多功能免疫親和柱凈化-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測咖啡豆中的11種真菌毒素

陳悅銘，黃景初，徐 婷，林 虹，蔡偉誼，鐘玉心，蘇燕瑜，陳嘉欣，胡徽詳，王 宇,,

（1.廣州市食品檢驗所，廣東廣州 511400；2.廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司，廣東中山 528437；3.廣東廚邦食品有限公司，廣東陽江 529800）

真菌毒素是霉菌在生長繁殖過程中在一定環(huán)境條件下產(chǎn)生的二級有毒代謝產(chǎn)物，這些毒素普遍具有免疫毒性、致畸毒性、致癌毒性等，危害很大[1?2]。因此，美國食藥局（FDA）、歐盟（EU）、日本檢驗檢疫等各國相關(guān)部門都頒布了食品中真菌毒素的相關(guān)規(guī)定?？Х榷怪恤髑苟舅谹（OTA）是歐盟監(jiān)管的唯一一種真菌毒素（歐盟委員會條例，EC1881/2006），限量值為5.0μg/kg[3?4]。我國對咖啡豆中的毒素監(jiān)管也僅限赭曲霉毒素A，限量值為5.0μg/kg[5]。然而，多項研究報道，咖啡豆的毒素污染存在于栽培、加工、運輸和儲存的各個環(huán)節(jié)中，包括赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、伏馬毒素、展青霉素、雜曲霉毒素等[6?10]。毒素污染是一個關(guān)系消費者健康的重要安全問題[11?16]，目前針對咖啡豆中真菌毒素的檢測方法鮮有報道，為確?？Х榷沟馁|(zhì)量安全，保障消費者身心健康，建立咖啡豆中的真菌毒素檢測方法尤為重要。

目前，針對真菌毒素的檢測方法主要包括薄層色譜法（TLC）[17]、液相色譜法（LC）[18]、熒光光譜法[19?20]、酶聯(lián)免疫法[21]、氣質(zhì)聯(lián)系用法（GC-MS）[22]、氣相色譜法（GC）[23]和液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）[24]。TLC法在確證新發(fā)現(xiàn)真菌毒素和檢測方法研究方面具有一定的優(yōu)越性，但由于精度低、操作復(fù)雜使其應(yīng)用受到限制；熒光光譜法操作簡便快速，但需要化學(xué)衍生，且易受基質(zhì)干擾；酶聯(lián)免疫法特異性強，靈敏度高，但每次只能檢測1～3種毒素，檢測通量低；GC-FID和 GC-MS技術(shù)主要應(yīng)用于測定具有熱穩(wěn)定性、揮發(fā)性以及化學(xué)衍生的非揮發(fā)性真菌毒素，因此具有一定的局限性[25]；LC和LC-MS可用于大多數(shù)真菌毒素的分析，其因穩(wěn)定可靠、靈敏度高及多組分同時檢測等特點而受到廣泛應(yīng)用。特別是超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），其專屬性強、選擇性好，靈敏度高和檢測通量大，多用于真菌毒素檢測分析領(lǐng)域。然而，我國現(xiàn)行有效的毒素檢測方法標(biāo)準共23個，其中涉及多種毒素檢測的標(biāo)準有2個，主要是針對糧油及其制品[3]，對于咖啡豆這種基質(zhì)復(fù)雜的樣品，目前并沒有相應(yīng)的檢測方法標(biāo)準。

本研究擬建立Oasis PRiME HLB串聯(lián)復(fù)合免疫親和柱-超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定咖啡豆中的11種真菌毒素，對實驗的質(zhì)譜條件、流動相、色譜柱、凈化方式等參數(shù)進行了優(yōu)化，以期建立選擇性好，靈敏度高，檢測結(jié)果準確，快速定性定量，適用于咖啡豆多種真菌毒素的日常檢測方法，為咖啡豆的質(zhì)量安全提供有力的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇 色譜純，美國Fisher Chemical公司；氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉 分析純，廣州化學(xué)試劑廠；Oasis PRiME HLB凈化小柱 美國Waters公司；Mycosep 224凈化柱 美國RomerLabs公司；11+Myco MS-PREP多功能免疫親和柱 拜發(fā)分析系統(tǒng)銷售有限公司；標(biāo)準物質(zhì) 分別購于Romer Labs、Pribolab和TRC三家公司，具體的標(biāo)物濃度見表1。

