柴芍六君子湯對(duì)酒精性肝損傷小鼠的治療作用及機(jī)制

白魯源 孫光碧 楊麗 王貞麗

［摘要］ 目的

探討柴芍六君子湯（CLD）治療酒精性肝損傷（alconholic liver damage， ALD）的作用及機(jī)制。

方法 雄性C57BL/6小鼠50只，隨機(jī)分為對(duì)照組（A組）、模型組（B組）、CLD低劑量組（C組）、CLD中劑量組（D組）、CLD高劑量組（E組），B～E組小鼠每天灌胃體積分?jǐn)?shù)0.56的乙醇溶液（6 g/kg），同時(shí)C～E組小鼠再分別每天灌胃2.5、5、10 g/kg CLD，A組小鼠每天灌胃相同體積生理鹽水，連續(xù)灌胃15 d，每5 d測(cè)量一次小鼠體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，留取各組小鼠新鮮糞便，梯度稀釋后平板培養(yǎng)分析糞便中腸道菌群的組成；小鼠麻醉后眼球取血檢測(cè)各組小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、γ-轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（T-BIL）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）含量；處死小鼠后剝離肝臟并計(jì)算肝臟指數(shù)；對(duì)肝組織切片行蘇木素-伊紅（HE）染色進(jìn)行病理學(xué)分析。

結(jié)果 第15天時(shí)，與B組相比，C、E組小鼠體質(zhì)量明顯升高（q=4.217～7.573，P<0.05），E組小鼠肝臟指數(shù)明顯降低（q=4.997，P<0.05）。與B組相比，C～E組小鼠血清中ALT、AST、γ-GT、ALP、T-BIL、TG的水平均呈劑量依賴性降低（q=4.705～19.790，P<0.05），血清TC水平比較無顯著差異（P＞0.05）。肝組織病理學(xué)分析結(jié)果顯示，與B組相比，C～E組小鼠肝臟病理損傷減輕。腸道菌群檢測(cè)結(jié)果顯示，與B組相比，D組和E組小鼠腸道腸桿菌、腸球菌豐度明顯降低（q=7.209～11.730，P<0.05），乳酸桿菌、雙歧桿菌的豐度明顯升高（q=4.811～23.470，P<0.05），E組小鼠腸道類桿菌豐度與B組相比顯著升高（q=4.651，P<0.05）。

結(jié)論 CLD能有效調(diào)節(jié)ALD小鼠腸道菌群，改善小鼠肝功能，對(duì)小鼠ALD具有治療作用。

［關(guān)鍵詞］ 柴芍六君子湯；肝疾病，酒精性；肝功能試驗(yàn)；胃腸道微生物組；小鼠；近交C57BL

［中圖分類號(hào)］ R575;R286.5??? ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

酒精性肝損傷（alcoholic liver damage，ALD）是由于長期大量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病，后續(xù)可發(fā)展成為肝炎、肝纖維化、肝衰竭甚至肝癌等一系列肝病，已成為人類健康的嚴(yán)重威脅之一[1-2]。因此，迫切需要尋找一種有效的治療方法，以降低ALD患者的病情進(jìn)展的速度。臨床實(shí)踐表明，腸道菌群失衡在ALD發(fā)生機(jī)制中具有重要作用[3-4]。

據(jù)《醫(yī)宗金鑒》記載，柴胡、半夏、甘草、白術(shù)、鉤藤、黨參、陳皮、白芍、茯苓等藥材為柴芍六君子湯（CLD）組方，該方劑用于健脾平肝、化痰祛風(fēng)[5]，是中國傳統(tǒng)中藥治療肝病的經(jīng)典藥方之一[6]?，F(xiàn)代中醫(yī)藥把腸道菌群的失衡當(dāng)作治療ALD的一個(gè)重要方向，但目前尚未有CLD調(diào)節(jié)腸道菌群治療ALD的報(bào)道。本研究通過觀察CLD對(duì)ALD小鼠肝臟功能的改善作用和腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，探討CLD在治療ALD方面的效果，以期能為ALD的治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠共50只，體質(zhì)量（20±2）g，購自于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（京）2022-0013，合格證編號(hào)：211002300047215；飼養(yǎng)于溫度（25±2）℃，濕度（50±10）%，12 h光暗循環(huán)環(huán)境中。

