雙層納米孔的制造與應用

摘要" 由于具有孔徑可調(diào)節(jié)、物理化學性質(zhì)穩(wěn)定、極端環(huán)境適應性強、集成度高等優(yōu)點，固態(tài)納米孔逐漸成為最具潛力的單分子測序工具。在固態(tài)納米孔發(fā)展過程中，提高其單分子檢測精度一直是研究人員關注的重點。近年來，雙層納米孔受到了廣泛關注。與傳統(tǒng)的單層納米孔相比，雙層納米孔具有的孔-腔-孔結構提供了2個分子識別位點和納米受限空間。雙孔提供的2個分子識別位點可以在單次過孔事件中獲得2次目標信號，所獲得的雙重檢測信號不僅豐富了檢測信息，也為信號分析提供了最為直接的對比信息源。此外，雙層孔中的空腔還可作為單分子化學反應器。因此，雙層納米孔的出現(xiàn)拓寬了納米孔傳感器的應用范圍，在單分子檢測方面具有廣闊的應用前景。本文概述了納米孔的發(fā)展歷程，并重點介紹了雙層納米孔的制造方法及其在單分子檢測領域的應用。

關鍵詞" 固態(tài)納米孔；雙層納米孔；雙重檢測信號；制造方法

納米孔檢測的應用最早可以追溯到19世紀50年代庫爾特計數(shù)器的發(fā)明[1]。如圖1所示，充滿電解質(zhì)溶液的液池被納米孔薄膜分隔成2個獨立的腔室，電壓施加在兩端腔室上，此時溶液中離子運動形成穩(wěn)定電流I0。向溶液一側(cè)加入被測分子后，被測分子將在電場力的作用下從一端腔室經(jīng)過納米孔運動到另一端腔室。被測分子在孔內(nèi)的物理占位使離子發(fā)生擾動，從而產(chǎn)生電流變化?I。通過分析電流變化的幅值、持續(xù)時間、頻率等，可以獲取被測分子的大小、濃度、電荷和構象等信息。

KASIANOWICZ等[2]首次使用α-溶血素生物納米孔成功檢測到單鏈脫氧核糖核酸（ssDNA）易位產(chǎn)生的離子電流信號，由此拉開了納米孔單分子檢測的序幕。自此，納米孔憑借其免標記、長讀長、實時檢測等優(yōu)點，在核酸和蛋白質(zhì)測序、生物分子檢測和納米顆粒表征等方面得到了廣泛應用，并成為最具有發(fā)展前景的單分子傳感器之一。

根據(jù)材料的不同，納米孔主要分為生物納米孔和固態(tài)納米孔[3]。生物納米孔是由特定的氨基酸序列自組裝形成的天然通道蛋白，通常需要將其嵌入脂質(zhì)雙分子層或合成膜中構成生物納米孔傳感器。最具代表性的生物納米孔有α-溶血素[4]、MspA[5]、phi29[6]等，這些納米孔已廣泛用于單分子檢測。由于具有孔徑定義明確、信號再現(xiàn)性強、噪聲水平低等優(yōu)點，生物納米孔目前已在核酸測序方面得到了成功應用[7-8]，且隨著納米孔化學、堿基調(diào)用算法和數(shù)據(jù)校正算法的更新，其讀數(shù)準確性已經(jīng)從低于60%提高到99%以上[9]，具有臨床應用前景，如監(jiān)測傳染病疫情、表征癌癥的結構變體等[10-12]。生物納米孔檢測為防范病毒感染，保障人類生命健康提供了可靠的檢測手段。然而，使用壽命短、極端環(huán)境耐受性差等缺點限制了生物納米孔的進一步應用。

與生物納米孔相比，固態(tài)納米孔具有孔徑可調(diào)節(jié)、物理化學性質(zhì)穩(wěn)定、極端環(huán)境適應性強、集成度高等優(yōu)點，因而備受關注。LI等[13]首次使用Ar+離子束在單層懸浮氮化硅薄膜上制備了單個納米孔，并將其成功用于DNA檢測。隨后，基于透射電子顯微鏡的高能電子束固態(tài)納米孔原位制造與表征技術出現(xiàn)[14]，固態(tài)納米孔開始得到廣泛研究。然而，較低的單分子檢測精度制約了固態(tài)納米孔在單分子檢測方面的應用。得益于微納加工技術的發(fā)展，鎵/氦離子聚焦離子束[15-16]、電擊穿[17]等納米孔制造技術逐步發(fā)展，從而將納米孔的孔徑控制在與單分子尺寸相當?shù)姆秶鷥?nèi)。材料科學的發(fā)展也促使制造固態(tài)納米孔的材料從氮化硅[18-20]、二氧化硅[14]、二氧化鉿[21]等半導體材料拓展到石墨烯、二硫化鉬、二硫化鎢等二維材料。這些二維材料的厚度與DNA相鄰堿基的間距相當，大大提高了納米孔對單堿基的空間分辨率[22-23]。

