富血小板血漿源性外泌體對肌腱干/祖細胞增殖及遷移能力的影響

李墨琳 朱亞瓊 丁雨菲 易丹 葛乃僑 陳思明 王月香

摘要：目的 探究富血小板血漿源性外泌體（PRP-Exos）對肌腱干/祖細胞（TSPC）增殖及遷移能力的影響。方法 采用聚合沉淀結合超速離心法提取PRP-Exos，采用透射電鏡和納米顆粒跟蹤分析技術鑒定其形態(tài)、濃度及粒徑，采用蛋白免疫印跡法檢測外泌體表面標志蛋白及血小板膜糖蛋白的表達水平。提取并培養(yǎng)大鼠TSPC，采用流式細胞術及免疫熒光染色檢測TSPC表面標志分子的表達情況。CCK-8法及EdU實驗評估PRP-Exos對TSPC增殖情況的影響。細胞劃痕實驗及Transwell實驗評估PRP-Exos對TSPC遷移情況的影響。結果 提取的PRP-Exos呈典型茶托狀結構，濃度為4.9×1011個/mL，平均粒徑為（132.2±56.8）nm，PRP-Exos表面表達CD9、CD63及CD41。提取的TSPC表達CD44蛋白。PRP-Exos可被TSPC攝取，共培養(yǎng)48 h時，濃度為50、100 μg/mL的PRP-Exos可顯著促進TSPC的增殖（P均＜0.001），且兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.283）；共培養(yǎng)24 h后，濃度為50 μg/mL的PRP-Exos可顯著促進TSPC的遷移（P＜0.001）。結論 體外培養(yǎng)條件下，PRP-Exos對大鼠TSPC的增殖及遷移具有顯著促進作用。

關鍵詞：富血小板血漿；外泌體；肌腱干/祖細胞；增殖；遷移；肩袖損傷

中圖分類號： R459.9；R686.5? 文獻標識碼： A? 文章編號：1000-503X（2024）03-0307-09

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15890

Effects of Platelet-Rich Plasma-Derived Exosomes on Proliferation and Migration of Tendon Stem/Progenitor Cell

LI Molin1，2，ZHU Yaqiong2，DING Yufei3，YI Dan2，GE Naiqiao1，4，CHEN Siming2，WANG Yuexiang2

1Chinese PLA Medical School，Beijing 100853，China

2Department of Ultrasound，The First Medical Center of Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China

3Department of Orthopedics，Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China

4Department of Radiology，Armed Police Corps Hospital of Jilin Province，Jilin，Jilin 130000，China

Corresponding author：WANG Yuexiang Tel：010-66935455，E-mail：wangyuexiang1999@sina.com

ABSTRACT：Objective To investigate the effects of platelet-rich plasma-derived exosomes （PRP-Exos） on the proliferation and migration of tendon stem/progenitor cell （TSPC）.Methods PRP-Exos were extracted through the combination of polymer-based precipitation and ultracentrifugation.The morphology，concentration，and particle size of PRP-Exos were identified by transmission electron microscopy and nanoparticle tracking analysis.The expression levels of surface marker proteins on PRP-Exos and platelet membrane glycoproteins were determined by Western blot analysis.Rat TSPC was extracted and cultured，and the expression of surface marker molecules on TSPC was detected using flow cytometry and immunofluorescence staining.The proliferation of TSPC influenced by PRP-Exos was evaluated using CCK-8 assay and EdU assay.The effect of PRP-Exos on the migration of TSPC was evaluated by cell scratch assay and Transwell assay.Results The extracted PRP-Exos exhibit typical saucer-like structures，with a concentration of 4.9×1011 particles/mL，an average particle size of （132.2±56.8） nm，and surface expression of CD9，CD63 and CD41.The extracted TSPC expressed the CD44 protein.PRP-Exos can be taken up by TSPC，and after co-cultured for 48 h，concentrations of 50 and 100 μg/mL of PRP-Exos significantly promoted the proliferation of TSPC （both P<0.001），with no statistical difference between the two concentrations （P=0.283）.Additionally，after co-cultured for 24 h，50 μg/mL of PRP-Exos significantly promoted the migration of TSPC （P<0.001）.Conclusion Under in vitro culture conditions，PRP-Exos significantly promote the proliferation and migration of rat TSPC.