1.2 藥物與試劑

體積分?jǐn)?shù)0.56的乙醇溶液購于北京紅星股份有限公司；蘇木素-伊紅（HE）（貨號(hào)G1120）染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；柴胡、半夏、甘草、白術(shù)、鉤藤、黨參、陳皮、白芍以及茯苓購于青島大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科（批號(hào)：SYKGQDYXGS，上藥控股青島有限公司）；乙醚購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 藥物配制

柴胡、半夏、甘草、白術(shù)、鉤藤、黨參、陳皮、白芍、茯苓，按照古方比例準(zhǔn)確稱取共250 g。以上藥物冷水浸泡40 min后，武火加熱沸騰10 min后，再文火熬煮30 min，取藥液；如法再煎煮一次，合并兩次藥液后，濃縮至1 g/mL，4 ℃下保存，用前復(fù)溫至37 ℃。

1.4 動(dòng)物分組與處理

C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（A組）、模型組（B組）、CLD低、中、高劑量組（C～E組），每組10只。每日10：00，B～E組小鼠灌胃體積分?jǐn)?shù)0.56的乙醇溶液（6 g/kg）[7]，A組小鼠灌胃等量生理鹽水；每日16：00，C～E組小鼠分別灌胃2.5、5、10 g/kg CLD，A、B組小鼠灌胃等量生理鹽水。各組小鼠均連續(xù)灌胃15 d，期間觀察各組小鼠的毛色、攝食及活動(dòng)情況等，每5 d測(cè)量一次體質(zhì)量。

灌胃第15天，測(cè)量體質(zhì)量后，抓取小鼠輕輕擠壓其下腹部迫使小鼠排便，收集3～6顆糞便顆粒于無菌EP管中，4 ℃下保存?zhèn)溆?。各組小鼠乙醚麻醉后，摘除眼球取血，室溫靜置1 h以后，4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，取血清，－20 ℃保存?zhèn)溆?。隨后斷頸處死小鼠，剝離小鼠肝臟組織并測(cè)量肝臟質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)，保存肝臟備用。

1.5 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

依照試劑盒說明書操作，使用B200V全自動(dòng)生化分析儀（南京英諾華科技有限公司）檢測(cè)各組小鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、γ-轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（T-BIL）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）含量。

1.6 小鼠肝臟組織HE染色及觀察

取各組小鼠肝臟組織于4%多聚甲醛中固定72 h，依次行乙醇梯度脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片，按照試劑盒說明書對(duì)切片進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照[8]。

1.7 腸道菌群檢測(cè)

分別取各組的每只小鼠糞便0.5 g，置于裝有玻璃珠的無菌小瓶內(nèi)加0.01 mol/L PBS（pH 7.2）4.5 mL稀釋，于振蕩器上振蕩20 min，當(dāng)小鼠糞便均質(zhì)化后，配置成終濃度10 g/L的母液，設(shè)定為10-1。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用PBS對(duì)母液進(jìn)行10倍梯度稀釋，將濃度為10-3的糞便稀釋液0.1 mL接種于腸桿菌培養(yǎng)基（EMS培養(yǎng)基），10-4的糞便稀釋液0.1 mL接種于腸球菌培養(yǎng)基（疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂），10-4的糞便稀釋液0.1 mL接種于類桿菌培養(yǎng)基（BDS培養(yǎng)基），10-5的糞便稀釋液0.1 mL接種于乳酸桿菌培養(yǎng)基（LBS培養(yǎng)基），10-5的糞便稀釋液0.1 mL接種于雙歧桿菌培養(yǎng)基（BBL培養(yǎng)基）。然后將上述培養(yǎng)基分別放置于37 ℃恒溫箱中，需氧培養(yǎng)48 h或厭氧培養(yǎng)48～72 h后。用菌落形態(tài)比較、革蘭染色鏡檢等方法對(duì)所生長出的菌落進(jìn)行鑒定，確定為目標(biāo)菌后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算菌含量（CFU/g），CFU/g=每一稀釋度平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×100，結(jié)果以對(duì)數(shù)值lgCFU·g-1表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad 9.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以[AKx-D]±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)采用雙因素方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 CLD對(duì)ALD小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

