根瘤菌對(duì)莖瘤芥的促生作用研究

毛仲玉 常黎潔 王殿東

摘要 ［目的］研究田菁莖瘤固氮根瘤菌侵染莖瘤芥的情況以及對(duì)植株促生作用的影響。［方法］分析根瘤菌對(duì)不同品種莖瘤芥的促生作用差異、不同濃度根瘤菌對(duì)莖瘤芥栽培品種“涪雜2號(hào)”的影響、不同誘導(dǎo)劑對(duì)結(jié)瘤的影響。［結(jié)果］田菁莖瘤固氮根瘤菌侵染的6個(gè)莖瘤芥品種中，“涪雜2號(hào)”根長(zhǎng)和株高增加顯著，促生作用明顯。以不同濃度田菁莖瘤固氮根瘤菌侵染“涪雜2號(hào)”幼苗結(jié)果表明，在1.0×108個(gè)/mL濃度下，莖瘤芥的根長(zhǎng)和株高增加最為顯著，同時(shí)利用熒光顯微鏡觀察到根瘤菌在“涪雜2號(hào)”健康幼苗根部組織的定殖情況，在處理莖瘤芥3 d后，根瘤菌可侵入莖瘤芥根部并定殖，在接菌15 d后，在莖瘤芥根系局部組織發(fā)展成很高的群體密度。橫向比較3種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)莖瘤芥結(jié)瘤效率差異表明，使用2，4-D、氯磺隆、豆科威后，3種誘導(dǎo)劑均可在30 d后于莖瘤芥根部形成類根瘤，60 d后類根瘤數(shù)量明顯增多，其中，2，4-D結(jié)瘤效率最好，高達(dá)93%，顯著高于其他2種誘導(dǎo)劑結(jié)瘤效率。［結(jié)論］該研究為更好地利用根瘤菌促進(jìn)莖瘤芥生長(zhǎng)的共生體系打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 莖瘤芥；田菁莖瘤固氮根瘤菌；誘導(dǎo)結(jié)瘤；促生作用

中圖分類號(hào) S-3 ??文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2024）12-0001-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.12.001

Study on the Growth-promoting Effect of Rhizobia on Tumorous Stem Mustard

MAO Zhong-yu1，CHANG Li-jie2，WANG Dian-dong2

（1.College of Biology and Food Enginerring，Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404100；2.School of Advanced Agriculture and Bioengineering，Yangtze Normal University，Chongqing 408000）

Abstract ［Objective］To study the infection of Azorhizobium caulinodans in tumorous stem mustard and its effect on plant growth promotion.［Method］The differences in growth promoting effects of rhizobia on different varieties of tumorous stem mustard，the effects of different concentrations of rhizobia on the cultivated variety ‘Fuza 2 of tumorous stem mustard and the effects of different inducers on nodulation were analyzed.［Result］The root length and plant height of ‘Fulza 2 increased significantly，and the growth promotion effect was obvious among the 6 stem mustard varieties infected with nitrogen-fixing rhizobia.The results of different concentrations of Azorhizobium caulinodans showed that the root length and plant height of ‘Fulza 2 seedlings increased significantly at the concentration of 1.0×108 rhizobium/mL，and the colonization of rhizobium in the root tissues of healthy ‘Fulza 2 seedlings was observed by fluorescence microscopy.After 3 days of treatment，rhizobium could invade and colonize the roots of ‘Fulza 2 seedlings.After 15 days of inoculation，high population density was developed in the local tissues of stems.Horizontal comparison of the three inducers nodulation efficiency showed that the three inducers could form nodule in the roots of stem tumor mustard after 30 days，and the number of nodule increased significantly after 60 days.The nodulation efficiency of 2，4-D was the best，up to 93%，which was significantly higher than that of the other two inducers.［Conclusion］ This study lays the foundation for better utilizing the symbiotic system of rhizobia to promote the growth of stem mustard.