除了從納米孔的孔徑和厚度等方面提高檢測精度，光鑷、磁鑷、音叉和AFM探針等工具也被用于控制單分子經(jīng)過納米孔的易位速度，并通過操縱單分子在納米孔內(nèi)往復運動來實現(xiàn)電流信號的多次讀取，從而提高檢測精度[24]。得益于固態(tài)納米孔與半導體工藝的高度兼容性，人們開發(fā)出納米孔-隧穿結[25-26]、納米孔-場效應管[27-28]、等離子體納米孔[29]等集成結構，這些結構在傳統(tǒng)離子電流檢測模式的基礎上增加了隧穿電流、橫向電流、光譜等檢測模式，因此可以通過組合多種模式來提高納米孔的檢測精度。

提高檢測精度的另一種方法是制造具有多個串聯(lián)納米孔的納米流體結構。近年來，雙層納米孔受到了研究人員的廣泛關注。與傳統(tǒng)的單層納米孔相比，雙層納米孔具有的孔-腔-孔結構提供了2個分子識別位點和納米受限空間。雙孔提供的2個分子識別位點可以在單次過孔事件中獲得2次目標信號。通過分析2次目標信號的時間間隔或形狀差異，可以推算分子的電泳飛行時間和Zeta電位[30]，或用于DNA動力學校對實現(xiàn)DNA測序[31]。此外，雙層孔中的空腔還可作為單分子化學反應器[32]。因此，雙層納米孔的出現(xiàn)拓寬了納米孔傳感器的應用范圍，在單分子檢測方面具有廣闊的應用前景。本文概述了納米孔的發(fā)展歷程，并從其在單分子檢測方面的應用出發(fā)，重點介紹了雙層納米孔的制造方法。

1" 雙層納米孔的制造方法

雙層納米孔的制造是基于PEDONE等[33]提出的堆疊孔-腔-孔結構（圖2）。該結構是由氮化硅納米孔、硅空腔、硅納米孔依次在垂直方向上堆疊形成的。整個結構的制造主要分為2個步驟：首先，通過光學光刻、電子束光刻與反應離子刻蝕等步驟在氮化硅層中加工第1個納米孔，即氮化硅納米孔，如圖2a所示；然后，通過反饋控制濕法化學刻蝕在硅層中加工第2個納米孔，即硅納米孔，如圖2b所示。由于硅在堿性溶液中的各向異性濕法刻蝕作用，這種方法加工出來的雙層孔的空腔形狀幾乎為錐形?？涨坏拇笮⊥ㄟ^控制刻蝕溶液的刻蝕時間來調(diào)節(jié)，而氮化硅納米孔和硅納米孔的大小則分別通過調(diào)整電子束曝光的劑量以及反饋濕法化學刻蝕中的電流閾值來控制。通過該方法獲得的孔-腔-孔結構中，氮化硅孔直徑為28 nm，硅孔邊長為23 nm × 23 nm，空腔高度為1.5 μm，如圖2c所示。該方法所制造的硅納米孔大多呈矩形。

LIU等[32]制造了一種納米孔熵籠的雙層孔結構，如圖3所示。首先，選取硅基底上的自支撐懸浮薄膜（自上而下依次為20 nm厚的氮化硅層、1.5 mm厚的二氧化硅層以及400 nm厚的氮化硅層）。然后，使用聚集離子束在400 nm厚的氮化硅層上加工出直徑為200 nm的開口。接著，利用氫氟酸溶液腐蝕中間的二氧化硅，得到1.5 mm高的圓柱形空腔。最后，利用透射電子顯微鏡的電子束在20 nm厚的氮化硅薄膜上加工10 nm的納米孔。其中，空腔的大小通過控制氫氟酸的刻蝕時間來調(diào)節(jié)，納米孔的大小則通過調(diào)整聚焦離子束和高能電子束的加工參數(shù)來控制。此方法極大地簡化了制造流程，且可控性更強。由于該方法利用了TEM原位制造技術，在納米孔制造完成后還可原位獲得高分辨TEM圖像。葉佳佳[34]討論了基于鎵離子束和氦離子束的雙層孔制造流程及其TEM無損表征方法。在雙層孔制造完成后，利用TEM的高分辨成像和能譜分析功能完整表征了雙層孔的三維結構，驗證雙層孔成功制造的同時保證了該結構的完整性。

