基于斑馬魚模型對(duì)藥食同源中藥飲品的抗氧化和抗疲勞功效研究

孫博 鄭海云 王超超 劉玉洋 王夢(mèng)曉 田孟堯 王慧君 趙海譽(yù)

摘要 ［目的］對(duì)2種藥食同源中藥飲品（香蜂悅顏飲、參杞固元飲）成分進(jìn)行初步分析，并利用斑馬魚功效模型評(píng)價(jià)2種飲品的抗氧化和抗疲勞作用。［方法］通過UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，用反相C18色譜柱，采用雙壓線性離子阱質(zhì)譜正/負(fù)離子雙重掃描方式，對(duì)樣品進(jìn)行成分分析；對(duì)水溶給予甲萘醌方法建立的斑馬魚氧化損傷模型加入梯度濃度（25、50、100 μg/mL）的香蜂悅顏飲稀釋液干預(yù)，同時(shí)設(shè)置正常組、陽(yáng)性藥組，處理24 h后，Cell ROX避光染色，在熒光顯微鏡下觀察拍照，計(jì)算斑馬魚的卵黃囊熒光強(qiáng)度；選擇5日齡野生型斑馬魚，加入梯度濃度（25、50、100 μg/mL）參杞固元飲稀釋液干預(yù)，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組和陽(yáng)性藥對(duì)照組，處理18 h后，給藥組水溶給予無水亞硫酸鈉建立斑馬魚疲勞模型，并利用行為分析儀分析斑馬魚總運(yùn)動(dòng)距離。［結(jié)果］根據(jù)質(zhì)譜檢測(cè)數(shù)據(jù)，香蜂悅顏飲、參杞固元飲分別檢測(cè)出63和60個(gè)化合物。與模型組相比，香蜂悅顏飲干預(yù)下的斑馬魚卵黃囊熒光強(qiáng)度顯著變?nèi)酰≒＜0.01）；與模型對(duì)照組相比，參杞固元飲干預(yù)下的斑馬魚總運(yùn)動(dòng)距離顯著更遠(yuǎn)（P＜0.05）。［結(jié)論］2種藥食同源中藥飲品分別具有明確的抗氧化和抗疲勞作用。

關(guān)鍵詞 斑馬魚；藥食同源；液質(zhì)聯(lián)用；抗氧化；抗疲勞

中圖分類號(hào) TS 275.4? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2024）12-0158-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.12.034

Study on Anti-oxidation and Anti-fatigue Effects of Medicinal and Edible Homologous Beverage for TCM Based on Zebrafish Model

SUN Bo1， ZHENG Hai-yun2， WANG Chao-chao1 et al

（1. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medicinal Sciences， Beijing 100700;2. Science and Technology Collaborating Center for Chinese Medicine， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700）

Abstract ［Objective］To analyze the chemical constituents in 2 medicinal and edible homologous beverage（Xiangfeng Yueyan Drink and Shenqi Guyuan decoction）， and evaluate the anti-oxidant and anti-fatigue effects. ［Method］UHPLC-TQ-Orbitrap-MS mass spectrometer and reverse phase C18 column were used to analyze the composition of the samples. The oxidative stress model established by aqueous menadione administration method was added with different gradient concentrations （25，50，100 μg/mL） of Xiangfeng Yueyan Drink dilution. Meanwhile， a normal group and a positive drug control group were set up. After treatment for 24 h， the Cell ROX was stained without light， and the fluorescence intensity of yolk sac was calculated by fluorescence microscope. Select 5-day-old wild type zebrafish and add different gradient concentrations （25， 50， 100 μg/mL） of Shenqi Guyuan decoction diluent. A normal control group and a positive drug group were set up at the same time. After treatment for 18 h， the fatigue model of zebrafish was established by aqueous solution of anhydrous sodium sulfite in the administration group， and the total movement distance of zebrafish was analyzed by behavior analyzer. ［Result］According to the mass spectrometry data， 63 compounds were detected in Xiangfeng Yueyan Drink and 60 compounds were detected in Shenqi Guyuan Drink. Compared with the model group， the fluorescence intensity of zebrafish yolk sac significantly weakened under the intervention of Xiangfeng Yueyan Drink （P＜0.01）;compared with the model control group， the total movement distance of zebrafish under the intervention of Shenqi Guyuan Drink was significantly longer （P＜0.05）.［Conclusion］The 2 kinds of medicinal and edible homologous beverage have clear anti-oxidation and anti-fatigue effects respectively.