Key words Tumorous stem mustard;Azorhizobium caulinodans；Induction nodulation;Growth-promoting effect

基金項(xiàng)目 重慶市高校創(chuàng)新研究群體項(xiàng)目（CXQT21029）。

作者簡(jiǎn)介 毛仲玉（1997—），女，黑龍江大興安嶺人，碩士研究生，研究方向：作物病害防治。*通信作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事主要土傳病害、植物寄生線蟲等發(fā)病規(guī)律和致病機(jī)理研究。

收稿日期 2023-08-09

莖瘤芥（Brassica juncea var.tumida）是重慶地區(qū)主栽的經(jīng)濟(jì)作物之一，其莖部發(fā)生膨大，是制作榨菜的主要原料，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1］。現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)認(rèn)為，榨菜能健脾開胃、補(bǔ)氣添精、增食助神，榨菜與法國(guó)酸黃瓜、德國(guó)甜酸甘藍(lán)并稱為世界三大名腌菜［2］。

根瘤菌（Rhizobium）屬于革蘭氏陰性桿菌，可侵入豆科植物體內(nèi)并在根部形成根瘤［3］。田菁莖瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）是根瘤菌一個(gè)新屬——固氮根瘤菌屬［4］，從豆科植物田菁中分離，與其他根瘤菌屬的不同點(diǎn)是根瘤菌可以完成自生固氮。田菁莖瘤固氮根瘤菌可以把分子態(tài)氮轉(zhuǎn)化成為植物可吸收利用的氨態(tài)氮形式，對(duì)植物生長(zhǎng)具有促生作用，同時(shí)還可提高植物抵抗不利環(huán)境及病原菌的免疫能力，從而達(dá)到增加作物產(chǎn)量的目的［5-6］。近年來(lái)，人們通過(guò)基因標(biāo)記等檢測(cè)手段跟蹤根瘤菌在非豆科植物根圈的定殖動(dòng)態(tài)［7］，發(fā)現(xiàn)許多根瘤菌在非豆科植物（水稻、油菜、小麥和棉花等）的根圈具有較強(qiáng)的定殖能力，并對(duì)植物根系以及地上部分的生長(zhǎng)有很好的促進(jìn)作用［8］。

誘導(dǎo)劑也是植物生長(zhǎng)激素，與激素相對(duì)應(yīng)物質(zhì)結(jié)合可完成對(duì)植物生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用?？梢耘c植物激素完成結(jié)合引起細(xì)胞發(fā)生生理生化變化的蛋白質(zhì)定義為激素受體［9］。激素受體位點(diǎn)的分布較廣，如細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)膜［10］。植物自身具有激素種類較多，故有較多種類激素受體分布在細(xì)胞不同位置。誘導(dǎo)劑作用于各位點(diǎn)受到激素影響，會(huì)引起膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，使一些依附在位點(diǎn)的酶和酶原失活或活化。酶系統(tǒng)發(fā)生改變會(huì)引起整個(gè)細(xì)胞的生理生長(zhǎng)和新陳代謝功能也在一定程度上發(fā)生改變［11］。

基于根腫病、根瘤和根結(jié)線蟲在植物根系寄生位點(diǎn)相同，引起根部形成瘤狀相似。該研究根據(jù)根瘤菌對(duì)植物生長(zhǎng)具有一定促生作用的特點(diǎn)，優(yōu)化根瘤菌侵染莖瘤芥體系，引根瘤菌侵入莖瘤芥根部并定殖，研究根瘤菌對(duì)莖瘤芥的促生作用，為更好地利用根瘤菌促進(jìn)莖瘤芥生長(zhǎng)的共生體系打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)于2019年9月至2022年5月在重慶市涪陵區(qū)長(zhǎng)江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院病蟲害防治實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。供試田菁莖瘤固氮根瘤菌Azorhizobium caulinodans ORS 571，由湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供；莖瘤芥品種“涪雜2號(hào)”“永安小葉”“永安傳奇”“高山青”“早青2號(hào)”“成都郫縣榨菜”由長(zhǎng)江師范學(xué)院劉義華老師饋贈(zèng)和重慶市涪陵區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買；誘導(dǎo)劑選用2，4-D、豆科威、氯黃隆。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根瘤菌對(duì)不同品種莖瘤芥侵染。

