細(xì)胞外基質(zhì)硬度對人前列腺癌細(xì)胞可塑性調(diào)控作用的研究

鄭雨 馬磊 李睿智 牟潔 李菁 王棟 祝海

［摘要］ 目的

探討細(xì)胞外基質(zhì)硬度對人前列腺癌細(xì)胞LNCaP可塑性調(diào)控的作用。

方法 將人LNCaP細(xì)胞分別于楊氏模量為3 GPa（A組）、20 kPa（B組）、6 kPa（C組）和1 kPa（D組）四種不同硬度細(xì)胞外基質(zhì)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)1周。采用明場顯微鏡及熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞在不同硬度基底上的形態(tài)；采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）技術(shù)檢測各組細(xì)胞的管腔細(xì)胞標(biāo)志物基因AR、CK8、CK18、PSA，基底細(xì)胞標(biāo)志物基因CK5、P63，以及增殖基因KI67、PCNA的表達(dá)水平。

結(jié)果 明場顯微鏡及熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，A組人LNCaP細(xì)胞呈現(xiàn)典型鋪展上皮細(xì)胞形態(tài)，而B～D組均呈現(xiàn)團(tuán)聚小細(xì)胞片狀態(tài)，且D組細(xì)胞形成了三維類器官結(jié)構(gòu)。RT-qPCR結(jié)果顯示，四組人LNCaP細(xì)胞中KI67、P63基因表達(dá)水平無顯著差異（P＞0.05）；B組PCNA基因表達(dá)水平顯著高于A、C組（F=34.96，t=8.39、6.37，P＜0.05）；B組CK5基因表達(dá)水平顯著高于其他三組（F=29.35，t=4.46～6.73，P＜0.05）；D組AR、CK8、CK18、PSA基因表達(dá)水平顯著高于其他三組（F=13.66～56.43，t=3.03～11.51，P＜0.05）。

結(jié)論 硬度較低（楊氏模量1 kPa）的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境能較好維持人LNCaP細(xì)胞的管腔細(xì)胞特征，而硬度較高（楊氏模量20 kPa）的細(xì)胞外基質(zhì)能使人LNCaP細(xì)胞呈現(xiàn)出中間態(tài)細(xì)胞表型，或許是導(dǎo)致前列腺癌發(fā)生的因素之一。

［關(guān)鍵詞］ 前列腺腫瘤；細(xì)胞系，腫瘤；細(xì)胞外基質(zhì)；細(xì)胞可塑性

［中圖分類號］ R737.25;R329.24??? ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

前列腺癌發(fā)生發(fā)展的過程中往往伴隨著癌細(xì)胞可塑性的變化。細(xì)胞可塑性是指一種類型的細(xì)胞變成另一種類型細(xì)胞的過程[1]。癌細(xì)胞的可塑性特性可使前列腺癌細(xì)胞逃避靶向藥物作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活，與腫瘤侵襲性增加密切相關(guān)，給臨床腫瘤治療增加極大難度[2]。細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤早期或中期微環(huán)境發(fā)生改變的因素之一，可影響細(xì)胞的行為和表型[3]，與實(shí)體腫瘤的發(fā)生有著緊密的聯(lián)系[4]。實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展往往同時(shí)伴隨著腫瘤硬度的增加[5]。細(xì)胞外基質(zhì)的成分和生物力學(xué)性質(zhì)的改變可為前列腺癌細(xì)胞創(chuàng)造適當(dāng)?shù)纳L條件，從而促進(jìn)前列腺癌發(fā)展及癌細(xì)胞的侵襲性和耐藥性[6]。目前國內(nèi)外有關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)對前列腺癌細(xì)胞可塑性影響的研究較少，本研究在實(shí)驗(yàn)室前期建立的細(xì)胞外基質(zhì)硬度可調(diào)的基礎(chǔ)上，探究細(xì)胞外基質(zhì)硬度對人前列腺細(xì)胞LNCaP的可塑性調(diào)控作用，以求為控制前列腺癌進(jìn)展提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人LNCaP細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)基1640、胎牛血清、PBS磷酸緩沖液均購自武漢普諾賽生命科技有限公司，青霉素、鏈霉素、兩性霉素B溶液的三抗溶液購自上海生物科技股份有限公司，胰蛋白酶購自青島艾菲特生工生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑及其試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司，Trizol試劑、Nanodrop儀購自美國Thermo Fisher科技有限公司，OCT包埋劑、倒置熒光顯微鏡購自美國賽默飛世爾科技有限公司，DAPI熒光染料購自北京索萊寶生物科技有限公司，電動(dòng)明場顯微鏡購自日本Nikon公司，4%多聚甲醛固定液購自武漢卡諾斯科技有限公司，蔗糖購自上海阿拉丁生化科技有限公司，實(shí)驗(yàn)用離心管、培養(yǎng)皿和槍頭耗材購自上海依科賽生物技術(shù)有限公司。