Key words Zebrafish;Homology of medicine and food;LC-MS;Anti-oxidation;Anti-fatigue

基金項(xiàng)目 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CI2021A04012）。

作者簡(jiǎn)介 孫博（1994—），男，黑龍江牡丹江人，博士研究生，研究方向：中藥活性成分及中藥新藥開發(fā)。

*通信作者，研究員，博士，從事中藥活性成分及生物學(xué)表征研究。

收稿日期 2023-07-11

近年來，中醫(yī)藥功能食品的研發(fā)在《“健康中國(guó)”2030綱要》等一系列政策文件出臺(tái)下受到廣泛關(guān)注［1］。作為助力人類健康發(fā)展、推動(dòng)藥食同源產(chǎn)業(yè)升級(jí)的重要抓手，藥食同源品類中藥材被開發(fā)成飲品，以期通過獨(dú)特風(fēng)味、清新口感、飲用方便和明確功效走進(jìn)人們生活［2］。目前市場(chǎng)上的功能飲品的主要功用包括抗氧化、增強(qiáng)免疫力［3］和抗疲勞［4］。因此評(píng)價(jià)藥食同源類功能性飲品有必要引入抗氧化、抗疲勞能力的生物學(xué)評(píng)價(jià)方法，直觀反映產(chǎn)品的功效定位。

斑馬魚體型小，易飼養(yǎng)，繁殖迅速，所產(chǎn)幼卵能在72 h內(nèi)完成胚胎發(fā)育。一方面，斑馬魚具有體外試驗(yàn)高效、快速、價(jià)低等優(yōu)勢(shì)；另一方面，作為一種完整的動(dòng)物模型，斑馬魚可以對(duì)中藥功效進(jìn)行全方面、深層次的評(píng)價(jià)。目前，模式動(dòng)物斑馬魚已在中藥活性成分高通量篩選、藥效評(píng)價(jià)等方面發(fā)揮重要作用［5-6］。

氧化劑甲萘醌可以產(chǎn)生活躍的半醌，通過體內(nèi)氧化循環(huán)產(chǎn)生大量活性氧，從而誘導(dǎo)斑馬魚發(fā)生氧化損傷［7-8］；無水亞硫酸鈉能與氧氣反應(yīng)，限制機(jī)體耗氧量從而構(gòu)建斑馬魚疲勞模型［9］。該研究利用斑馬魚抗氧化評(píng)價(jià)模型、抗疲勞評(píng)價(jià)模型，分別評(píng)價(jià)2種藥食同源的功能性飲品，同時(shí)利用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)2種飲品中的成分進(jìn)行了鑒定，為后續(xù)中藥類藥食同源性產(chǎn)品（飲品）的功效評(píng)價(jià)和功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器。

Ultimate 3000超高效液相色譜儀（含自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、在線真空脫氣機(jī)、低壓四元梯度泵、PDA檢測(cè)器），雙壓線性離子肼串聯(lián)高分辨質(zhì)譜儀，LTQ Orbitrap Velos Pro，美國(guó)Thermo Fisher公司；KQ-250B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo Scientific公司；SZX7體式顯微鏡，奧林巴斯-中國(guó)有限公司；VertA1-CCD相機(jī)，上海土森視覺科技有限公司；Zebra Lab行為分析儀，法國(guó)ViewPoint公司；6孔板，中國(guó)Nest Biotech生物科技有限公司；CP214型精密電子天平，美國(guó)OHAUS公司。

1.1.2 試劑。

N-乙酰-L-半胱氨酸（批號(hào)I2016139，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；中華跌打丸［批號(hào)191112，廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司］；無水亞硫酸鈉（批號(hào)I1428128，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲基纖維素（批號(hào)C2004046，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；二甲基亞砜（批號(hào)BCCD8942，美國(guó)西格瑪奧德里奇公司）；甲萘醌（批號(hào)I1817117，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；Cell ROXTM Green Reagent熒光染料（批號(hào)2387260，美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司）。甲醇為美國(guó)Fisher公司色譜級(jí)甲醇；乙腈為美國(guó)Fisher公司色譜級(jí)乙腈；水為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

1.1.3 樣品信息。

試驗(yàn)所用的2種藥食同源中藥產(chǎn)品香蜂悅顏飲、參杞固元飲，均為北京食喜健康科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物。