選取6個(gè)莖瘤芥品種種子，分別放置2 mL已滅菌的離心管中，用50%次氯酸鈉浸泡種子10 min，期間振蕩離心管確保所有種子浸泡，倒出清洗液后使用移液槍吸取無(wú)菌水沖洗5次，進(jìn)行表面消毒后放置在裝有滅菌瓊脂組培瓶中，每個(gè)品種每瓶10粒，設(shè)5個(gè)重復(fù)［12］，種子萌發(fā)2 d后幼苗用于根瘤菌接種試驗(yàn)。挑選生長(zhǎng)狀態(tài)大致相同的幼苗，吸取OD600在0.6～0.8的菌液并稀釋至1.0×108個(gè)/mL菌液加至瓊脂培養(yǎng)基上。對(duì)照組接等量PBS緩沖液，設(shè)5個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)條件同上，接菌培養(yǎng)后9 d后調(diào)查莖瘤芥生長(zhǎng)情況。無(wú)菌水沖洗，自然風(fēng)干后放置黑色桌面拍照，測(cè)量其根長(zhǎng)和株高，取代表性幼苗制片用于熒光顯微鏡觀察。

1.2.2 不同濃度根瘤菌對(duì)莖瘤芥侵染。

將已消毒的“涪雜2號(hào)”種子置于瓊脂-水固體培養(yǎng)基上限菌培養(yǎng)，待種子萌發(fā)至兩葉一心期時(shí)，鑷子剔除未萌發(fā)的種子，留有生長(zhǎng)狀態(tài)大致相同的幼苗。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的根瘤菌菌液放置50 mL離心管中，4 500 r/min離心10 min收集菌體，用PBS緩沖液分別稀釋為1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106? 個(gè)/mL 4個(gè)不同濃度備用。分別吸取不同濃度1 mL根瘤菌菌液至培養(yǎng)基表面，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)重復(fù)，每瓶10粒，平行對(duì)照接等量PBS，設(shè)4個(gè)重復(fù)［4］。接菌培養(yǎng)9 d后，調(diào)查莖瘤芥幼苗生長(zhǎng)情況并用直尺測(cè)量根長(zhǎng)和株高。

1.2.3 根瘤菌在莖瘤芥根系定殖情況觀察。

室內(nèi)條件下，選用“涪雜2號(hào)”飽滿種子表面消毒，消毒方式同“1.2.1”。置于瓊脂-水固體培養(yǎng)基上限菌培養(yǎng)，萌發(fā)至兩葉一心期，每個(gè)組培瓶吸取1 mL 1.0×108個(gè)/mL PBS稀釋菌液加至瓊脂-水固體培養(yǎng)基表面，使莖瘤芥幼苗接菌。接菌后，封口膜密封組培瓶以免污染，放置常規(guī)智能培養(yǎng)架限菌培養(yǎng)［13］。設(shè)置接菌3、6、9、12、15、18、21 d 等時(shí)間梯度，定期用熒光顯微鏡檢測(cè)莖瘤芥幼苗根部被綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記根瘤菌定殖情況。

1.2.4 不同濃度根瘤菌結(jié)瘤誘導(dǎo)劑對(duì)莖瘤芥根系結(jié)瘤的影響。

將2，4-D、氯黃隆和豆科威3種誘導(dǎo)劑濃度梯度依次稀釋為0.5、1.0、2.5 mg/L，同時(shí)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的根瘤菌用PBS緩沖液稀釋濃度至1.0×108個(gè)/mL備用。表面消毒的莖瘤芥“涪雜2號(hào)”種子放置濾紙上催芽，封口膜貼封培養(yǎng)皿進(jìn)行限菌培養(yǎng)。3種誘導(dǎo)劑的每個(gè)處理10粒，設(shè)5個(gè)重復(fù)，萌發(fā)至兩葉一心期，每個(gè)處理加入不同濃度誘導(dǎo)劑后再同時(shí)加入等量的1 mL 的1.0×108個(gè)/mL根瘤菌菌液，于24 ℃溫室培養(yǎng)。30 d后觀察根部結(jié)瘤情況和測(cè)量各處理下莖瘤芥的根長(zhǎng)、株高、葉長(zhǎng)、根重和葉重，分析不同誘導(dǎo)劑與根瘤菌組合使用對(duì)莖瘤芥生理指標(biāo)的影響。