表1 標(biāo)準品信息Table 1 Standards information

Waters Xevo TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Waters公司；SQP系列電子天平 賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司；Milli-Q?Reference超純水機系統(tǒng) 法國Millipore（密理博）公司；MS3型渦旋混合器IKA?Works Guangzhou；Allegra X-30R高速離心機 貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司；2600TH超聲波清洗器 上海安譜實驗科技股份有限公司；Turbovap LV多樣品自動濃縮儀 Biotage?Co.,Ltd.。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制 提取溶液配制：乙腈-水-甲酸（85+14+1，V:V:V）；混合標(biāo)準工作液與內(nèi)標(biāo)工作液的配制：準確吸取11種毒素標(biāo)準品適量，11種毒素內(nèi)標(biāo)適量，用50%乙腈稀釋至10 mL，得到混合標(biāo)準溶液，于4℃冰箱中避光保存，具體濃度見表2。

表2 混標(biāo)工作液與內(nèi)標(biāo)工作液濃度Table 2 Concentration of working solution with the internal stand working solution

1.2.2 樣品的前處理 參照GB 5009.22-2016中的5.3.2的前處理條件進行了優(yōu)化，具體如下：

1.2.2.1 樣品提取 稱取2.0 g粉碎后的樣品，加入1 g氯化鈉于50 mL的離心管中，混勻，加入10 mL乙腈-水-甲酸（85+14+1），渦旋振蕩15 min，6000 r/min離心5 min，重復(fù)提取一次，合并提取液，取10 mL備用。

1.2.2.2 樣品凈化10 mL上清液過Oasis PRiME HLB，接凈化液加入40 mL PBS磷酸緩沖溶液（7.0±0.1）稀釋，50 mL稀釋液過多功能免疫親和柱（流速2 mL/min，或以重力自然速度通過免疫親和柱），用20 mL水洗滌柱子，加壓吹干，3.0 Ml 100%乙腈洗脫毒素（必須緩慢、穩(wěn)定），收集洗脫液，45℃氮吹至干，用1 mL 50%乙腈復(fù)溶，過0.22μm聚四氟乙烯濾膜，上LC-MS-MS分析。

1.2.3 色譜-質(zhì)譜條件

1.2.3.1 LC條件色譜柱 Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm×1.7μm）；流動相：A相：0.1%甲酸-2 mmol/L乙酸銨溶液，B相：乙腈；柱溫：40℃；進樣量：5.0μL；梯度洗脫程序：0～1.0 min,10%B；1.0～4.0 min，10%～30%B；4.0～7.0 min，30%～60%B；7.0～8.5 min，60%～100%B；8.5～10.0 min，100%～10%B。

1.2.3.2 MS條件離子源 ESI源；離子源溫度：150℃；質(zhì)譜掃描方式：多重反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），分段掃描；加熱氣溫度：600℃；脫溶劑氣：1000 L/H；11種真菌毒素及其同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件參考表3。

表3 11種真菌毒素及其同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table 3 Optimized MRM parametersfor the determination of 11 mycotoxinsand internal standard

1.3 數(shù)據(jù)處理

方法重復(fù)性及回收率試驗均做6次重復(fù)試驗，采用Excel2016進行數(shù)據(jù)整理、分析，儀器數(shù)據(jù)采集軟件為MassLynx4.1，數(shù)據(jù)分析軟件為TargetLynx3.1

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 真菌種類繁多導(dǎo)致所產(chǎn)的真菌毒素類型也多，據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同主要分為剛性共面苯環(huán)結(jié)構(gòu)（如黃曲霉毒素）、部分共面結(jié)構(gòu)（如玉米赤霉烯酮和赫曲霉毒素）以及非共面倍半萜烯結(jié)構(gòu)（如嘔吐毒素和T-2毒素）3大類[26]。本研究中的11毒素在ESI＋、ESI?離子模式下是以[M+H]+、[M+NH4]+、[M+HCOO]?、[M-H]?準分子離子峰出現(xiàn)[27]。質(zhì)譜儀的錐孔電壓和碰撞電壓對方法靈敏度和離子豐度有很大影響。為選取合適的質(zhì)譜參數(shù)，實驗通過針泵恒流方式注入1.2.1配制的標(biāo)準溶液進行分析，在ESI＋模式下考察11種真菌毒素及其內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)值，實驗選取豐度響應(yīng)高、特異性好的離子對，對11種真菌毒素及其內(nèi)標(biāo)進行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，相關(guān)參數(shù)見表3。優(yōu)化后的11種毒素及其內(nèi)標(biāo)離子流圖見圖1。