斑馬魚來源于杭州環(huán)特生物科技股份有限公司，為野生型AB品系?？寡趸钚栽u(píng)價(jià)選用3日齡斑馬魚，抗疲勞活性評(píng)價(jià)選用5日齡斑馬魚。試驗(yàn)用斑馬魚飼養(yǎng)于28 ℃水溫的專門水族箱，飼養(yǎng)用水的水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，pH為6.5～8.5，電導(dǎo)率為450～550 μS/cm，硬度為50～100 mg/L CaCO3。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液制備。

1.2.1.1 陽(yáng)性藥溶液。取N-乙酰-L-半胱氨酸用超純水配制成12.5 mg/mL母液，現(xiàn)配現(xiàn)用。中華跌打丸粉碎后用超純水溶解，并配制成200 mg/mL母液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.1.2

供試品溶液。分別取香蜂悅顏飲、參杞固元飲原液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過后，分別按照不同濃度比例稀釋，即得。

1.2.2 LC-MS 分析條件。

1.2.2.1 色譜條件。

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸-水溶液（A）- 乙腈（B）；梯度洗脫（0～5 min，2%～12% B，5～20 min，12%～30% B，20～27 min，30%～50% B，27～32 min，50%～95% B）；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量4 μL。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件。

采用電噴霧離子源（ESI）；正、負(fù)離子檢測(cè)模式，掃描時(shí)間35 min；蒸發(fā)溫度350 ℃；毛細(xì)管電壓為-35 V，噴霧電壓為-3.5 kV；鞘氣流速35 L/min，輔助氣流速10 L/min；噴霧電流100.00 kV；供試品和對(duì)照品溶液一級(jí)質(zhì)譜在FT模式下進(jìn)行全掃描，掃描范圍m/z 100～1 200，二級(jí)質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴性掃描；質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Xcalibur軟件采集和分析。

1.2.3

抗氧化活性評(píng)價(jià)。隨機(jī)選取3日齡野生型斑馬魚于6孔板中，每孔容量為3 mL并放置30尾斑馬魚，分別設(shè)置正常組、模型組、陽(yáng)性藥組和香蜂悅顏飲組（試驗(yàn)組）。純凈水對(duì)樣品原液進(jìn)行稀釋，水溶給藥。除正常組外，其余各組均水溶給予甲萘醌建立斑馬魚氧化損傷模型。香蜂悅顏飲組的給藥濃度分別為25、50、100 μL/mL。陽(yáng)性藥組選擇的陽(yáng)性藥為N-乙酰-L-半胱氨酸，給藥濃度為125 μg/mL。干預(yù)后，放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，24 h后收集斑馬魚。利用Cell ROXTM Green Reagent熒光染料對(duì)斑馬魚內(nèi)活性氧染色，30 min 后純凈水清洗3遍。各組隨機(jī)選取10尾斑馬魚置于熒光顯微鏡下拍照，以斑馬魚卵黃囊熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)樣品抗氧化功效。

1.2.4

抗疲勞活性評(píng)價(jià)。隨機(jī)選取5日齡斑馬魚于6孔板中，每孔容量為3 mL并放置30尾斑馬魚，分別設(shè)置正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性藥對(duì)照組和參杞固元飲組（試驗(yàn)組）。純凈水對(duì)樣品原液進(jìn)行稀釋，水溶給藥。參杞固元飲組的給藥濃度分別為25、50、100 μL/mL。陽(yáng)性藥對(duì)照組選擇的陽(yáng)性藥為中華跌打丸，給藥濃度為1 000 μg/mL。干預(yù)后，放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱。靜置18 h后，除正常對(duì)照組外，其余各試驗(yàn)組均水溶給予無水亞硫酸鈉造成斑馬魚疲勞狀態(tài)。樣品與無水亞硫酸鈉共同處理后，每組隨機(jī)選取10尾斑馬魚置于行為分析儀采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚總運(yùn)動(dòng)距離，以該指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)樣品緩解體力疲勞功效。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用mean ± SEM表示，P<0.05表明組間存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蜂悅顏飲成分分析

采用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術(shù)對(duì)香蜂悅顏飲的化學(xué)成分進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。通過測(cè)得的精確相對(duì)分子質(zhì)量及二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子推測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)式，結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)一步比對(duì)，共鑒定推斷出63個(gè)化合物，見表1。其中包括糖苷、皂苷、苯酚、環(huán)烯醚萜、黃酮等。這些成分主要來源于甘草、香蜂草、當(dāng)歸、梔子等。