1.2.5 不同劑量根瘤菌結(jié)瘤誘導(dǎo)劑對(duì)莖瘤芥根系結(jié)瘤的影響。

種子消毒方式同“1.2.1”，限菌培養(yǎng)。選用稀釋至2.5 mg/L 的3種誘導(dǎo)劑和稀釋至1.0×108個(gè)/mL根瘤菌菌液備用，待種子培養(yǎng)至兩葉一心時(shí)移至花盆，在幼苗生長(zhǎng)周圍分別用注射劑加入1和5 mL 3種誘導(dǎo)劑，同時(shí)加入等量根瘤菌菌液，每個(gè)處理10株，設(shè)4個(gè)重復(fù)。30和60 d后觀察各處理下莖瘤芥的結(jié)瘤情況差異。

1.2.6 結(jié)瘤幼苗根部及土壤固氮酶活性測(cè)定。

種子表面消毒方法同“1.2.1”，種子生長(zhǎng)至兩葉一心期時(shí)，在幼苗根部接5 mL稀釋至2.5 mg/L 2，4-D和1.0×108個(gè)/mL根瘤菌菌液。同等培養(yǎng)條件下，幼苗接5 mL的PBS作為對(duì)照，30 d后觀察結(jié)瘤情況。待調(diào)查處理組幼苗根部形成根瘤后，測(cè)定固氮酶活性。

1.2.7 根腫病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)計(jì)算。

根腫病分級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，根部無(wú)癥狀；1級(jí)，側(cè)根有腫塊，主根無(wú)腫塊；2級(jí)，主根有腫塊，側(cè)根無(wú)腫塊；3級(jí)：主、側(cè)根均有腫塊；4級(jí)，主、側(cè)根有大量嚴(yán)重腫塊［14］。

相關(guān)計(jì)算公式：結(jié)瘤率=結(jié)瘤株數(shù)/調(diào)查株數(shù)×100%；單位根瘤重量固氮酶活性SNA=還原的乙烯量/（根瘤干重×?xí)r間）；病情指數(shù)=100×∑（各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)代表值）。

1.3 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)根瘤菌侵染不同濃度根瘤菌處理莖瘤芥根長(zhǎng)和株高進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，通過(guò)單因素方差分析比較對(duì)照組和處理組之間的差異性，并用最小顯著法（LSD）進(jìn)行多重比較，利用Excel進(jìn)行柱形圖和誤差線的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 根瘤菌對(duì)不同品種莖瘤芥侵染分析

接菌9 d后通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)到根瘤菌在各莖瘤芥品種根部均有定殖（圖1）。根瘤菌在不同品種莖瘤芥根部的定殖部位大致相同，多定殖于幼苗根部表皮細(xì)胞和細(xì)胞間隙，但具體的分布數(shù)量則有所不同。其中檢測(cè)到根瘤菌在“涪雜2號(hào)”根部組織定殖量最多，其次為“永安傳奇”和“永安小葉”，根瘤菌定殖量最少的為“早青2號(hào)”。“涪雜2號(hào)”根部組織觀察到明亮的綠色熒光（圖1A），檢測(cè)到的GFP標(biāo)記明顯多于其他莖瘤芥品種。根瘤菌在莖瘤芥根部呈點(diǎn)狀分布且分布較零散。試驗(yàn)證明，根瘤菌同樣可以存在于非豆科植物內(nèi)部組織。

2.2 根瘤菌侵染不同品種莖瘤芥生理指標(biāo)差異分析

限菌培養(yǎng)9 d后，測(cè)量各處理下的30株莖瘤芥根長(zhǎng)和株高并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，其根長(zhǎng)和株高數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。生理指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果（圖2）表明，根瘤菌對(duì)不同的莖瘤芥品種根長(zhǎng)和株高產(chǎn)生不同影響，經(jīng)LSD檢驗(yàn)，“涪雜2號(hào)”和“早青2號(hào)”根長(zhǎng)和株高處理組均顯著高于對(duì)照組；“永安小葉”根長(zhǎng)處理組和對(duì)照組差異不顯著，但株高差異顯著；“永安傳奇”根長(zhǎng)較未接菌組（CK）差異顯著，株高差異不顯著；“高山青”和“成都郫縣榨菜”根長(zhǎng)處理組和對(duì)照組差異顯著，株高差異均不顯著。