灌胃期間對(duì)各組小鼠的一般情況進(jìn)行觀察，A組小鼠毛發(fā)有光澤，活動(dòng)敏捷，食欲良好；B組小鼠灌胃第5天時(shí)開始出現(xiàn)食欲不振、畏寒和毛發(fā)枯槁等情況；C～E組小鼠毛發(fā)黑亮，精神狀態(tài)與活動(dòng)均正常。重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，分組、時(shí)間、分組與時(shí)間交互對(duì)各組小鼠體質(zhì)量具有顯著影響（F時(shí)間=17.510，F(xiàn)組間=10.220，F(xiàn)交互=2.365，P<0.05）。單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，組內(nèi)比較，A、E組小鼠各時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量均無明顯差異（P＞0.05），B、C、D組小鼠第10、15天與第0、5天相比體質(zhì)量明顯降低（q=3.872～6.604，P<0.05），組間比較，第0、5天時(shí)各組小鼠體質(zhì)量無明顯差異（P＞0.05）；第10天時(shí)，B、D組與A、E組相比體質(zhì)量均明顯降低（q=6.346～6.561，P<0.05），其余各組間體質(zhì)量無明顯差異（P＞0.05）；第15天時(shí)，B、D組與A組相比體質(zhì)量明顯降低（q=5.550～7.788，P<0.05），C、E組與B組相比、E組與D組相比體質(zhì)量明顯升高（q=4.217～7.573，P<0.05），其余各組間體質(zhì)量無明顯差異（P＞0.05）。見圖1。

實(shí)驗(yàn)第15天時(shí)A～E組小鼠肝臟指數(shù)分別為4.49±0.67、5.81±1.02、5.11±0.93、4.76±0.80、4.48±0.74，各組間比較差異有顯著性（F=4.347，P<0.05）；兩兩比較結(jié)果顯示，B組與A、E組相比，小鼠肝臟指數(shù)均有明顯升高（q=4.960～4.997，P<0.05），其余各組兩兩比較均無明顯差異（P＞0.05）。

2.2 CLD對(duì)ALD小鼠肝功能的影響

各組小鼠血清當(dāng)中的ALT、AST、γ-GT、ALP、T-BIL、TG、TC水平比較差異均具有顯著性（F=5.226～138.600，P<0.05），其中與A組相比，B組小鼠血清中ALT、AST、γ-GT、ALP、T-BIL、TG水平均顯著增高（q=9.361～20.530，P<0.05），血清中TC水平比較無顯著差異（P＞0.05）。與B組相比，C～E組小鼠血清中的ALT、AST、γ-GT、ALP、T-BIL、TG的水平呈劑量依賴性降低（q=4.705～19.790，P<0.05），血清中TC水平比較無顯著差異（P＞0.05）。見表1。

2.3 CLD對(duì)ALD小鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響

HE染色結(jié)果顯示，A組肝組織肝細(xì)胞以中央靜脈為中心單行排列成板狀結(jié)構(gòu)，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，未見炎性浸潤。B組小鼠肝細(xì)胞間出現(xiàn)不規(guī)則空泡，肝竇充血，可見炎性浸潤。與B組相比，C～E組小鼠脂肪空泡和炎性浸潤明顯減少，肝竇充血明顯緩解，肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，其中E組與A組肝臟形態(tài)接近一致。見圖2。

2.4 CLD對(duì)ALD小鼠腸道菌群的影響

各組小鼠腸桿菌、腸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、類桿菌豐度比較差異均具有顯著性（F=5.059～115.400，P<0.05）；兩兩比較結(jié)果顯示，與A組相比，B組小鼠腸桿菌、腸球菌的豐度均顯著升高（q=10.870、11.190，P<0.05），乳桿菌、雙歧桿菌以及類桿菌的豐度均顯著降低（q=5.009～20.700，P<0.05）；與B組相比，D組和E組腸桿菌、腸球菌的豐度均呈劑量依賴性降低（q=7.209～11.730，P<0.05），乳酸桿菌、雙歧桿菌的豐度均呈劑量依賴性地升高（q=4.811～23.470，P<0.05），E組小鼠腸道類桿菌的豐度與B組相比顯著升高（q=4.651，P<0.05）。見表2。

3 討? 論

肝臟是人體的重要臟器，具有代謝、解毒等重要功能，肝臟損傷主要與氧化應(yīng)激、感染、微循環(huán)障礙、細(xì)胞凋亡等有關(guān)[9-10]。ALD的主要干預(yù)措施為戒酒聯(lián)合藥物治療，截至目前仍缺乏有效的防治手段。隨著ALD藥物治療的發(fā)展，越來越多的藥物應(yīng)用于臨床治療，然而藥物副作用常導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和腸道菌群紊亂，進(jìn)一步引起肝功能損傷[11]。因此，尋求新的防治藥物成為抗肝病藥物治療的關(guān)鍵。中藥復(fù)方治療肝損傷在中國已經(jīng)有上千年的歷史，近年來研究顯示，中藥復(fù)方治療ALD具有效果明顯、作用靶點(diǎn)多、副作用少等優(yōu)勢(shì)，具有保肝降酶、促進(jìn)肝細(xì)胞再生等作用[12-13]，應(yīng)用前景廣闊，是近年來研究的熱點(diǎn)之一。