2.2 參杞固元飲成分分析

采用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術(shù)對(duì)參杞固元飲的化學(xué)成分進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。通過測(cè)得的精確相對(duì)分子質(zhì)量及二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子推測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)式，結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)一步比對(duì)，共鑒定推斷出60個(gè)化合物，見表2。這些成分主要來源于人參、甘草、紫蘇籽、山藥、覆盆子、黃精、茯苓、猴頭菇、針葉櫻桃、枸杞。

2.3 香蜂悅顏飲的抗氧化活性評(píng)價(jià)

正常組和模型組斑馬魚卵黃囊熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明（圖3～4），斑馬魚幼魚經(jīng)甲萘醌處理后，卵黃囊熒光強(qiáng)度顯著上升（P<0.001），表明造模成功。香蜂悅顏飲組斑馬魚卵黃囊熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，25～100 μL/mL的香蜂悅顏飲對(duì)模型斑馬魚存在抗氧化作用，并且隨著干預(yù)濃度的上升，抗氧化作用逐漸加強(qiáng)。

2.4 參杞固元飲的抗疲勞活性評(píng)價(jià)

從圖5～6可以看出，模型對(duì)照組斑馬魚的總運(yùn)動(dòng)距離明顯比正常對(duì)照組有所縮短（P<0.001），表明造模成功。經(jīng)中華跌打丸和參杞固元飲干預(yù)的斑馬魚（陽(yáng)性藥對(duì)照組和參杞固元飲組）總運(yùn)動(dòng)距離顯著遠(yuǎn)于模型組，其中參杞固元飲100 μL/mL干預(yù)濃度下的斑馬魚運(yùn)動(dòng)距離最遠(yuǎn)且最顯著（P<0.001）。

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)結(jié)果表明，通過甲萘醌建立的斑馬魚氧化損傷模型能夠有效評(píng)價(jià)陽(yáng)性藥N-乙酰-L-半胱氨酸和香蜂悅顏飲的抗氧化作用，并體現(xiàn)出隨干預(yù)濃度上升抗氧化能力也在上升的趨勢(shì)。香蜂悅顏飲主要由香蜂草、甘草、當(dāng)歸、梔子等中藥提取而成。香蜂草中迷迭香酸［10］、咖啡酸［11］、兒茶素［12］、原兒茶酸［13］均有明確的抗氧化作用。其中香蜂草中的香蜂草苷、木犀草素［14］以及甘草中的黃酮類化合物也是天然的抗氧化劑，有效清除體內(nèi)自由基，防止不飽和脂肪酸過量氧化，減緩衰老。

無水亞硫酸鈉影響機(jī)體耗氧量，從而減弱斑馬魚活動(dòng)能力，但經(jīng)陽(yáng)性藥中華跌打丸和參杞固元飲干預(yù)的斑馬魚，運(yùn)動(dòng)距離減弱較緩。特別是100 μL/mL參杞固元飲干預(yù)濃度下，斑馬魚無論活動(dòng)距離和活動(dòng)速度均基本與未經(jīng)無水亞硫

酸鈉干預(yù)的斑馬魚相當(dāng)，一方面體現(xiàn)了抗疲勞模型對(duì)不同濃

度樣品評(píng)價(jià)的靈敏度，另一方面也體現(xiàn)了樣品有效性。參杞固元飲主要由人參、枸杞、甘草、黃精、猴頭菇、茯苓等藥食同源中藥組成。其中人參皂苷類成分可促進(jìn)血液循環(huán)、增加心臟供血量、提高心臟功能［15-16］，并且枸杞、黃精、茯苓、猴頭菇中的多糖類成分也可以改善斑馬魚機(jī)體的血乳酸、血清尿素氮水平，提高抗疲勞能力以及增加運(yùn)動(dòng)耐力。

藥食同源是中醫(yī)藥文化的重要組成，其研究和開發(fā)既有助于滿足大眾保健養(yǎng)生、健康生活的期許，也推動(dòng)產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。其中飲品類產(chǎn)品的發(fā)展?jié)摿薮?，但目前中藥類的此類產(chǎn)品認(rèn)知度較低，對(duì)此類引入建立合理且普遍適應(yīng)的功效評(píng)價(jià)模型，可以直觀反映產(chǎn)品功效定位，來推動(dòng)其市場(chǎng)潛力的充分發(fā)揮。

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