1.2 人LNCaP細(xì)胞的分組與培養(yǎng)

將實(shí)驗(yàn)室前期配制好的細(xì)胞外基質(zhì)溶液[7]倒入培養(yǎng)皿中孵育1 h，用PBS磷酸緩沖液清洗普通聚苯乙烯培養(yǎng)皿基底（楊氏模量約為3 GPa）作為A組，將不同容量的細(xì)胞外基質(zhì)溶液倒入培養(yǎng)皿中，置于無菌干燥盒中37 ℃干燥48～72 h，得到楊氏模量約為20 kPa（B組）、6 kPa（C組）和1 kPa（D組）的胞外基質(zhì)基底。將人LNCaP細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、溫度36～37 ℃、濕度95%的環(huán)境下培養(yǎng)7 d后，在電動(dòng)明場顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞鋪占整個(gè)培養(yǎng)皿約80%的面積時(shí)，用質(zhì)量濃度2.5 g/L的胰蛋白酶將大片狀細(xì)胞完全消化后，移至脫落細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行計(jì)數(shù)。分別取約3×105個(gè)細(xì)胞量種植于上述四組細(xì)胞外基質(zhì)基底上進(jìn)行培養(yǎng)，四組細(xì)胞每天更換相應(yīng)培養(yǎng)基5 mL，培養(yǎng)環(huán)境同前，培養(yǎng)7 d后備用。

1.3 顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)

使用電動(dòng)明場顯微鏡觀察1.2中各組細(xì)胞形態(tài)并拍照。用4%多聚甲醛固定四組細(xì)胞30 min，每組細(xì)胞均依次浸沒于質(zhì)量濃度150、300 g/L的蔗糖溶液中各24 h進(jìn)行脫水處理，隨后包埋于OCT包埋劑中進(jìn)行冰凍切片。加入DAPI熒光染料染色30 min后封片，隨后進(jìn)行熒光顯微鏡觀察拍照。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測各組細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平

取1.2中各組細(xì)胞，每組各取部分使用Trizol試劑提取人LNCaP細(xì)胞總RNA，使用Nanodrop儀測定RNA濃度與純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用RT-qPCR法檢測各組細(xì)胞中管腔細(xì)胞標(biāo)志物基因AR、CK8、CK18、PSA，基底細(xì)胞標(biāo)志物基因CK5、P63，以及增殖基因KI67、PCNA表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參，引物名稱及其序列見表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 8.0.2軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以[AKx-D]±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 四組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)比較

電動(dòng)明場顯微鏡及熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，A組人LNCaP細(xì)胞鋪展良好，呈現(xiàn)典型的單層上皮細(xì)胞形態(tài)，B～D組中人LNCaP細(xì)胞以團(tuán)聚的小細(xì)胞片形式生長，且D組人LNCaP細(xì)胞生長為三維類器官結(jié)構(gòu)。見圖1、2。