“永安小葉”根長(zhǎng)較對(duì)照組提高了5.5%，株高較對(duì)照組提高了3.0%;“永安傳奇”根長(zhǎng)較對(duì)照組提高了6.8%，株高較對(duì)照組提高了4.8%；“早青2號(hào)”根長(zhǎng)較對(duì)照組提高了3.2%，株高較對(duì)照組提高了2.5%；“成都郫縣榨菜”根長(zhǎng)較對(duì)照提高了8.6%，株高較對(duì)照組提高了11.0%；“涪雜2號(hào)”根長(zhǎng)較對(duì)照組提高了11.6%，株高處理組較對(duì)照組提高了12.1%；“高山青”根長(zhǎng)較對(duì)照組提高了4.5%，株高較對(duì)照組提高了4.1%。其中“涪雜2號(hào)”根長(zhǎng)和株高經(jīng)根瘤菌侵染后促生作用最為明顯，“涪雜2號(hào)”根長(zhǎng)和株高增加是“高山青”的2倍。綜上所述，適宜濃度根瘤菌對(duì)不同品種莖瘤芥生長(zhǎng)均具有促生作用，其中“涪雜2號(hào)”接菌幼苗根長(zhǎng)和株高較對(duì)照組差異均顯著且“涪雜2號(hào)”作為莖瘤芥栽培常用品種生長(zhǎng)狀態(tài)良好，故選用莖瘤芥“涪雜2號(hào)”品種用于深入研究根瘤菌與莖瘤芥相互作用的分子機(jī)制。

2.3 不同濃度根瘤菌侵染莖瘤芥的生理指標(biāo)檢測(cè)分析

經(jīng)“2.2”結(jié)果分析，使用不同濃度根瘤菌對(duì)莖瘤芥“涪雜2號(hào)”的生長(zhǎng)產(chǎn)生不同程度的影響，其中1.0×108個(gè)/mL的根瘤菌對(duì)莖瘤芥“涪雜2號(hào)”生長(zhǎng)的影響最大且有明顯的促生作用。室內(nèi)條件下接菌9 d后測(cè)量不同濃度處理下30株莖瘤芥幼苗根長(zhǎng)和株高并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示（圖3），1.0×108個(gè)/mL處理下的幼苗根長(zhǎng)和株高顯著高于其他處理，1.0×107和1.0×106個(gè)/mL之間幼苗根長(zhǎng)差異不顯著，1.0×109、1.0×107和 1.0×106個(gè)/mL之間幼苗株高差異不顯著。1.0×108和1.0×107個(gè)/mL的根瘤菌侵染莖瘤芥幼苗根長(zhǎng)較對(duì)照分別提高了15.8%和5.8%，株高較對(duì)照分別提高了22.5%和21.7%。1.0×109個(gè)/mL株高較對(duì)照提高了7.8%，1.0×106個(gè)/mL株高較對(duì)照提高了1.1%，但在1.0×109個(gè)/mL濃度下，處理組根長(zhǎng)較對(duì)照下降4.8%，而1.0×106個(gè)/mL濃度下，根長(zhǎng)較對(duì)照沒有明顯差異。綜合以上分析得出，1.0×108 個(gè)/mL濃度處理莖瘤芥的促生作用效果最好，可作為試驗(yàn)適宜濃度深入研究田菁莖瘤固氮根瘤菌與莖瘤芥相互作用的分子機(jī)制。