Key words：platelet-rich plasma；exosome；tendon stem/progenitor cell；proliferation；migration；rotator cuff injury

Acta Acad Med Sin，2024，46（3）：307-315

肩袖撕裂是肩關節(jié)疼痛最常見的病因，常引發(fā)患者的慢性疼痛和功能受限，嚴重時甚至可能致殘［1］。急性肩袖損傷后，及時有效的腱骨界面重塑是良好預后的關鍵環(huán)節(jié)。肌腱干/祖細胞（tendon stem/progenitor cell，TSPC）作為重要的內(nèi)源性干細胞，在肌腱損傷后肌腱細胞的代謝及肌腱功能的維持中起著重要作用，但其增殖及遷移的效率較低［2］。近年研究發(fā)現(xiàn)干細胞外泌體可以在一定程度上影響TSPC的增殖及遷移［3］。外泌體是由各種類型細胞所分泌的雙層膜囊泡，直徑為20～150 nm，具有與親本細胞相似的功能，通過攜載大量生物效應分子發(fā)揮促組織再生及修復功能［4-5］。然而，干細胞外泌體受來源有限、體外擴增成本昂貴且易污染、干細胞老化等限制，臨床轉化存在困難［6］。因此，需要尋找合適的外泌體來源以解決干細胞來源外泌體的局限性。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是將全血經(jīng)過離心后得到的富含高濃度血小板的血漿，活化的血小板釋放多種生長因子，是誘導內(nèi)源性細胞活化并發(fā)揮修復功能的關鍵［7］。最新研究顯示，PRP激活后可釋放大量外泌體，因其富含比PRP更高水平的生長因子而受到關注。富血小板血漿源性外泌體（platelet-rich plasma-derived exosome，PRP-Exos）具有高穩(wěn)定性和低免疫原性，能夠保護其內(nèi)多種生長因子（血小板衍生生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、轉化生長因子-β等）及核酸、蛋白質(zhì)等免于降解，突破生物屏障并實現(xiàn)跨物種信息傳遞［8］。重要的是，PRP-Exos的來源廣泛，既可從自體血中提取，亦可從臨床血液輸注資源中過剩的血小板單位中獲得，據(jù)報道，不同批次之間的外泌體具有較低變異性［9］。關于PRP-Exos對TSPC增殖及遷移的影響目前尚不清楚。因此，本研究探究PRP-Exos對TSPC增殖及遷移的潛在作用，以期為肩袖損傷疾病的治療提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

4周齡SD大鼠8只購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010。低糖DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清均購自美國Gibco公司，小鼠源抗CD9、抗CD63、抗CD41抗體及辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG二抗、兔源抗CD44抗體及Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG（H+L）二抗均購自美國Proteintech公司，ExoQuick試劑盒購自美國System Biosciences公司，CD34-PE抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，CD44-APC抗體購自美國LifeSpan Biosciences公司，CD45-APC-Cy7抗體購自美國BioLegend公司，CD90-FITC抗體購自英國Abcam公司，BeyoClickTM EdU-488細胞增殖檢測試劑盒、DAPI、鬼筆環(huán)肽抗體和抗熒光淬滅封片劑購自上海碧云天生物技術有限公司，PKH67熒光染料購自北京富百科生物技術有限公司，CCK-8試劑盒和結晶紫染料購自北京百瑞極生物科技有限公司，Transwell 6孔板購自美國Corning公司，Ⅰ型膠原酶、牛凝血酶及10%氯化鈣溶液購自美國Sigma-Aldrich公司。本研究通過中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（倫理審批編號：2023-X19-32）。

1.2 PRP制備

6名健康志愿者簽署知情同意書后每人采集8 mL新鮮全血，并置于含38 g/L檸檬酸鈉的無菌管內(nèi)。采用兩步離心法提取PRP：第1次離心（400×g，10 min）去除底層的紅細胞和白細胞，將富含血小板的上清液移至新的離心管；第2次離心（800×g，10 min），收集下1/3部分即為PRP［10］，于-80 ℃冰箱內(nèi)儲存。

1.3 PRP上清液提取

采用牛凝血酶和10%氯化鈣溶液的混合液激活PRP［10］。PRP形成凝塊后回縮，并釋放大量的生長因子。經(jīng)離心后（2800×g，15 min）獲得富含大量生長因子的上清液，儲存于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)細胞實驗。