圖1 11種真菌毒素標(biāo)準溶液及其內(nèi)標(biāo)離子流圖Fig.1 TIC chromatogram of 11 mycotoxins

2.1.2 流動相條件的優(yōu)化 實驗選擇的真菌毒素理化性質(zhì)差異大，流動相對目標(biāo)物的峰型、響應(yīng)、分離度和離子化效率有較大影響。經(jīng)比較，毒素在乙腈中的響應(yīng)值比甲醇強，且乙腈的洗脫能強、粘度小，能帶來更高的柱效。因此，實驗選擇乙腈為有機相。

實驗考察了流動相A中的甲酸體積分數(shù)（0.05%、0.10%、0.20%）和乙酸銨濃度（2、5 mmoL/L）對目標(biāo)物的響應(yīng)強度的影響，各目標(biāo)物的色譜行為如圖2所示?？梢钥闯?，當(dāng)乙酸銨濃度為2 mmoL/L，甲酸濃度為0.10%時，目標(biāo)物均能出峰，且響應(yīng)值最高及靈敏度均較好。其余條件下，響應(yīng)值及靈敏度均受影響，推測原因可能是正離子模式下0.10%甲酸可以提高待測物在電噴霧中的電離，提高方法靈敏度；加入2 mmoL/L的乙酸銨，能調(diào)節(jié)溶液的離子強度，改善待測物的峰形及響應(yīng)強度，如T-2易與NH4+結(jié)合形成[M+NH4]+加合離子，質(zhì)譜響應(yīng)更穩(wěn)定[28]。甲酸濃度<0.10%或甲酸濃度>0.10%與乙酸銨濃度>2 mmoL/L都會出現(xiàn)離子抑制的作用，不利于目標(biāo)物的離子化。因此，本文選擇0.10%甲酸+2 mmoL/L乙酸銨為水相。

圖2 不同流動相對11種真菌毒素響應(yīng)強度的影響Fig.2 Effect of different flow relative to the response strength of 11 fungal toxins

2.1.3 色譜柱的選擇 實驗考察了Waters BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm×1.7μm）、Capcell core C18色譜柱（100 mm×2.1 mm×2.7μm）和Capcell core AQ色譜柱（100 mm×2.1 mm×2.0μm）3種色譜柱對11種目標(biāo)物的分離效果。結(jié)果見圖3，發(fā)現(xiàn)Capcell core C18色譜柱對伏馬毒素B1的保留較弱，響應(yīng)值較差，且對伏馬毒素B2、B3無保留；Waters BEH C18和Capcell core AQ對11種目標(biāo)物均有保留，但Waters BEH C18色譜柱是專門為擴散體積很低的 UPLC系統(tǒng)而設(shè)計的，它的填料粒徑比Capcell core AQ色譜柱小，有更高的柱效，分析11種目標(biāo)物的峰形和響應(yīng)值優(yōu)于Capcell core AQ色譜柱，對T-2毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的分離度比Capcell core AQ色譜柱好，故本實驗選擇Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm×1.7μm）色譜柱進行實驗分析。

圖3 色譜柱的優(yōu)化Fig.3 Optimization of the column

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 樣品提取液體的優(yōu)化 本實驗考察了乙腈、乙腈-水（86+14）、乙腈-水-甲酸（85+14+1）3種不同提取溶劑與提取2次、3次對咖啡豆中的11種毒素提取效果的影響，回收率結(jié)果見表4?？Х榷够|(zhì)復(fù)雜，使用純乙腈提取時，樣品中的有機酸、有機醇類物質(zhì)和脂溶性蛋白均能提取出來，PBS緩沖液稀釋上免疫親和柱時蛋白質(zhì)容易析出，造成目標(biāo)物的響應(yīng)值和回收率偏低；加入一定比例的水能增加提取溶劑對樣品的滲透性，提高目標(biāo)物的萃取效率； p H影響部分酸敏感的真菌毒素的穩(wěn)定性，為了提高毒素萃取效率，使用乙腈-水-甲酸（85+14+1）作為提取溶劑，11種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率在80.2%～114%之間，結(jié)果見表4。實驗發(fā)現(xiàn)提取2次與3次回收率無差別，為了減少前處理時間，選擇乙腈-水-甲酸（85+14+1）提取2次作為實驗條件。