2.4 根瘤菌在莖瘤芥根部定殖情況分析

此次試驗(yàn)在不同時(shí)間梯度利用熒光顯微鏡檢測(cè)根瘤菌在莖瘤芥幼苗根部的定殖情況，結(jié)果表明，根瘤菌在侵染莖瘤芥3 d時(shí)定殖于幼苗根部組織，隨時(shí)間推移根瘤菌的定殖量遞增，在接菌15 d時(shí)，根瘤菌的定殖量已在幼苗根部大量繁殖，并在局部發(fā)展為一定范圍的群體密度（圖4）。根瘤菌不僅可侵染非豆科植物，還可定殖于植物根的表皮、皮層的細(xì)胞間隙和細(xì)胞內(nèi)，形成生態(tài)位（ecological niche）。經(jīng)熒光顯微鏡檢測(cè)，根瘤菌侵染非豆科植物莖瘤芥根部的定殖規(guī)律與根瘤菌侵入豆科植物體內(nèi)大致相似，侵入植物根部組織定殖的方式均為“裂隙進(jìn)入”，并隨著時(shí)間推移根瘤菌可在莖瘤芥根部形成一定范圍的群體密度。

2.5 不同濃度誘導(dǎo)劑處理莖瘤芥生理指標(biāo)差異分析

不同濃度誘導(dǎo)劑處理莖瘤芥30 d后，對(duì)每組處理下的30株幼苗進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖5），莖瘤芥的根長(zhǎng)、株高、葉長(zhǎng)、根重、葉重均有明顯的差異，其中1.0 mg/L豆科威對(duì)莖瘤芥的生理生長(zhǎng)影響最大。1.0 mg/L豆科威幼苗株高高于0.5、1.0、2.5 mg/L的2，4-D和0.5、1.0 mg/L的氯磺隆，低于2.5 mg/L氯磺隆處理下的株高。1.0 mg/L處理下豆科威葉長(zhǎng)為16.57 cm，高于氯磺隆3個(gè)濃度下的葉長(zhǎng)。1.0 mg/L豆科威根重為0.53 g，與2.5 mg/L氯磺隆根重差異不大，但均高于其他處理下的根重。綜上所述，使用結(jié)瘤誘導(dǎo)劑3個(gè)濃度誘導(dǎo)莖瘤芥，1.0 mg/L豆科威對(duì)莖瘤芥生理生長(zhǎng)沒有表現(xiàn)出明顯的抑制作用，在1.0 mg/L豆科威處理下，“涪雜2號(hào)”幼苗的生長(zhǎng)狀態(tài)最好。但3個(gè)誘導(dǎo)劑稀釋3個(gè)濃度使用1 mL劑量下處理幼苗均未誘導(dǎo)莖瘤芥根部結(jié)瘤。

2.6 不同劑量誘導(dǎo)劑處理莖瘤芥結(jié)瘤差異分析

接菌30 d后調(diào)查莖瘤芥在不同劑量根瘤菌結(jié)瘤誘導(dǎo)劑處理下結(jié)瘤情況，調(diào)查結(jié)果（圖6）表明，3種誘導(dǎo)劑使用濃度為2.5 mg/L和1 mL劑量處理下均未誘導(dǎo)莖瘤芥形成根瘤，但2.5 mg/L濃度處理下使用劑量為5 mL的3種誘導(dǎo)劑均誘導(dǎo)莖瘤芥根部形成根瘤。這一現(xiàn)象說(shuō)明誘導(dǎo)劑使用量是影響莖瘤芥結(jié)瘤的重要原因。5 mL的2，4-D和根瘤菌同時(shí)使用下，莖瘤芥結(jié)瘤效果最明顯且形成的類根瘤最多，其次為5 mL豆科威和5 mL氯磺隆。2，4-D和氯磺隆加菌形成的類根瘤形態(tài)大致相同，均呈現(xiàn)半圓球狀，而豆科威加菌形成的類根瘤呈現(xiàn)半圓球狀和短棒狀。同樣培養(yǎng)條件下，未加入誘導(dǎo)劑僅使用根瘤菌培養(yǎng)的對(duì)照組莖瘤芥，雖有根瘤菌定殖在根部組織，但也未誘導(dǎo)莖瘤芥在根部形成根瘤。