1.4 PRP-Exos制備

采用聚合沉淀結合超速離心法提取PRP-Exos［11］。首先采用ExoQuick試劑盒獲得PRP-Exos：PRP經(jīng)凝血酶處理并離心去除纖維蛋白后，將上清液移至新的無菌離心管內(nèi)，再次離心去除細胞碎片；隨后加入外泌體提取工作液，經(jīng)沉淀、離心后，底部米黃色沉淀即為PRP-Exos。為進一步去除PRP-Exos中的脂蛋白，將米黃色沉淀經(jīng)PBS重懸后，進行4 ℃超速離心（100 000×g，70 min），棄去上清液，得到的PRP-Exos沉淀儲存于-80 ℃冰箱。

1.5 PRP-Exos鑒定

1.5.1 透射電鏡觀察PRP-Exos結構形態(tài)

使用PBS將PRP-Exos重懸后，吸取15 μL的外泌體樣本滴加于銅網(wǎng)上靜置沉淀1 min，用濾紙將銅網(wǎng)上多余液體吸干，滴加15 μL 2%醋酸雙氧鈾染色液，室溫染色1 min，再次吸干多余液體，常溫干燥，采用透射電鏡在80 kV的加速電壓下觀察PRP-Exos形態(tài)。

1.5.2 納米顆粒跟蹤分析檢測PRP-Exos濃度及粒徑分布

采用ZetaView納米顆粒跟蹤分析儀檢測外泌體的濃度及粒徑分布。使用PBS將PRP-Exos重懸后，吸取1 mL加入樣本檢測池內(nèi)，采用激光光束照射樣本，收集納米顆粒的散射光信號，計算粒子濃度，并對做布朗運動的粒子進行跟蹤分析，通過二維Stokes-Einstein方程計算粒子流體力學半徑，進而推算外泌體的粒徑分布。

1.5.3 蛋白免疫印跡法檢測PRP-Exos表面標志蛋白表達

分別向PRP和PRP-Exos內(nèi)加入RIPA裂解液，超聲下進行裂解，取上清液。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白分離并轉膜。使用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入一抗CD9（1∶1000）、CD63（1∶5000）及CD41（1∶4000），4 ℃孵育過夜。孵育后TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5000）室溫孵育2 h，再次洗膜，加入適量ECL化學發(fā)光液對條帶進行曝光、顯影。

1.6 TSPC提取與培養(yǎng)

選取4周齡SD大鼠，處死后浸入75%的酒精中消毒。切除跟腱并剝離肌腱鞘膜，將肌腱組織切成碎塊，加入0.2%Ⅰ型膠原酶，于37 ℃下消化1 h。將消化后的懸浮液通過70 μm細胞過濾器，去除多余的細胞團、組織塊及雜質(zhì)，離心后用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，并接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d更換1次培養(yǎng)基，選用第3～6代細胞用于后續(xù)相關實驗。

1.7 流式細胞術檢測TSPC表面標志分子表達

采用300 μL PBS重懸TSPC，制備濃度為1×107個/mL的細胞懸液，分別加入5 μL CD34-PE、CD44-APC、CD45-APC-Cy7、CD90-FITC抗體，充分混勻后避光孵育30 min，采用流式細胞儀檢測TSPC表面標志分子的表達情況。

1.8 免疫熒光染色鑒定TSPC

將TSPC以2×104個/孔的密度接種于24孔板內(nèi)，待細胞貼壁生長后吸出培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛于4 ℃固定30 min，經(jīng)0.25% Triton X-100透化及10%山羊血清封閉處理2 h后，滴加100 μL抗CD44（1∶100），4 ℃孵育過夜；滴加熒光二抗（1∶500）室溫避光孵育2 h，DAPI染核3～5 min，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.9 TSPC對PRP-Exos的攝取

將TSPC以1×104個/孔的密度接種于12孔板內(nèi)。將PRP-Exos沉淀使用100 μL含0.4 μL原液的PKH67熒光染色液重懸，37 ℃避光孵育5 min，4 ℃避光孵育15 min，4 ℃超速離心（100 000×g，70 min），去除未結合染料。將PKH67熒光標記的PRP-Exos與TSPC共培養(yǎng)24 h后，加入4%多聚甲醛4 ℃固定15 min，對照組采用等體積PBS替代PRP-Exos。滴加100 μL鬼筆環(huán)肽抗體（1∶100），室溫避光標記細胞骨架30 min，滴加DAPI染核3～5 min，使用激光共聚焦顯微鏡觀察TSPC攝取外泌體情況。