表4 不同提取劑對真菌毒素的回收率Table 4 Recoveries rate of mycotoxins by different extractants

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化 咖啡豆基質(zhì)較為復(fù)雜，基質(zhì)中的干擾物與目標(biāo)物相互競爭電離或者目標(biāo)物隨基質(zhì)共流出會造成目標(biāo)物的響應(yīng)值低且重復(fù)性差[29]，選擇合適的凈化方式可以最大程度去除干擾物，降低基質(zhì)效應(yīng)。咖啡豆富含天然色素以及咖啡因、鉀、煙酸和維生素B3等生物活性物質(zhì)，只使用多功能免疫親和柱凈化時，樣品過柱效率低且容易堵柱，進行儀器分析時，因凈化效果較差，有較強的基質(zhì)效應(yīng)，回收率也較串聯(lián)雙柱凈化時差，故實驗選擇使用雙柱凈化的方式進行實驗，單獨使用多功能免疫親和柱凈化與雙柱串聯(lián)凈化的凈化效果對比見圖4。實驗比較了C18固相萃取小柱、Oasis PRiME HLB固相萃取小柱、Mycosep 224凈化柱串聯(lián)多功能免疫親和柱的凈化效果，以各毒素的加標(biāo)回收率為考察指標(biāo)（如圖5所示）。結(jié)果表明，使用C18固相萃取小柱時AFG2、ZEN、DON的回收率比較低，可能是其凈化能力有限；使用Mycosep 224凈化柱時，伏馬毒素的回收率相對較差，可能是因為Mycosep 224凈化柱填料對伏馬毒素吸附作用；Oasis PRiME HLB固相萃取小柱是一種新型的凈化小柱，凈化能力強，而且并不需要活化、淋洗和洗脫等復(fù)雜的前處理步驟，樣液只需要直接通過小柱，接凈化液就可進行下一步分析。使用Oasis PRiME HLB固相萃取小柱串聯(lián)多功能免疫親和柱凈化時，各個目標(biāo)物的響應(yīng)值均較好，回收率在80%～120%之間，效果較好，因此選擇Oasis PRiME HLB固相萃取小柱串聯(lián)多功能免疫親和柱作為凈化條件。

圖4 單柱凈化與雙柱凈化效果比較Fig.4 Comparison of single column purification and double column purification

圖5 不同凈化方式對回收率的影響（n=6）Fig.5 Recoveries of 11 mycotoxins with different purification mode (n=6)

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍與檢出限 配制11種真菌毒素的系列標(biāo)準溶液，以目標(biāo)化合物定量離子與其內(nèi)標(biāo)物峰面積之比對相應(yīng)的質(zhì)量濃度進行線性回歸，以陰性咖啡豆樣品為基質(zhì)，加入標(biāo)準溶液，以3和10倍信噪比對11種真菌毒素進行檢出限和定量限的考察，結(jié)果見表5。11種目標(biāo)物在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，決定系數(shù)（R2）>0.998，檢出限和定量限分別為0.008～0.544和0.01～1.63μg/kg，該方法線性范圍良好、檢出限低，能滿足現(xiàn)行檢測需求。

表5 11種真菌毒素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 5 Linear range,correlation coefficient,LODs and LOQs of 11 fungal toxins(n=6)

2.3.2 回收率與精密度 分別添加三水平的11種混合標(biāo)準溶液與陰性咖啡豆樣品中，進行加標(biāo)回收率試驗，平行測定6次，計算平均回收率與相對標(biāo)準偏差（RSD），結(jié)果見表6。結(jié)果表明，11種真菌毒素的平均回收率為80.2%～114%，相對標(biāo)準偏差為1.4%～7.9%。

表6 咖啡豆中11種真菌毒素的回收率及相對標(biāo)準偏差（n=6）Table 6 Recoveries and relative standard deviations of 11 fungal toxins in coffee bean (n=6)

2.4 實際樣品檢測

為了進一步驗證方法的有效性，應(yīng)用所建立的方法對市場上流通的20份咖啡豆樣品進行檢測。結(jié)果表明，1個批次的咖啡豆檢出有AFTB1，污染水平為1.1μg/kg；2個批次檢出有OTA，污染水平為6.8和5.3μg/kg，超出國家標(biāo)準限量，其余毒素未檢出。

3 結(jié)論

本研究建立了同時檢測咖啡豆中11種真菌毒素的分析方法。樣品經(jīng)乙腈-水-甲酸提取，Oasis PRiME HLB柱串聯(lián)多功能免疫親和柱凈化，氮吹、復(fù)溶后，采用多反應(yīng)（MRM）模式檢測，內(nèi)標(biāo)法定量，可以實現(xiàn)11種真菌毒素的同時檢測。本方法準確可靠，操作快速簡便，能滿足咖啡豆基質(zhì)中多種真菌毒素的檢測需求，為咖啡豆質(zhì)量安全監(jiān)管提供了技術(shù)補充，也可為其它基質(zhì)中多種真菌毒素的同時檢測提供技術(shù)支持。