2.2 四組細(xì)胞中管腔細(xì)胞標(biāo)志物、基底細(xì)胞標(biāo)志物及增殖基因表達(dá)水平比較

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，B組細(xì)胞增殖基因PCNA表達(dá)水平顯著高于A、C組（F=34.96，t=8.39、6.37，P＜0.05），增殖基因KI67表達(dá)水平四組間無顯著差異（P＞0.05）；D組管腔細(xì)胞標(biāo)志物基因AR、CK18、CK8、PSA表達(dá)水平顯著高于其他三組（F=13.66～56.43，t=3.03～11.51，P＜0.05）；B組基底細(xì)胞標(biāo)志物基因CK5表達(dá)水平顯著高于其他三組（F=29.35，t=4.46～6.73，P＜0.05），而基底細(xì)胞標(biāo)志物基因P63表達(dá)水平四組間無顯著差異（P＞0.05）。見表1。

3 討? 論

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為細(xì)胞外基質(zhì)只是一個(gè)簡單的組織細(xì)胞支持結(jié)構(gòu)，但隨著研究的不斷深入，細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和功能多樣性被逐漸認(rèn)識[8-9]。細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境，且直接參與細(xì)胞間的力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)、信息傳遞、調(diào)節(jié)干細(xì)胞行為等一系列生物學(xué)活動(dòng)[10-11]。癌細(xì)胞的增殖、存活及其侵襲能力也在很大程度上依賴于腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)[12]，反之癌細(xì)胞也可重塑胞外基質(zhì)，兩者相互作用從而導(dǎo)致腫瘤的生長、擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移[13-14]。不同硬度的細(xì)胞外基質(zhì)可以調(diào)節(jié)腫瘤的基因型和表型，誘導(dǎo)癌細(xì)胞表型變化[15]。腫瘤轉(zhuǎn)移的基本特征包括侵襲性、可塑性、微環(huán)境調(diào)節(jié)能力及在侵襲組織中定殖能力，這些特征都與細(xì)胞外基質(zhì)的性質(zhì)（組成、密度和硬度等）緊密相關(guān)[16-17]。

大多數(shù)前列腺癌細(xì)胞屬于管腔細(xì)胞類型，其管腔細(xì)胞標(biāo)志物AR和PSA基因表達(dá)水平較高[18]。本研究選擇人LNCaP細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，原因?yàn)長NCaP細(xì)胞系具有較為明顯的上皮細(xì)胞特性，細(xì)胞分裂速度較快[19]，對雄激素較敏感[20]，且表達(dá)管腔細(xì)胞的關(guān)鍵生物標(biāo)志物基因AR、PSA等，這些特點(diǎn)使其廣泛應(yīng)用于前列腺癌的研究。本研究結(jié)果顯示，不同硬度的細(xì)胞外基質(zhì)能夠影響人LNCaP細(xì)胞形態(tài)，人LNCaP細(xì)胞在軟基底上較易團(tuán)聚成小細(xì)胞片，尤其是在D組基底（楊氏模量1 kPa）上形成三維類器官球狀結(jié)構(gòu)，而在較硬的A組基質(zhì)（楊氏模量3 GPa）上鋪展良好，形成緊密的單層上皮細(xì)胞層，這意味著硬基底可能促進(jìn)人LNCaP細(xì)胞的相互連接和遷移。

本研究針對人LNCaP細(xì)胞增殖能力，檢測了細(xì)胞中兩種增殖標(biāo)志物基因KI67和PCNA，結(jié)果顯示B組（楊氏模量20 kPa）PCNA表達(dá)水平顯著高于A、C組（楊氏模量3、6 kPa），而另一種增殖基因KI67表達(dá)水平四組間無顯著差異。該結(jié)果表明細(xì)胞外基質(zhì)硬度對于腫瘤細(xì)胞增殖能力的調(diào)節(jié)可能是非線性的，即在某些特定細(xì)胞外基質(zhì)硬度范圍內(nèi)，腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)才隨硬度增高而上調(diào)，該結(jié)果有待后續(xù)深入研究。