1.10 CCK-8法檢測細胞增殖

將TSPC以4×103個/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，加入100 μL含有0、10、50、100 μg/mL PRP-Exos的完全培養(yǎng)基，分別于24、48 h更換為含10% CCK-8溶液的培養(yǎng)基孵育4 h，使用TECAN酶標儀檢測每孔在450 nm的吸光度值。

1.11 EdU實驗檢測細胞增殖

將TSPC以2×104個/孔的密度均勻接種于24孔板內(nèi)，待細胞貼壁后，分別加入1 mL含有50 μg/mL PRP上清液或PRP-Exos的完全培養(yǎng)基以及等體積PBS，培養(yǎng)48 h，加入終濃度為10 μmol/L的EdU工作液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，棄去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定15 min，0.3% Triton-X100透化15 min，每孔加入100 μL Click反應液，室溫避光孵育30 min，DAPI標記細胞核后，使用熒光顯微鏡觀察細胞的增殖情況。采用Image J軟件分別計算EdU陽性細胞的數(shù)量及DAPI標記的總細胞數(shù)量，其比值為EdU陽性增殖細胞百分率。

1.12 細胞劃痕實驗評估細胞遷移

將TSPC以5×104個/孔的密度接種于6孔板中，當貼壁細胞達90%時，使用200 μL無菌槍頭在細胞生長的中央?yún)^(qū)域劃直線，以去除部分細胞。PRP-Exos組更換含50 μg/mL PRP-Exos的新鮮無血清培養(yǎng)基，PRP組更換含相同濃度PRP上清液的無血清培養(yǎng)基，對照組為含等體積PBS的無血清培養(yǎng)基，分別于0、24 h采用倒置顯微鏡進行拍照，觀察劃痕區(qū)細胞的遷移情況。

1.13 Transwell實驗評估細胞遷移

將500 μL含TSPC細胞懸液（5×104個/孔）的無血清培養(yǎng)基均勻接種于Transwell孔板上室，另將600 μL含50 μg/mL的PRP上清液或PRP-Exos的完全培養(yǎng)基加入下室，孵育24 h后，棄去上室培養(yǎng)基，使用棉簽輕輕擦去上室上層未遷移的細胞，4%多聚甲醛固定滲透膜上的遷移細胞15 min，0.1%結晶紫溶液染色20 min，采用倒置顯微鏡觀察細胞遷移情況，采用Image J軟件計數(shù)并計算細胞相對遷移比值。

1.14 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，采用Shapiro-Wilk法進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間不同時間點的比較采用重復測量的方差分析，采用Turkey法進行組間的事后多重比較。雙側P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PRP-Exos鑒定

透射電鏡觀察顯示，PRP-Exos顆粒為圓形囊泡，呈現(xiàn)外泌體典型的茶托狀結構特征（圖1A）。納米顆粒跟蹤分析技術顯示，PRP-Exos濃度為4.9×1011個/mL，平均粒徑（132.2±56.8）nm（圖1B）。蛋白免疫印跡法結果顯示，PRP-Exos表達外泌體特異標志蛋白CD9、CD63及血小板膜糖蛋白CD41（圖1C）。

2.2 TSPC鑒定

流式細胞術檢測結果顯示，TSPC表面CD44、CD90、CD34、CD45陽性表達率分別為85.9%、93.2%、0.16%、2.39%（圖2A）。免疫熒光染色結果顯示，提取的TSPC大小均一，呈梭形或多角形，可見大量表面標志蛋白CD44表達陽性（圖2B）。

2.3 TSPC對PRP-Exos的攝取

激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，PRP-Exos組觀察到綠色熒光標記的PRP-Exos明顯聚集在TSPC的細胞核周圍，分布于呈紅色熒光信號的細胞質(zhì)內(nèi)，而對照組未見綠色熒光信號（圖3）。