2.7 不同劑量誘導(dǎo)劑處理莖瘤芥生理指標(biāo)差異分析

調(diào)查不同劑量誘導(dǎo)劑處理60 d后的30株莖瘤芥生理指標(biāo)影響的差異情況，結(jié)果表明（圖7）， 2.5 mg/L濃度及5.0 mL劑量的2，4-D和根瘤菌菌液等量處理莖瘤芥，根鮮重最大，均值高達(dá)1.47 g，低于對(duì)照組5%，分別高于氯磺隆和豆科威處理下12%和11%。經(jīng)最小顯著差異法檢驗(yàn)，2，4-D較對(duì)照組差異不顯著，較氯磺隆及豆科威差異顯著。綜上所述，3種誘導(dǎo)劑加菌使用較對(duì)照莖瘤芥生長(zhǎng)均有一定影響，其中2，4-D較對(duì)照根鮮重差異不顯著，表明2，4-D莖瘤芥生長(zhǎng)沒有明顯的抑制作用，而氯磺隆和豆科威處理下對(duì)莖瘤芥根鮮重有明顯的抑制作用，故選用結(jié)瘤效果最佳且對(duì)莖瘤芥生長(zhǎng)影響較小的2，4-D為后期試驗(yàn)誘導(dǎo)劑。

2.8 根瘤菌在類根瘤中的定殖觀察

在莖瘤芥根部形成根瘤后，取2，4-D濃度為2.5 mg/L和劑量為5 mL處理下形成

根瘤的莖瘤芥幼苗，用于檢測(cè)根瘤中根瘤菌的定殖情況。莖瘤芥幼苗根部在2，4-D和根瘤菌侵染下培養(yǎng)30 d，在莖瘤芥根部形成根瘤，通過(guò)熒光顯微鏡觀察，根瘤菌不僅可在莖瘤芥根系自然開口和根系細(xì)胞間隙定殖，還可進(jìn)入根瘤細(xì)胞間隙并在根瘤組織中大量增殖（圖8）。

2.9 莖瘤芥結(jié)瘤根部和土壤固氮酶活性差異分析

從圖9可以看出，莖瘤芥接菌處理組和對(duì)照組固氮酶活性差異顯著，形成根瘤的根部固氮酶活性為30.21 IU/g，對(duì)照組為28.57 IU/g；對(duì)培養(yǎng)莖瘤芥土壤進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和處理組差異明顯，其處理組固氮酶活性為31.73 IU/g，對(duì)照組為29.70 IU/g。綜上所述，處理組的固氮酶活性雖高于對(duì)照組，但對(duì)照組未接根瘤菌和處理組一樣均表現(xiàn)出一定的固氮酶活性，這可能是因?yàn)樵诮泳^(guò)程中，空氣中攜帶根瘤菌遷移于對(duì)照組，使其也受到一定影響。

3 結(jié)論與討論

根瘤菌侵染6個(gè)品種莖瘤芥。利用熒光顯微鏡觀察，結(jié)果顯示，根瘤菌在6個(gè)品種莖瘤芥根部均有定殖，同時(shí)對(duì)6個(gè)品種莖瘤芥的生長(zhǎng)均有促生作用；其中，“涪雜2號(hào)”根長(zhǎng)和株高較對(duì)照差異顯著，根瘤菌對(duì)莖瘤芥生長(zhǎng)起促生作用，是其作為外源生物侵入植物體內(nèi)形成聯(lián)合作用，同時(shí)未表現(xiàn)出外觀病理和防御反應(yīng)，從而促進(jìn)非豆科植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量的提高［15］，也可能是因?yàn)樘镙记o瘤固氮根瘤菌侵入莖瘤芥根部組織中作為內(nèi)生菌提高了莖瘤芥體內(nèi)植物激素的有效力，植物激素調(diào)節(jié)了植物生長(zhǎng)，對(duì)莖瘤芥的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了明顯的良好效果，表現(xiàn)出對(duì)接菌莖瘤芥的生長(zhǎng)狀態(tài)明顯好于未接菌莖瘤芥生長(zhǎng)狀態(tài)。