腫瘤細(xì)胞的可塑性是近年來前列腺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。本研究結(jié)果顯示，D組細(xì)胞的管腔細(xì)胞標(biāo)志物AR、CK8、CK18、PSA表達(dá)最高，表明軟細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境更有利于管腔細(xì)胞的表型維持和生長。另外，B組細(xì)胞的基底細(xì)胞標(biāo)志物CK5表達(dá)水平顯著高于其他三組，該結(jié)果表明基底軟硬程度可調(diào)節(jié)LNCaP細(xì)胞的可塑性。在B組細(xì)胞外基質(zhì)中，人LNCaP細(xì)胞同時(shí)具備管腔細(xì)胞和基底細(xì)胞的特征，呈現(xiàn)出中間態(tài)細(xì)胞的特征。中間態(tài)細(xì)胞是人胚胎發(fā)育過程中短暫出現(xiàn)的一種細(xì)胞類型，在成人前列腺組織中數(shù)量減少，中間態(tài)細(xì)胞可能是前列腺癌的重要細(xì)胞來源。本研究結(jié)果提示細(xì)胞外基質(zhì)硬度的增強(qiáng)可能在前列腺癌中間態(tài)細(xì)胞形成的調(diào)控中發(fā)揮作用。

另外，本研究具有一定的局限性，如體外實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)真實(shí)情況具有一定差異。本研究所利用的體外模型是基于不同厚度的細(xì)胞外基質(zhì)所呈現(xiàn)硬度（楊氏模量）的不同[21-22]，然而體內(nèi)影響細(xì)胞外基質(zhì)的腫瘤微環(huán)境更為復(fù)雜，如細(xì)胞外基質(zhì)的重排、交聯(lián)、沉積及特定細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解等[23-24]，另外體內(nèi)外細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白成分也有一定差異[25]。上述差異是本研究難以模擬的部分，有待后續(xù)研究進(jìn)一步改進(jìn)。

本研究比較了四種不同硬度的細(xì)胞外基質(zhì)對人LNCaP細(xì)胞的可塑性影響，發(fā)現(xiàn)硬度較低（楊氏模量1 kPa）的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境能較好維持前列腺細(xì)胞的管腔細(xì)胞特征，而硬度較高（楊氏模量20 kPa）的細(xì)胞外基質(zhì)能使人LNCaP細(xì)胞呈現(xiàn)出中間態(tài)細(xì)胞表型，或許是導(dǎo)致前列腺癌發(fā)生的因素之一。

［參考文獻(xiàn)］

[1]SHENOY S. Cell plasticity in cancer： A complex interplay of genetic， epigenetic mechanisms and tumor micro-environment[J]. Surg Oncol， 2020，34：154-162.

[2]YAM G H， PEH G S， SINGHAL S， et al. Dental stem cells： A future asset of ocular cell therapy[J]. Expert Rev Mol Med， 2015，17：e20.

[3]KARAMANOS N K， THEOCHARIS A D， PIPERIGKOU Z， et al. A guide to the composition and functions of the extracellular matrix[J]. FEBS J， 2021，288（24）：6850-6912.

[4]EMON B， BAUER J， JAIN Y， et al. Biophysics of tumor microenvironment and cancer metastasis——A mini review[J]. Comput Struct Biotechnol J， 2018，16：279-287.

[5]HAYWARD M K， MUNCIE J M， WEAVER V M. Tissue mechanics in stem cell fate， development， and cancer[J]. Dev Cell， 2021，56（13）：1833-1847.

[6]KANG J N， MANNA F L， BONOLLO F， et al. Tumor microenvironment mechanisms and bone metastatic disease progression of prostate cancer[J]. Cancer Lett， 2022，530：156-169.

[7]YU Y L， LENG Y， SONG X Y， et al. Extracellular matrix stiffness regulates microvascular stability by controlling endothelial paracrine signaling to determine pericyte fate[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2023，43（10）：1887-1899.