2.4 PRP-Exos對TSPC增殖能力的影響

CCK-8法檢測結果顯示，共培養(yǎng)24 h后，100 μg/mL PRP-Exos組的TSPC增殖能力較0、10、50 μg/mL組增強（P＜0.001，P＜0.001，P=0.028）；共培養(yǎng)48 h后，50 、100 μg/mL PRP-Exos組的TSPC增殖能力較0、10 μg/mL組明顯增強（P均＜0.001），而50 μg/mL和100 μg/mL PRP-Exos組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.283）（圖4A），后續(xù)選擇50 μg/mL作為PRP-Exos組的最佳藥物刺激濃度。EdU實驗結果顯示，與對照組比較，PRP組和PRP-Exos組的EdU陽性細胞率均明顯增加［（27.00±2.93）%比（14.22±3.92）%，P=0.042和（40.01±9.60）%比（14.22±3.92）%，P＜0.001］；與PRP組比較，PRP-Exos組表現(xiàn)出更強的促細胞增殖作用［（40.01±9.60）%比（27.00±2.93）%，P=0.039］（圖4B）。

2.5 PRP-Exos對TSPC遷移能力的影響

細胞劃痕實驗檢測結果顯示，共培養(yǎng)24 h后，PRP、PRP-Exos、對照組的劃痕區(qū)間隙均有不同程度的縮小（圖5A）。PRP-Exos組的TSPC遷移能力較PRP組和對照組明顯增加［（53.31±7.75）%比（40.52±5.99）%；P=0.045和（53.31±7.75）%比（26.76±4.92）%；P＜0.001］（圖5B）。Transwell實驗檢測結果顯示，PRP-Exos組的細胞遷移能力較PRP組和對照組明顯增加（1.55±0.13比1.28±0.07；P=0.025和1.55±0.13比1.00±0.14；P＜0.001）（圖5C、5D）。

3 討論

肩袖損傷是重要的肌肉骨骼系統(tǒng)疾病，常導致長期疼痛和預后不良，嚴重影響患者生活質(zhì)量［12］。目前，以手術修復為主的對癥治療是臨床常用且有效的治療手段，但越來越多的證據(jù)表明，腱骨界面的愈合能力十分有限［13-14］。天然肌腱-纖維軟骨-骨的梯度結構及功能往往很難僅通過手術修補重塑，主要原因之一是肌腱損傷部位TSPC的數(shù)量及遷移能力難以支撐肩袖的再生修復。本研究成功地從健康志愿者的PRP中提取出形態(tài)良好且濃度較高的PRP-Exos，經(jīng)證實這些外泌體能夠被TSPC細胞有效攝取。體外細胞實驗結果顯示，PRP-Exos可以顯著增強TSPC的增殖及遷移能力。PRP-Exos作為一種新型的效應分子，有可能解決肩袖修復過程中TSPC功能不足的問題。

基于TSPC的干細胞療法在運動醫(yī)學領域具有獨特的發(fā)展前景。相比于受到廣泛關注的骨髓間充質(zhì)干細胞，TSPC被證實具有更強大的克隆、增殖及特殊的肌腱分化能力［15］，通過改善細胞基質(zhì)、影響血管生成和膠原蛋白合成及調(diào)控肌腱代謝微環(huán)境來修復損傷肌腱［16］。許多研究將TSPC作為種子細胞，與基于3D打印材料［2］、納米纖維材料［17］、多功能水凝膠［18］等組織工程技術相結合，在運動醫(yī)學領域取得突破性進展。然而，隨著內(nèi)源性TSPC或體外擴增過程中的細胞衰老，其發(fā)揮修復功能的表型也隨之改變，以轉錄因子Scleraxis為主的腱細胞譜系標志基因的表達逐漸降低［2］。細胞衰老不可避免地導致錯誤的干細胞分化和基質(zhì)沉積改變，包括異位骨化和纖維化，最終導致干細胞耗竭和肌腱再生失敗。因此，維持具有活性TSPC的數(shù)量及關鍵表型至關重要，亟待探索可適用于TSPC的生物活性分子。