SiO2和Si3N4薄膜在固態(tài)納米孔中的廣泛應用得益于其較高的化學穩(wěn)定性和較低的機械應力。隨著材料科學的發(fā)展，石墨烯、二硫化鉬、二硫化鎢等二維材料由于具有原子級厚度和良好的機械穩(wěn)定性也被廣泛用于固態(tài)納米孔的制造中。石墨烯納米孔與Si3N4納米孔亦可組合成雙層孔（圖4）[35]。首先，使用聚焦離子束將低應力Si3N4薄膜（初始厚度為100 nm）減薄至15 nm；然后，利用FIB在15 nm的Si3N4薄膜上加工，得到直徑為28 nm的Si3N4納米孔；接著，通過濕法轉(zhuǎn)移技術，將石墨烯薄膜轉(zhuǎn)移到上述Si3N4薄膜的頂部，將Si3N4納米孔覆蓋；最后，利用TEM在石墨烯薄膜上加工，得到4 nm的石墨烯納米孔。這種方法制造的雙層孔結構的空腔和納米孔大小均由聚焦離子束和高能電子束的加工參數(shù)來調(diào)節(jié)，具有較高的可控性。

LAM等[36]制造了納米孔陣列膜-納米孔結構，如圖5所示。這種雙層孔結構的上層為納米孔陣列膜，下層為單個納米孔。其制備過程包括3個環(huán)節(jié)：首先使用水蒸氣分層法和lift off技術，將50 nm厚的納米孔陣列膜附著在具有二氧化硅間隔層的20 nm厚的氮化硅薄膜上，其中二氧化硅間隔層內(nèi)含有直徑為4.5 μm的微孔六邊形網(wǎng)格；接著，將PDMS涂覆在氮化硅薄膜和納米過濾膜的邊界上，使2層薄膜牢固結合；最后，使用電擊穿方法，在20 nm厚的氮化硅薄膜上加工直徑為6～15 nm的納米孔。最終得到的納米孔陣列膜-納米孔結構如圖5b所示。

2" 雙層納米孔的應用

與傳統(tǒng)的單層納米孔相比，雙層納米孔的孔-腔-孔結構提供了2個獨立的分子識別位點，因此可以對同一被測分子進行2次連續(xù)的電流信號檢測。通過分析2次電流信號的時間間隔和形狀差異，可以推算被測分子的電泳飛行時間[30]，或用于DNA動力學校對[31]。目前，雙層納米孔已在核酸分子、納米顆粒的研究中得到了成功應用。孔-腔-孔結構按照排列方式及檢測原理的不同，主要可以分為堆疊孔-腔-孔和平面孔-腔-孔。

2.1" 堆疊孔-腔-孔

圖6所示為LANGECKER等[30]使用堆疊孔-腔-孔結構研究λDNA分子的電泳飛行時間的示意圖。利用空腔距離為1.5 μm的堆疊孔-腔-孔裝置來測量λDNA分子在自由溶液中的電泳遷移率。在通過實驗得到的電流軌跡線中，觀察到一系列的電流峰，這些電流峰歸因于單個分子通過孔-腔-孔結構中的1個納米孔易位。因此，每個納米孔可以獨立作為傳統(tǒng)的電阻脈沖傳感器工作。DNA分子在電場驅(qū)動下通過會依次經(jīng)過2個納米孔，因此電流峰是成對的。測量并統(tǒng)計每個電流峰對中2個電流峰的距離，可以獲得單個DNA分子的飛行時間（time-of-flight，TOF），從而可以在極低的濃度下確定DNA分子的電泳遷移率、Zeta電位，以及漂移、擴散和勢壘主導的逃逸對DNA通過PCP裝置易位的影響。隨后，孔-腔-孔結構被用于研究單個分子在受限空間下的捕獲、逃逸和擴散行為。通過調(diào)整電位極性，最終實現(xiàn)10 fL體積的空腔內(nèi)帶負電顆粒的捕獲、儲存和驅(qū)逐[37]。

堆疊孔-腔-孔結構還可以作為單分子化學反應器（納米熵籠），研究其在化學反應前后的變化[32]。納米熵籠單分子化學反應器如圖7所示。正極腔室中為含有限制性內(nèi)切酶的緩沖液，負極腔室中為含有λDNA分子但不含酶的相同緩沖液。首先施加正電壓將λDNA分子通過納米孔拉入熵籠中，此過程產(chǎn)生的電流變化稱為Ping。電流信號向上是由于DNA攜帶了大量的反離子進入納米孔，使溶液的電導率增加。隨后，將電壓調(diào)零，此時λDNA失去外力作用而停留在熵籠中（這一過程稱為Pause），并在熵籠中與限制性內(nèi)切酶反應。最后反轉(zhuǎn)電壓極性為負電壓，將DNA逐出納米孔，此時產(chǎn)生的電流變化稱為Pong。從圖7b可知，1個Ping產(chǎn)生了2個Pong，說明原本完整的λDNA分子被切割形成了2個較短的DNA片段。納米熵籠結構為研究體外模擬噬菌體耐藥機制的限制性修飾系統(tǒng)、限制性片段長度多態(tài)性的遺傳變異、實時研究DNA酶切提供了快速、免標記的方法。