將根瘤菌菌液稀釋4個(gè)濃度侵染莖瘤芥“涪雜2號(hào)”，PBS緩沖液處理做平行對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果表明，1.0×108個(gè)/mL濃度處理莖瘤芥生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，對(duì)莖瘤芥生長(zhǎng)起到明顯的促生作用；其他濃度處理下，莖瘤芥根長(zhǎng)較對(duì)照沒有明顯差異或?qū)ηo瘤芥生長(zhǎng)不具備促生作用。這表明根瘤菌適宜濃度是影響莖瘤芥生長(zhǎng)的重要因素之一，過(guò)高濃度菌液對(duì)莖瘤芥的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，菌液濃度過(guò)低則對(duì)莖瘤芥的根長(zhǎng)和株高的生長(zhǎng)影響不明顯。

近幾年有研究證明，根瘤菌與非豆科植物相互作用，可以形成生態(tài)位，定義為根瘤菌的第3種生活方式，打破了人們對(duì)根瘤菌只有2種存在生活形式的認(rèn)知［16］。該研究用帶有GFP 標(biāo)記的根瘤菌侵染莖瘤芥常用栽培品種“涪雜2號(hào)”，結(jié)果表明，根瘤菌侵染莖瘤芥3 d時(shí)可在根部組織定殖，并隨時(shí)間推移，15 d時(shí)根瘤菌在莖瘤芥根部組織內(nèi)數(shù)量短暫上升，并在局部形成群體密度。說(shuō)明根瘤菌侵染非豆科植物莖瘤芥過(guò)程中可定殖于莖瘤芥根表皮、皮層的細(xì)胞間隙和細(xì)胞內(nèi)，形成生態(tài)位。這一現(xiàn)象與遲峰［16］觀察根瘤菌侵入非豆科植物水稻體內(nèi)規(guī)律大致相似，根瘤菌侵染水稻根部組織定殖方式為“裂隙進(jìn)入”，并隨著時(shí)間推移根瘤菌可在莖瘤芥根部形成一定范圍的群體密度。

自1983年，聶延富［17］使用植物生長(zhǎng)素2，4-D誘導(dǎo)小麥根部形成根瘤，這一研究打破了根瘤菌不能與非豆科植物共生固氮的障礙，人們便試圖通過(guò)人工誘導(dǎo)的方法促使非豆科植物與根瘤菌形成共生關(guān)系。此次試驗(yàn)中，選用2，4-D、氯磺隆和豆科威為試驗(yàn)誘導(dǎo)劑，依次將3種誘導(dǎo)劑稀釋為0.5、1.0、2.5 mg/L，結(jié)果表明，使用5 mL的2.5 mg/L濃度2，4-D、氯磺隆、豆科威和根瘤菌等量使用，30 d后莖瘤芥根部均可形成根瘤，60 d后類根瘤數(shù)量明顯增多，其中，60 d時(shí)2，4-D結(jié)瘤率高達(dá)93%，豆科威結(jié)瘤率為57%，氯磺隆結(jié)瘤率最低（36%），2，4-D誘導(dǎo)效率顯著高于其他2種誘導(dǎo)劑。這一現(xiàn)象表明使用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)莖瘤芥根部結(jié)瘤，不僅要考慮選用不同誘導(dǎo)劑，還要考慮各誘導(dǎo)劑的濃度和劑量問(wèn)題。選取5 mL的2.5 mg/L濃度2，4-D 處理下根部形成根瘤的莖瘤芥和對(duì)照組莖瘤芥幼苗清洗干凈，并取培養(yǎng)莖瘤芥土壤進(jìn)行固氮酶活性檢測(cè)，結(jié)果顯示，處理組和對(duì)照組有明顯差異，處理組結(jié)瘤根部和培養(yǎng)土固氮酶活性均高于對(duì)照組。說(shuō)明根瘤菌不僅可以作用于豆科植物，使其在根部形成特殊固氮結(jié)構(gòu)根瘤，還可定殖于非豆科植物莖瘤芥根部組織中，通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)到根瘤中也有根瘤菌定殖，并利用人工誘導(dǎo)的方法誘導(dǎo)非豆科植物根部形成固氮結(jié)構(gòu)根瘤，形成根瘤的幼苗及培養(yǎng)土較對(duì)照也具有較高的固氮酶活性。

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