關于PRP的臨床療效和用途目前仍存在一定的爭議，其主要原因可能涉及以下幾個方面：（1）PRP制備方法及質(zhì)量控制尚缺乏統(tǒng)一標準，這導致對比評估不同研究中PRP的再生功能及治療有效性十分困難［19］；（2）PRP療法具有個體局限性，其效果易受患者性別、年齡及自身機能水平的影響，在一定程度上限制了臨床應用［7，20］。而PRP-Exos含有較PRP更高水平的生長因子及豐富的核酸信息，具有極高穩(wěn)定性和低免疫原性，可以突破PRP自體療法的限制，實現(xiàn)跨物種治療的可能。近期研究已證實PRP-Exos具有止血、促血管生成、調(diào)節(jié)炎癥反應的能力，在再生醫(yī)學領域具有強大的潛能［9，21］。本研究探究PRP-Exos對大鼠TSPC增殖及遷移的促進作用，為肩袖疾病的治療提供了理論基礎。

組織損傷后，內(nèi)源性細胞的活化、增殖并向損傷區(qū)域趨化是介導修復的關鍵環(huán)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)PRP-Exos發(fā)揮再生作用與其參與調(diào)節(jié)細胞生長及功能有關。Tao等［22］研究發(fā)現(xiàn)PRP-Exos可逆轉糖皮質(zhì)激素處理后人微血管內(nèi)皮細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、小鼠胚胎成骨細胞的抗增殖作用，從而改善股骨頭壞死骨組織的維持與再生。Xu等［23］研究發(fā)現(xiàn)PRP-Exos可促進人永生化表皮細胞的增殖、遷移，并改善傷口愈合。此外，維持干細胞群并加強其在損傷區(qū)域的生物學行為對組織再生更為重要。現(xiàn)已證實PRP-Exos可促進骨髓間充質(zhì)干細胞、內(nèi)皮祖細胞等多種干細胞的增殖、存活及分化［24-25］。本研究結果顯示，PRP-Exos能夠顯著促進TSPC的增殖及遷移能力，且作用效果受濃度和時間的影響。共培養(yǎng)24 h后，100 μg/mL PRP-Exos組出現(xiàn)明顯的促增殖效果，而10、50 μg/mL PRP-Exos組的促增殖效果較0 μg/mL組差異無統(tǒng)計學意義；共培養(yǎng)48 h后，50、100 μg/mL PRP-Exos組較0 μg/mL組均有明顯的促增殖效果。這可能是因為短時間PRP-Exos刺激TSPC需要較高的濃度閾值，隨著培養(yǎng)時間的延長，稍低濃度的PRP-Exos也可能起到促增殖效果。此外，共培養(yǎng)48 h后，50 μg/mL和100 μg/mL兩組濃度的促增殖效果差異無統(tǒng)計學意義，提示更高濃度的PRP-Exos并不一定介導更高效的促增殖效果。其原因可能為PRP-Exos刺激能力存在濃度飽和，亦或是外泌體內(nèi)復雜的mRNA、微小RNA、蛋白質(zhì)、活性分子等改變了TSPC表型，進而對增殖能力產(chǎn)生影響。本研究選取50 μg/mL濃度用于觀察PRP-Exos對TSPC的促遷移能力，Transwell實驗和細胞劃痕實驗均顯示PRP-Exos組較PRP組表現(xiàn)出更強的促細胞遷移作用。

本研究存在一定的局限性。首先，50 μg/mL的PRP-Exos濃度僅為大致參考濃度，在后續(xù)實驗中，需要詳細設置濃度梯度來篩選最佳的刺激濃度。其次，隨培養(yǎng)時間延長，更高濃度PRP-Exos并不能進一步增強細胞的增殖效果，其原因還需要進一步探討。最后，由于外泌體內(nèi)容物的復雜性，其對TSPC生物學行為影響的復雜機制通路同樣值得探索。

綜上，本研究結果表明，PRP-Exos可顯著促進大鼠TSPC增殖及遷移能力。PRP-Exos的來源及制備極具優(yōu)勢，可為肩袖損傷的臨床治療提供新的方法。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 李墨琳：研究設計、數(shù)據(jù)搜集、起草論文及修改；朱亞瓊：研究選題、審閱文稿；丁雨菲：數(shù)據(jù)搜集和分析、對重要學術內(nèi)容做出關鍵性修訂；易丹：數(shù)據(jù)分析，修改論文；葛乃僑：數(shù)據(jù)收集及分析、對學術問題進行解答；陳思明：研究選題、論文定稿；王月香：對學術問題進行解答、同意對研究工作各方面的誠信問題負責

參 考 文 獻

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（收稿日期：2023-10-19）