CLD方劑中黨參、白術(shù)、茯苓、甘草可健脾益氣滲濕；柴胡、白芍配伍疏肝柔肝，斂陰合營；陳皮、半夏配伍降逆和胃，重在理氣[14]。研究顯示，CLD可降低慢性乙型肝炎患者血清ALT、ALP、TG、TC水平，有改善肝臟功能的效果[15-16]。王軍義[17]研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合CLD和抗病毒藥物治療慢性乙型肝炎患者，治療組總有效率大于90%。鐘銳[18]采用CLD治療慢性乙肝肝纖維化患者，相較于對(duì)照組，治療組的臨床有效率更高，肝功能指標(biāo)、細(xì)胞因子譜等各項(xiàng)生化指標(biāo)較治療前都具有明顯改善。肝臟作為酒精代謝的主要場(chǎng)所，過量的酒精攝入可導(dǎo)致肝組織損傷，肝細(xì)胞膜通透性增加，釋放AST、ALT、ALP入血，因此血液中ALT、AST、ALP水平升高是肝細(xì)胞損傷的特征性表現(xiàn)[19]。此外，肝臟也是脂質(zhì)代謝的重要器官，在TG、TC等脂質(zhì)物質(zhì)的生物合成以及脂質(zhì)的轉(zhuǎn)化與排泄等過程中發(fā)揮重要作用[20]。酒精引起肝細(xì)胞功能受損，影響線粒體脂肪酸-β氧化，血脂、脂蛋白及載脂蛋白的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝等過程紊亂，使脂肪在血液和肝細(xì)胞內(nèi)沉積，導(dǎo)致血液中TG、TC明顯升高[21]。本研究使用酒精誘導(dǎo)小鼠肝損傷后，與對(duì)照組比較，小鼠一般狀態(tài)變差，體質(zhì)量下降，肝臟功能指標(biāo)ALT、AST、ALP以及T-BIL水平均顯著增高，血脂水平指標(biāo)TG升高，肝臟組織肝細(xì)胞排列紊亂，有不規(guī)則脂肪空泡產(chǎn)生，肝血竇充血和炎性細(xì)胞浸潤，表明肝臟組織呈病理損傷狀態(tài)。CLD各劑量組與模型組比較，肝功能指標(biāo)劑量依賴性恢復(fù)正常，血脂水平降低，表明CLD對(duì)ALD具有治療作用。

腸道菌群以一定的組成規(guī)律分布在腸道，維持腸內(nèi)微生態(tài)平衡[22]。然而長期飲酒會(huì)影響腸道菌群組成和分布，且損傷腸黏膜，有益菌減少而有害菌增多，產(chǎn)生大量內(nèi)毒素等有害物質(zhì)，這些物質(zhì)隨門靜脈進(jìn)入肝臟，最終造成肝臟損傷[23-25]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，以CLD不同劑量治療后，小鼠腸道的有益菌乳酸桿菌、雙歧桿菌和類桿菌豐度顯著升高，而致病菌腸桿菌、腸球菌豐度顯著降低。說明CLD對(duì)小鼠ALD的治療作用與腸道中條件致病菌相對(duì)豐度降低及有益菌相對(duì)豐度升高有關(guān)。

基于腸道菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能多樣的特點(diǎn)，本研究只對(duì)豐度較高的腸道有益菌和有害菌的代表性物種進(jìn)行了初步分析，其他大部分菌群還有待進(jìn)一步的檢測(cè)與分析?；诟咄繙y(cè)序技術(shù)對(duì)ALD小鼠腸道菌群的深度分析，將對(duì)CLD的作用機(jī)制提供更豐富的數(shù)據(jù)支持，也是下一步的研究方向之一。

綜上，CLD可顯著改善酒精引起的小鼠肝臟功能的損傷，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)紊亂有關(guān)。本研究結(jié)果提示CLD在治療ALD上有潛在應(yīng)用價(jià)值，為中藥復(fù)方應(yīng)用于臨床防治ALD提供了新的思路和參考，值得進(jìn)一步的深入研究。

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（文件號(hào)QDU-AEC-202401-1）。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵照科技部《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行。

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