[8]PANG B R， ZHU Y， NI J， et al. Extracellular vesicles： The next generation of biomarkers for liquid biopsy-based prostate cancer diagnosis[J]. Theranostics， 2020，10（5）：2309-2326.

[9]SEIM I， JEFFERY P L， THOMAS P B， et al. Whole-genome sequence of the metastatic PC3 and LNCaP human prostate cancer cell lines[J]. G3， 2017，7（6）：1731-1741.

[10]BARTZ R， ZHOU J， HSIEH J T， et al. Caveolin-1 secreting LNCaP cells induce tumor growth of caveolin-1 negative LNCaP cells in vivo[J]. Int J Cancer， 2008，122（3）：520-525.

[11]LI L， HE M Z， TANG X M， et al. Proteomic landscape of the extracellular matrix in the fibrotic kidney[J]. Kidney Int， 2023，103（6）：1063-1076.

[12]ARWERT E N， HOSTE E， WATT F M. Epithelial stem cells， wound healing and cancer[J]. Nat Rev Cancer， 2012，12（3）：170-180.

[13]LI Z H， LEI L， FEI L R， et al. TRIP13 promotes the proliferation and invasion of lung cancer cells via the Wnt signaling pathway and epithelial-mesenchymal transition[J]. J Mol Histol， 2021，52（1）：11-20.

[14]SHEN J M， SUN C， WANG Z C， et al. Sequential receptor-mediated mixed-charge nanomedicine to target pancreatic cancer， inducing immunogenic cell death and reshaping the tumor microenvironment[J]. Int J Pharm， 2021，601：120553.

[15]STANTON A E， TONG X M， YANG F. Extracellular matrix type modulates mechanotransduction of stem cells[J]. Acta Biomater， 2019，96：310-320.

[16]PANDEY N， ANASTASIADIS P， CARNEY C P， et al. Nanotherapeutic treatment of the invasive glioblastoma tumor [JP2]microenvironment[J]. Adv Drug Deliv Rev， 2022，188：114415.

[17]YAMADA K M， SIXT M. Mechanisms of 3D cell migration[J]. Nat Rev Mol Cell Biol， 2019，20（12）：738-752.

[18]CHAUDHURI O， KOSHY S T， BRANCO DA CUNHA C， et al. Extracellular matrix stiffness and composition jointly regulate the induction of malignant phenotypes in mammary epithelium[J]. Nat Mater， 2014，13（10）：970-978.

[19]KATARA G K， KULSHRESTHA A， MAO L Q， et al. Mammary epithelium-specific inactivation of V-ATPase reduces stiffness of extracellular matrix and enhances metastasis of breast cancer[J]. Mol Oncol， 2018，12（2）：208-223.

[20]GKRETSI V， STYLIANOPOULOS T. Cell adhesion and matrix stiffness： Coordinating cancer cell invasion and metastasis[J]. Front Oncol， 2018，8：145.

[21]LIU Y Y， LV J D， LIANG X Y， et al. Fibrin stiffness mediates dormancy of tumor-repopulating cells via a Cdc42-driven Tet2 epigenetic program[J]. Cancer Res， 2018，78（14）：3926-3937.

[22]TOROK N J. P300， a new player in mechanosensitivity and activation of cancer-associated fibroblasts[J]. Gastroenterology， 2018，154（8）：2025-2026.

[23]WONG H Y， SHENG Q H， HESTERBERG A B， et al. Single cell analysis of cribriform prostate cancer reveals cell intrinsic and tumor microenvironmental pathways of aggressive disease[J]. Nat Commun， 2022，13（1）：6036.

[24]SAMARIJA I， KONJEVODA P. Extracellular matrix- and integrin adhesion complexes-related genes in the prognosis of prostate cancer patients' progression-free survival[J]. Biomedicines， 2023，11（7）：2006.

[25]SUCKOW M A， HILES M C. Use of conditioned extracellular matrix as a tissue-engineered tumor matrisome for prostate cancer and melanoma immunotherapy[J]. Anticancer Res， 2023，43（1）：335-341.