MORRIS C F， SHACKLEY B J， KING G E， et al. Genotypic and environmental variation for flour swelling volume in wheat[J]. Cereal Chemistry， 1997， 74（1）： 16-21.

[14] ZHAO X C， SHARP P J. An improved 1-D SDS-PAGE method for the identification of three bread wheat 《Waxy》proteins[J]. Journal of Cereal Science， 1996， 23（2）： 191-193.

[15] ODA M， YASUDA Y， OKAZAKI S， et al. A method of testing flour quality assessment for Japanese noodles[J]， Cereal Chemistry， 1980，57： 253-254.

[16] TOYOKAWA H， RUBENTHALER G L， POWERS J R， et al. Japanese noodle qualities. II. Starch components[J].Cereal Chemistry， 1989， 66（5）： 387-391.

[17] GRAYBOSCH R A， PETERSON C J， HANSEN L E， et al. Identification and characterization of U.S. wheats carrying 1 alleles at the wx loci[J]. Cereal Chemistry， 1998， 75（1）： 162-165.

[18] BETTGE A D， GIROUX M J， MORRIS C F. Susceptibility of waxy starch granules to mechanical damage[J]. Cereal Chemistry， 2000， 77（6）： 750-753.

[19] YAMAMORI M， ENDO T R. Variation of starch granule proteins and chromosome mapping of their coding genes in common wheat[J]. Theoretical and Applied Genetics，1996，93（1-2）：275-281.

[20] GRAYBOSCH R A. Waxy wheats： origin， properties， and prospects[J]. Trends of Food Science and Technology， 1998， 9： 135-142.

[21] 楊學舉.小麥蛋白成分和淀粉特性對面包品質的影響及品質改良應用[D].北京：中國農業(yè)大學，2004.

[22] MIURA H， SUGAWARA A. Dosage effects of the three Wx genes on amylose synthesis in wheat endosperm[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1996， 93（7）： 1066-1070.

[23] SAITO M， VRINTEN P， ISHIKAWA G， et al. A novel codominant marker for selection of the 1 Wx-B1 allele in wheat breeding programs[J]. Molecular Breeding， 2009， 23（2）： 209-217.

[24] 國家市場督檢管理總局，中國國家標準化管理委員會.小麥、黑麥及其粉類和淀粉糊化特性測定快速粘度儀法：GB/T 24853-2010[S].北京：中國標準出版社，2011.

[25] 宋維富，楊雪峰，宋慶杰，等.強筋小麥主要品質內涵與二次加工品質關系[J].黑龍江農業(yè)科學，2017（1）：150-154.

[26] 宋慶杰，肖志敏，辛文利，等.高產優(yōu)質強筋小麥新品種龍麥33的選育及栽培技術[J].黑龍江農業(yè)科學，2011（3）：140-141.

[27] LI H J， ZHOU Y， XIN W L， et al. Wheat breeding in Northern China： achievements and technical advances[J]. The Crop Journal， 2019， 7（6）： 718-729.

Molecular Detection of Wx-B1b Gene and Analysis of Starch Characteristics in Some Varieties （Lines） of Longmai Series

Abstract：Wheat quality improvement is one of the great challenges of strong-gluten wheat breeding in the Northeast Spring Wheat Zone. The starch characteristics of wheat grains are important factors determining noodle quality. The starch characteristics are closely related to the content of amylose in wheat. The Wx-B1b gene is the major gene controlling the content of amylose in wheat. In order to clarify the distribution of this gene in the Longmai series varieties （lines） and provide useful information for quality improvement in bread and noodle type strong gluten wheat breeding， 153 wheat varieties （lines） were detected by Wx-B1b gene specific molecular markers in this study. And the influence of this gene on starch characteristics in the genetic background of strong gluten wheat in the northeast spring wheat region were analyzed. The results showed that this specific marker can accurately identify the Wx-B1b gene. Among the 153 materials detected， 82 materials contained the Wx-B1b gene， accounting for 53.6%. The peak viscosity of the viscometer showed a significant difference （Plt;0.05） between the Wx-B1b and Wx-B1a genotypes， indicating that it was the main gene for improving starch properties. Therefore， in the spring wheat region of Northeast China， in order to further improve the breeding efficiency of bread and noodle type strong gluten wheat， Wx-B1b gene should be used and selected in parent pairing， off spring selection， and stable strain treatment.

Keywords：wheat; breeding; Longmai series; stable strain; Wx-B1b gene