雙層孔提供的校對機制有助于提高基因測序的精度。LING等[31]提出使用雙層孔結合寡核苷酸動力學原理進行DNA測序。如圖8所示，ssDNA被電壓驅(qū)動進入雙層孔結構，隨后向雙層孔的其中一端加入寡核苷酸探針，探針通過堿基配對原則與ssDNA結合。若該探針在ssDNA上是正確配對的，則DNA連續(xù)通過2個納米孔時，會由于探針的出現(xiàn)而產(chǎn)生2次電流下降。若該探針不是正確配對的，則探針會在到達第2個孔之前從ssDNA上分離。這是因為僅有幾個堿基的寡核苷酸探針具有較大的擴散常數(shù)，會很快被電壓驅(qū)逐，降低重新雜交的可能性，所以在過孔電流中只能觀察到第1次電流下降。這種方法避免了傳統(tǒng)測序方法中DNA聚合酶的使用，使測序過程簡化，同時在一定程度上縮短了測序時間，提高了檢測精度。

2.2" 平面孔-腔-孔

平面孔-腔-孔的結構類似于堆疊孔-腔-孔結構，2個獨立的納米通道提供了2個分子識別位點，因此可以獲得2次電流信號變化，從而推算被測分子的電泳遷移率或提高檢測精度，其應用如圖9所示。

HARMS等[38]利用孔-孔間距為2.5 μm的平面孔-腔-孔裝置檢測乙型肝炎病毒（HBV），獲得了一系列雙電阻脈沖事件（圖9a），通過分析雙電阻脈沖之間的距離以及單個脈沖的幅值和寬度，計算出HBV的電泳遷移率，并實現(xiàn)了T=3（32 nm）和T=4（35 nm）時2種HBV病毒的識別。孔-腔-孔納米傳感器可以與DNA/RNA外切酶相結合，實現(xiàn)高讀取精度的外切酶測序。CHOI等[39-40]利用腔體長度為5 μm的平面孔-腔-孔傳感器鑒定了4種2-脫氧核糖核苷-5'-單磷酸（dNMPs分子）（圖9b）。識別精度與通道的長度有關，最高可達94%。實驗發(fā)現(xiàn)，不同dNMPs分子過孔形成的峰值對間距（TOF）不同，因此可以判斷出dNMPs分子的種類。為了確定與相鄰峰對完全獨立的峰對，制定了峰對識別的標準：（1）2個電流峰的幅值應至少為通孔電流噪聲均方根值（I-RMS）的3倍；（2）TOF的最小值應大于單個電流峰的持續(xù)時間；（3）TOF的最大值應為dNMPs分子在納米電泳中的最小遷移率TOF計算值的1.5倍。部分未成對的峰歸因于以下2點：（1）峰缺失——同一dNMPs分子在納米孔不同位置易位導致電流峰發(fā)生改變，或是受限于電流放大器的帶寬導致無法記錄個別dNMPs分子的快速易位；（2）峰重疊——dNMPs分子的濃度過高，導致多個分子同時過孔。

3" 結論

目前，雙層孔主要由電子束光刻、濕法刻蝕、聚焦離子束、透射電子顯微鏡和電擊穿等中的2種或3種方法組合制造而成。不同的制造方法在加工效率、加工精度、加工成本和可控性等方面各有優(yōu)缺點。例如，電擊穿法加工精度高且成本低，但孔的數(shù)量和位置較難控制；電子束光刻法可控性較高，但其工藝成本昂貴；反饋控制濕法化學刻蝕成本較低但可控性較低；聚焦離子束和透射電子顯微鏡的電子束具有加工精度高、可控性高的優(yōu)點，但成本較高。其中，聚焦離子束相對透射電子顯微鏡的加工效率更高。在實際加工過程中，應根據(jù)實際合理選擇制造方法，提高雙層孔尺寸和幾何形狀的可控性，使其與分析物的大小相匹配，獲得良好的信號再現(xiàn)性和最佳的檢測信噪比。在檢測方面，雙層孔目前已用于研究分子的電泳飛行時間、分子在受限空間中的行為、單分子化學反應以及提高納米孔的檢測精度。

隨著微納加工技術、材料科學和算法工具的快速發(fā)展，未來將有望開發(fā)更多識別位點的納米串聯(lián)多孔結構，從而在原始數(shù)據(jù)獲取和后期數(shù)據(jù)分析過程中提高納米孔的讀數(shù)準確性，獲得高質(zhì)量的檢測信號，實現(xiàn)真正簡單、快速、便攜、可靠、精準的納米孔檢測方案，加快納米孔傳感器在臨床應用中的轉(zhuǎn)化，推動精準醫(yī)療的發(fā)展。

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